专利名称：用于检测男性不育的检测剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测男性不育的检测剂和试剂盒、所述检测剂和试剂盒在检测 DAZ基因家族缺失的用途、以及一种检测DAZ基因家族缺失的方法。
背景技术：
近年来，不育症患者日益增多。世界卫生组织预测，在21世纪，不育症将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病。据统计，全世界共有6000万 8000万对夫妇有不育症，而在我国约10% 15%夫妇不能生育，其中男性因素占40% 50%，而且在工业发达、人口稠密的城市高于农村。Y染色体上的微小缺失可以造成生精障碍，导致无精症或严重少精子症。研究发现 Y染色体长臂的5 6区间有一个与精子生成有关的区域，称为无精子因子(Azoospermia factor，下文简称为“AZF”)，AZF被分成3个与生育相关的功能区，a区、b区和c区。研究发现，c区的微缺失率远高于a和b区，并且约占Y染色体微缺失的60 %左右。所以 AZF c区缺失常作为原发性无精子症和严重少精子症患者的主要筛查基因。而DAZ基因 (deleted in azoospermia，下文简称为“DAZ”)则是AZF c区的最佳候选基因，AZF c区的缺失几乎均累及到DAZ基因，并造成DAZ基因家族的缺失(S. Fernandes, K. Huellen, J.Goncalves, et al. High frequency of DAZl/DAZ2gene deletions in patientswith severe oligozoospermia[J]. Molecular Human Reproduction,2002,8(3) :286-298.)。DAZ基因家族定位于染色体Yqll. 2，多数具有4个基因拷贝(DAZ 1 4)，分成两簇(DAZ 1/2, DAZ3/4) (DAZlGenbank 登录号为1617 ；DAZ2 Genbank 登录号为57055 ； DADGenbank登录号为570 ;DAZ4Genbank登录号为571；35)，位于Y染色体AZF c区的扩展子rl r4内，以头对头的形式排在一起。有研究表明DAZ 1/2和DAZ 3/4基因拷贝的缺失在生精过程中起的作用存在差异。DAZ 1/2基因拷贝的缺失是生精障碍的高风险因子，而DAZ 3/4基因拷贝的缺失在生精过程中起的作用相对比较微弱(G Letizia D Amico, Daniela DI Benedetto, Franca MPezzino, et al. Quantitative evaluation of partial deletionsof the DAZ gene cluster [J].International Journal of MolecularMedicine，2006，17 :785-789.)。并且在发生缺失时，DAZl 和 DAZ2 同时缺失，尚未发现其中一个单独缺失的情况。DAZ 3和DAZ 4也存在类似的情形。目前，关于DAZ基因家族缺失的检测，最常用的是STS-PCR方法(阿周存，杨元等严重寡精症ICSI精子供体的DAZ基因拷贝缺失研究遗传HEREDITAS(BeijingU8(9) 1057-1060，2006)，近年来，有往更高灵敏度的定量PCR检测方法发展的趋势。但这两种方法都有其不足。关于STS-PCR方法，针对DAZ基因拷贝数和DAZ基因是否缺失进行检测，无法确认DAZ基因家族的部分缺失，在样本预处理方面显得更为复杂，对于STS-PCR检测缺失的病例，有时在进行FISH检测时依然能看到DAZ基因的存在Otepping S，etc. The use οfspermHAL0-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Hum Reprod. 2003Apr ；9(4) :183-188.),说明用STS-PCR方法有待于FISH技术的进一步验证。并且PCR扩增后存在电泳的检测过程，操作烦琐且易造成污染，增加了实现检测的技术复杂程度和大量的不确定因素。Real-Time PCR相对于前者虽灵敏度更高，且不用进行电泳检测，但目前对于该技术的应用与STS-PCR方法相同，且用户的一次性设备投入大。针对现有技术的上述不足，本发明人通过创造性的构思和不懈的实验努力完成了本发明。本发明通过使包含DAZ基因家族的DNA序列带有荧光标记，制备荧光原位杂交探针，同时，使18号染色体着丝粒区域带有荧光标记(例如蓝色荧光标记)，成为DAZ基因检测的对照探针，以不同的颜色进行区分。通过与从患者身上取得的血液或精液样本等进行杂交，带有荧光标记的原位杂交探针与样本的DAZ基因家族区和18号染色体着丝粒依次按照碱基互补的原理结合，从而将患者的DAZ基因家族缺失以荧光信号改变的方式显示。由于本发明的荧光原位杂交探针组是针对DNA序列进行的检测，因此具有高度的临床检测灵敏度与特异性，并具有取材方便等优势，不仅能检测DAZ基因家族的全部缺失， 也能同时检测DAZ基因家族的部分缺失，比传统的男性不育检测技术更具有先进性。
发明内容
