专利名称：一种两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置。是用电渗泵驱动毛细管内的聚焦区带，使其经过检测窗口完成检测。主要适用于蛋白质等两性物质的等电聚焦分离。
背景技术：
等电聚焦作为毛细管电泳分离分析的一种模式，广泛应用于具有不同等电点的蛋白质混合物样品的分离。等电聚焦分为两种形式一步法和两步法。一步法也称之为动态聚焦法，它是利用pH梯度和电渗的共同作用，使区带在聚焦中迁移或在迁移中聚焦。两步法是将等电聚焦分离中聚焦过程和迁移过程分别进行。两步法较之一步法具有更高的检测灵敏度、分离效率和更好的重现性，因此被更为广泛地应用。为了迁移聚焦区带，Hjertén等人提出了一系列方法，他们在聚焦完成之后通过改变阴极或阳极缓冲液的pH值而使聚焦区带迁移，(Zhu M，Hjertén S.U.S.Patent 4,725,343，Feb.16，1988)包括将阴极的碱替换为酸或将阳极的酸替换为碱；在阳极(或阴极)电解液中加入盐。(Hjertén S.U.S.Patent 4,911,808，Mar.27，1990)之后，Rodriguez等人用两性离子代替盐来迁移区带。(Rodriguez R，Wehr T，Zhu M.U.S.Patent 5,110,434，May 05，1992)他们用pI3.22的两性离子代替盐，使酸性蛋白得到更好的分离效果，用pI6.9的两性离子代替盐，提高了中性和碱性蛋白的分离能力。(Zhu M，RodriguezR，Wehr T.J Chromatogr.，1991，559479-488)这种在阳极(或阴极)电解液中加入盐或两性离子，在直流电场作用下，使聚焦区带向检测窗口方向迁移的方法称为化学迁移。然而，化学迁移，无论是用盐或两性离子，均不能提供线性pH梯度，不利于pI值的测定。1994年，Herrick等人发明了一种能够控制电渗流(EOF)并且能迁移聚焦区带的等电聚焦实验装置。(Herrick S S，Sternberg J C.U.S.Patent 5,282,942，Feb.01，1994)他们在毛细管外加上导电部件，通过控制外部电场实现聚焦时毛细管内EOF的调节及聚焦完成后区带的迁移。但此方法并未得到广泛地应用。压差迁移是采用恒定的流体力学流动，真空或低压推动，使聚焦区带迁移。而压差迁移(一般用N2)需辅助设备，实验装置较为复杂，连接到毛细管上也比较麻烦。(Liu X，Sosic Z，Krull I S.J Chromatogr.A，1996，735165-190)这在一定程度上阻碍了两步法等电聚焦分离方法的发展和应用。因此，寻找一种装置简单且易于控制的迁移区带方法，对毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质具有一定的实用意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置，可以方便精确地通过控制电渗泵电压调节输出流量来调节迁移聚焦区带的速度，装置简单，适用于毛细管电泳等电聚焦两步法分离蛋白质等两性物质。
为实现上述目的，本发明的工作原理是通过施加高压电场，将待分离蛋白质样品在分离毛细管内等电聚焦后，用电渗泵将聚焦区带缓慢迁移经过检测窗口完成检测。
根据上述原理，本发明提供的两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置，主要包括一微型四通，分别连接微流量电渗泵、等电聚焦分离毛细管、阳极缓冲溶液储液管(即聚焦高压电源正极)和进样口。
其中等电聚焦分离毛细管较理想的是消除了电渗的有内涂层的石英毛细管，较理想的内径为50-100μm。其一端插入至阴极缓冲溶液池中，另一端通过设置在微型四通内装满阳极缓冲溶液的储液管而与阳极缓冲溶液池相连接。该毛细管在微型四通与阴极缓冲溶液池之间经过一柱上紫外-可见毛细管电泳检测器的检测窗口。
一高压直流电源，为高稳定电源，较理想的电压是5KV-30KV，其阴极连接至阴极缓冲溶液池，阳极连接至阳极缓冲溶液池，使等电聚焦分离毛细管的两端形成高压电场。
微型四通与微流量电渗泵之间通过一输液导管连接，该微流量电渗泵较理想为内径250-530μm的填充通道电渗泵，由100-1000V的低压直流高稳定电源驱动，通过控制该电压来调节流体的输出压强和流量。
待测样品由微型四通的进样口注入至等电聚焦分离毛细管中，在由高压直流电源形成的高压电场作用下完成等电聚焦分离，控制微流量电渗泵的电压调节流体的输出压强和流量，对等电聚焦毛细管中已聚焦好的区带进行迁移，使聚焦区带经过检测窗口，用柱上紫外-可见毛细管电泳检测器实现检测。
图1为本发明的装置示意图。
图中1-微流量电渗输液泵；11-输液导管；12-低压直流电源；2-微型四通；21-进样口；22-阳极缓冲溶液储液管；3-等电聚焦分离毛细管；31-阴极缓冲溶液池；32-阳极缓冲溶液池；33-检测窗口；4-柱上紫外-可见毛细管电泳检测器；5-高压直流电源；51-高压直流电源接地端；52-高压直流电源正极端。