本发明的一个方面涉及用于检测男性不育的检测剂，所述检测剂包括DGLP DAZ a探针组和GLP DAZ b探针组中的至少一组，以及2) CSP 18 探针组，其中，GLP DAZ a探针组由第一探针、第二探针、和第三探针组成，所述第一探针的下游序列与第二探针序列的上游序列相互重叠或紧邻，所述第二探针的下游序列与第三探针序列上游序列相互重叠或紧邻；将第一探针-第三探针各自的核酸序列按照从上游至下游的顺序依次连接得到的序列定义为序列A，前提是当相邻两个探针的连接处有重叠序列时去除其中1个探针的重叠部分的序列，该序列A由下述三部分构成I)染色体Yqll. 22上的DAZ a基因的全部核酸序列，II)染色体Yqll. 22上的DAZ a基因外侧向上游方向的70kb 120kb的核酸序列，和/或III)染色体Yqll. 22上的DAZ a基因外侧向下游方向的120kb 180kb的核酸序列；上述第一探针-第三探针各自为线性序列且各自对应于序列A上的一段连续序列；所述第一探针-第三探针均带有第一荧光标记；GLP DAZ b探针组由第四探针、第五探针、和第六探针组成，所述第四探针的下游序列与第五探针序列的上游序列相互重叠或紧邻，所述第五探针的下游序列与第六探针序列上游序列相互重叠或紧邻；将第四探针-第六探针各自的核酸序列按照从上游至下游的顺序依次连接得到的序列定义为序列B，前提是当相邻两个探针的连接处有重叠序列时去除其中1个探针的重叠部分的序列，该序列B由下述三部分构成
I)染色体Yqll. 22上的DAZ b基因的全部核酸序列，II)染色体Yqll. 22上的DAZ b基因外侧向上游方向的401Λ 801Λ的核酸序列， 和/或III)染色体Yqll. 22上的DAZ b基因外侧向下游方向的140kb 200kb的核酸序列；上述第四探针-第六探针各自为线性序列且各自对应于序列B上的一段连续序列；所述第四探针-第六探针均带有第二荧光标记；CSP 18探针组为第七探针，所述第七探针是带有第三荧光标记的核酸序列，为18 号染色体着丝粒序列制备的探针，探针长度约为450_480bp ；所述第一荧光标记、第二荧光标记、以及第三荧光标记相互之间均不相同。其中DAZ a 代表 DAZ 1/2，DAZ b 代表 DAZ 3/4。第一探针下游与第二探针上游相邻，第二探针下游与第三探针上游相邻。第四探针下游与第五探针上游相邻，第五探针下游与第六探针上游相邻。相邻包含了 “重叠”和 “紧邻”两种情况。所述“重叠”是指在将相邻两个探针按照从上游至下游的顺序连接在一起的情况下，连接处的核酸序列相同。以第一探针和第二探针为例，如果设定第一探针起点为Al，终点为A2，第二探针的起点为Bi，终点为B2，在坐标轴上，如果A2大于等于Bi，则说明这两个探针有重叠，重叠部分为Bl至A2。对于其它探针重叠的情况，可以如此类推。所述“紧邻”是指，还是以第一探针和第二探针为例，Bl比A2大1，视为第一探针和第二探针紧邻。对于其它探针紧邻的情况，可以如此类推。在一些情况下，Bl比A2大N，而N数值较小，例如N的取值范围为自然数1-1000等等，也可以视为两个探针紧邻。在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针按照各自从上游至下游的顺序依次连接起来的核酸序列(参见附
图1A)为大约3801Λ，这些探针的序列选自购买的 BAC clone(购自 Children's Hospital of Oakland Research Institute(CHORI) 或 invitrogen)RPll-140H23(起止位置chrY :252(^605-25390006)、RP11-346G2 (起止位置chrY :25202690-25389997)、RP11-263A15 (起止位置:chrY :25328461-25496569)、 RP11-340D2(起止位置chrY :25326662-25512793), RP11-829H8(起止位置chrY 25394785-25587236)以及 RP11_70G12(起止位置chrY :25401934-25582078)中的 3 个克隆的插入片段，并且优选如下的2组RP11-140H23、RP11-340D2、RP11-70G12或者 RP11-346G2、RP11-263A15、RP11-829H8, S 3个探针各自的核酸序列合起来约380kb，包含 DAZUDAZ2基因的全部核酸序列和染色体Yqll. 22上的DAZUDAZ2基因5’和/或3，末端以外的部分序列。在本发明的一个实施方案中，第四探针、第五探针、和第六探针按照各自从上游至下游的顺序依次连接起来的核酸序列(参见附图1B)为大约3401Λ，这些探针的序列选自购买的 BAC clone(购自 Children's Hospital of Oakland Research Institute(CHORI) 或 invitrogen)RPlU6D12(起止位置chrY :26903388-27059018)、RPl 11618(起止位置:chrY :26903432-27059042)、RP11-1089F15 (起止位置chrY :26951894-27166509)、 AC006338(起止位置chrY J6987714-27163503)、RP11-185E22(起止位置chrY 27076444-27236806)、CTD-2504K5 (起止位置chrY :27079925- 27262399)中的 3 个克隆的插入片段，并且优选如下的2组RP11-26D12、RP11-1089F15、RP11-185E22或者 RPl 1-2618,AC006338.CTD-2504K5, S 3个探针各自的核酸序列合起来约340kb，包含DAZ3、 DAZ4基因的全部核酸序列和染色体Yqll. 22上的DAD、DAZ4基因5’和/或3’末端以外的部分序列。所述第一探针至第七探针的各自序列的长短并不特别限定。在本发明的一个实施方案中，第七探针为18号染色体着丝粒探针，其序列长度约