具体实施例方式
本发明提供的两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质装置的结构参见图1。一微型四通2，分别连接微流量电渗泵1、等电聚焦分离毛细管3、阳极缓冲溶液储液管22和进样口21。
其中等电聚焦分离毛细管3较理想的是消除了电渗的有内涂层的石英毛细管，该毛细管的一端插入至阴极缓冲溶液池31中，另一端通过设置在微型四通2内的阳极缓冲溶液储液管22而与阳极缓冲溶液池32相连接，阳极缓冲溶液储液管22内部装满了阳极缓冲溶液。该毛细管3在微型四通1与阴极缓冲溶液池31之间经过一柱上紫外-可见毛细管电泳检测器4的检测窗口33。
一高压直流电源5，为高稳定电源，其阴极51连接至阴极缓冲溶液池31，阳极52连接至阳极缓冲溶液池32。等电聚焦分离毛细管3通过阳极缓冲溶液储液管22中的阳极缓冲溶液与阳极缓冲溶液池32相连接。使等电聚焦分离毛细管3两端形成高压电场，而等电聚焦分离毛细管3中的样品就处在高压电场下完成等电聚焦分离。
微型四通2与微流量电渗泵1之间通过一输液导管11连接。微流量电渗泵1通过控制低压直流电源12的电压来调节输液导管11中流体的输出压强和流量。
等电聚焦分离毛细管3中的样品在高压电场的作用下完成等电聚焦分离后，开启微流量电渗输液泵1，通过输液导管11将所输送液体导出，从微型四通2的一端进入等电聚焦分离毛细管3中，通过控制微流量电渗输液泵1的电压12来调节流体的输出压强和流量，对等电聚焦分离毛细管3中已聚焦好的区带进行迁移，使聚焦区带按控制的速度经过检测窗口33，利用柱上紫外-可见毛细管电泳检测器4实现检测。
利用上述装置，下面列举一分离溶菌酶和牛血清蛋白的实施例来帮助理解本发明。
在列举实施例之前，需要说明的是，在前述发明内容部分列出的条件是实现本发明较理想的条件，而不是限制实现本发明的条件。这点很容易被本领域的技术人员理解并掌握。因此，为简明扼要起见，只列举一个具有代表性的实施例。但该实施例不能用来限定本发明的权利要求范围。
本实施例所用的等电聚焦分离毛细管为二甲基聚硅氧烷涂层毛细管，膜厚0.06μm，内径100μm，柱长50cm，有效长度42.5cm。阴极缓冲溶液为20mMNaOH的0.2％甲基纤维素(MC)溶液，阳极缓冲溶液为120mM H3PO4的0.2％MC溶液。聚焦电压10kV；所用电渗泵的结构为两根5cm×530μm柱并联，内填5μm二氧化硅(SiO2)；输送液体为甲醇/水＝30/70；泵驱动电压为600V。柱上紫外-可见毛细管电泳检测器的检测波长为280nm。取得了很好的分离效果。
权利要求
1.一种两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置，主要包括一微型四通，分别连接微流量电渗泵、等电聚焦分离毛细管、阳极缓冲溶液储液管和进样口；其中等电聚焦分离毛细管一端插入至阴极缓冲溶液池中，另一端通过设置在微型四通内的阳极缓冲溶液储液管而与阳极缓冲溶液池相连接；在微型四通与阴极缓冲溶液池之间经过一柱上紫外-可见毛细管电泳检测器的检测窗口；一高压直流电源，为5KV-30KV，其阴极连接至阴极缓冲溶液池，阳极连接至阳极缓冲溶液池，使等电聚焦分离毛细管的两端形成高压电场；微型四通与微流量电渗泵之间通过一输液导管连接，该微流量电渗泵由100-1000V的低压直流高稳定电源驱动，通过控制该电压来调节流体的输出压强和流量；待测样品由微型四通的进样口注入至等电聚焦分离毛细管中，在由高压直流电源形成的高压电场作用下完成等电聚焦分离，控制微流量电渗泵的电压调节流体的输出压强和流量，对等电聚焦毛细管中已聚焦好的区带进行迁移，使聚焦区带经过检测窗口，用柱上紫外-可见毛细管电泳检测器实现检测。
2.由权利要求1所述的装置，其特征在于，所述微流量电渗泵为内径为250-530μm的填充通道电渗泵。
3.由权利要求1所述的装置，其特征在于，所述等电聚焦分离毛细管是消除了电渗的有内涂层的石英毛细管，内径为50-100μm。
4.由权利要求1所述的装置，其特征在于，所述高压和低压直流电源为高稳定电源。
全文摘要
一种简易的两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的装置，主要包括微流量电渗泵、等电聚焦分离毛细管、微型四通、柱上紫外－可见(UV－Vis)电泳检测器、高压和低压直流电源；装置中采用一个微型四通，用来分另连接电渗泵、等电聚焦分离毛细管、阳极缓冲溶液(聚焦高压电源正极)和进样口。
文档编号C07K1/26GK1590402SQ0315568
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月3日 优先权日2003年9月3日
发明者关亚风, 陈令新, 舒馨, 马继平, 王海龙 申请人:中国科学院大连化学物理研究所