为450-480bp，例如，其可以为SEQID NO 1所示的序列。
TATCTGGAAGTGGACATTTGGAGCGCTTTCAGGCCTATTTTGGAAAGGGA
AATATCTTCCCGTAACAACTATGCAGAAGCATTCTCAGAAACTTGTTTGT
GATGTGTGCCCTCTACTGACAGAGTTGAACCTTTCTTTTCATAGAGCACT
TTTGAAACACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAGAGGATATTTGCATAGCTTT
GAGGATTTCGTGGGAAACGGGATTGTCTTCAGGCAAAGTCTAGACAGAAG
CATTCTCAGAAACTTCTTTGGGATGTTTGCATTCAAGTCACAGAGTAGAA
CATTCCCTTTGGTAGAGCAGGTTTGAAACACTCTTTTTGTAGTATCTGGA
AGTGGACATTTGGAGCGCTTTCAGGCCCATGTTGGAAAGGGAAATATCTT
CCCGTAACAACTAGGCAGAAGCATTCTCAGAAACTTATTTGAGATGTGTGTACTCAACTA(SEQ ID NO 1)在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针用红色荧光标记， 第四探针、第五探针、和第六探针用绿色荧光标记，第七探针用蓝色荧光标记作为对照，可以有效地排除假阴性的情况，并且在特异性等方面均不影响DAZ检测探针的识别，提高了临床检测灵敏度。相对于现有技术，本发明的探针组覆盖范围更特异，既保证在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著，又通过不同荧光标记的颜色，使检测范围包含全拷贝缺失与部分结构缺失两种类型，并且通过一次性检测确认上述两种变异情况，具有很大的临床意义。在本发明的一个实施方案中，探针组中的探针序列为上述探针组中的探针的互补序列，或者选自如下的变体1)在高等严紧条件下与上述探针组中的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对上述探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，3)与上述探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C;“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中杂交过夜；随后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XS SC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述对上述探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端， 和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与上述探针组中的探针的核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在上述探针组中的探针的核苷酸序列之每100 个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95% 相同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。 参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。在本发明中，所述与上述探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括与上述探针组中的探针所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。关于探针的标记方法，可以采用现有技术中的方法使DNA序列带有相应的荧光标记。所述方法包括但不限于采用随机引物法、切口平移法等。随机引物法利用6个碱基的寡核苷酸作引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow 片段的催化下，沿单链模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的 《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)切口平移法需要用两种不同的酶活性参与反应，限制性内切酶DNA酶I可在双链靶DNA两条链上的随机位点切口磷酸二酯键，大肠杆菌DNA聚合酶I则将脱氧核糖核苷酸加到DNA酶I产生的3’羟基端。DNA聚合酶I除具有聚合酶活性，还具有5’ -3’外切核酸酶活性，因而能从切口 5’端去除核苷酸。5’端核苷酸的去除与荧光带有荧光标记的核苷酸的掺入同时进行，使切口沿着DNA链移动，产生高活性比的标记DNA(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)所用荧光标记可以是本领域中已知的荧光标记染料，例如下面的表1所示的荧光染料。表1可选用荧光染料，其激发及发射波长
权利要求
1.用于检测男性不育的检测剂，所述检测剂包括1)GLPDAZ a探针组和GLP DAZ b探针组中的至少一组，以及2)CSP 18探针组， 其中，GLP DAZ a探针组由第一探针、第二探针、和第三探针组成，所述第一探针的下游序列与第二探针序列的上游序列相互重叠或紧邻，所述第二探针的下游序列与第三探针序列上游序列相互重叠或紧邻；将第一探针-第三探针各自的核酸序列按照从上游至下游的顺序依次连接得到的序列定义为序列A，前提是当相邻两个探针的连接处有重叠序列时去除其中1个探针的重叠部分的序列，该序列A由下述三部分构成I)染色体Yqll.22上的DAZ a基因的全部核酸序列，II)染色体Yqll.22上的DAZ a基因外侧向上游方向的701Λ 1201Λ的核酸序列，和/或III)染色体Yqll.22上的DAZ a基因外侧向下游方向的1201Λ 1801Λ的核酸序列； 上述第一探针-第三探针各自为线性序列且各自对应于序列A上的一段连续序列； 所述第一探针-第三探针均带有第一荧光标记；GLP DAZ b探针组由第四探针、第五探针、和第六探针组成，所述第四探针的下游序列与第五探针序列的上游序列相互重叠或紧邻，所述第五探针的下游序列与第六探针序列上游序列相互重叠或紧邻；将第四探针-第六探针各自的核酸序列按照从上游至下游的顺序依次连接得到的序列定义为序列B，前提是当相邻两个探针的连接处有重叠序列时去除其中1个探针的重叠部分的序列，该序列B由下述三部分构成I)染色体Yqll.22上的DAZ b基因的全部核酸序列，II)染色体Yqll.22上的DAZ b基因外侧向上游方向的401Λ 801Λ的核酸序列，和/或III)染色体Yqll.22上的DAZ b基因外侧向下游方向的140kb 200kb的核酸序列； 上述第四探针-第六探针各自为线性序列且各自对应于序列B上的一段连续序列； 所述第四探针-第六探针均带有第二荧光标记；CSP 18探针组为第七探针，所述第七探针是带有第三荧光标记的核酸序列，为18号染色体着丝粒序列制备的探针，探针长度约为450-480bp ；所述第一荧光标记、第二荧光标记、以及第三荧光标记相互之间均不相同。
2.根据权利要求1所述的检测剂，其中，所述第一荧光标记是四甲基罗丹明，第二荧光标记是异硫氰酸，第三荧光标记是DEAC。
3.根据权利要求1所述的检测剂，其中第一探针、第二探针、和第三探针分别以选自BAC cloneRPll-140H23、RP11-70G12、 RP11-340D2、RP11-263A15、RP11-346G2、RP11-829H8 中的 3个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这3个克隆是RP11-140H23、RP11-340D2、RP11-70G12，或者 RP11-346G2、RP11-263A15、RP11-829H8 ；第四探针、第五探针、和第六探针分别以选自BAC cloneRPll-26D12、RP11-185E22、RP11-1089F15、RP11-26I8、CTD-2504K5、AC006338中的3个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这3个克隆是RP11-26D12、RP11-1089F15、RP11-185E22，或者 RPl1-2618, AC006338.CTD-2504K5 ；第七探针的序列如SEQ ID N0:1所示。
4.用于检测男性不育的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的检测剂。
5.权利要求1-3中任一项所述的检测剂、或者权利要求4所述的试剂盒在检测DAZ基因家族缺失中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述缺失为DAZa基因和/或DAZ b基因的缺失。
7.一种检测DAZ基因家族缺失的方法使用权利要求1-3中任一项所述的检测剂、或者权利要求4或5所述的试剂盒，通过荧光原位杂交检测DAZ基因家族的缺失状况。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所用检测样本为血液或精液。
9.根据权利要求8所述的方法，还包含如下步骤 观察整张玻片，考察10个细胞的中期分裂相如果只有1个或两个细胞异常，那么扩大考察，再考察10个中期分裂相； 如果超过两个细胞异常，则表明有DAZ基因的缺失。
10.根据权利要求9所述的方法，还包含如下步骤 对于如下的情形不要进行分析1)细胞核轮廓不清或有重叠的计数细胞；2)杂交不均勻的区域；3)背景深影响信号判断的区域；4)超过25%的染色体上信号太弱的区域；5)超过10%的细胞质内有信号的区域。
全文摘要
本发明涉及用于检测男性不育的检测剂和试剂盒。具体地，所述检测剂包括1)GLP DAZ a探针组和GLP DAZ b探针组中的至少一组，以及2)CSP 18探针组；所述试剂盒包括溶解在TE Buffer中的所述检测剂，其中所包括的每个探针组的浓度为50～300ng/μl。本发明还涉及所述检测剂和试剂盒在检测DAZ基因家族缺失的用途、以及一种检测DAZ基因家族缺失的方法。
文档编号G01N21/64GK102277412SQ20101019574
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月9日 优先权日2010年6月9日
发明者吴晓东, 成华, 程晓蕾, 陈忠 申请人:北京金菩嘉医疗科技有限公司