专利名称：一种马来酸桂哌齐特中氯乙酰吡咯啶哌嗪的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种化学药物的检测方法，特别是一种马来酸桂哌齐特的高效液相色 谱测定方法。
背景技术：
马来酸桂哌齐特，化学名为(Ε)-1-{4-[〔3'、4'、5 ‘-三甲氧基肉桂酰 基)]-1-哌嗪}乙酰吡咯啶顺丁烯二酸盐，英文名为Cin印azide Maleate0是一种具有多 种药物作用的新药，疗效确切，不良反应小，具有扩张血管和促进神经细胞营养代谢的双重 作用，是一种末梢血管扩张剂，临床上用于治疗心脑血管病。马来酸桂哌齐特的化学结构式如下 马来酸桂哌齐特的合成可以采用以下方法以3，4，5-三甲氧基肉桂酸为原料，与氯乙酰吡咯啶哌嗪反应生成桂哌齐特游离 碱，再与马来酸成盐，在该合成方法中氯乙酰吡咯啶哌嗪作为原料可能存留在最终产物中， 所以马来酸桂哌齐特产品中可能带有氯乙酰吡咯啶哌嗪杂质。氯乙酰吡咯啶哌嗪(简称B+C)结构式如下 现有国家标准中采用的方法，B+C色谱峰与马来酸桂哌齐特中的马来酸的色谱峰 保留时间相同，无法对马来酸桂哌齐特产品中残存或产生的B+C有效检出，进行控制。我们 经过研究，采用本发明的方法可以有效检出产品中可能残留的B+C。为此，本发明公开了一种马来酸桂哌齐特中氯乙酰吡咯啶哌嗪(以下简称B+C)的 分离测定方法，本发明采用高效液相色谱法，用两种色谱柱分离测定马来酸桂哌齐特中含 有的B+C。本方法能准确测定B+C的含量，有效控制马来酸桂哌齐特的质量，从而确保了药 品的安全性、有效性和可靠性，具有实际意义。
发明内容
本发明提供一种马来酸桂哌齐特产品中作为杂质的氯乙酰吡咯啶哌嗪的分离测 定方法。
本发明的测定方法1，其特征在于选用亲水作用色谱(Hydrophilic InteractionChromatography,HILIC)色谱柱，采用一 四根串联，优选一 两根串联。以甲 醇、乙腈或其混合物为有机相，与水相混合的溶剂作为流动相。甲醇与水相的比例为90 10 10 90。优选40 10 60 90。最优选为10 90。或有机相为乙腈，与水相混 合的溶剂作为流动相，乙腈与水相的比例为90 10 10 90。优选40 10 60 90。最优选为10 90。本发明的测定方法2，其特征在于选用型号为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 的色谱柱，以甲醇为有机相，与水相混合的溶剂作为流动相。甲醇与水相的比例为90 10 10 90。优选40 20 60 80。最优选为20 80。本发明的测定方法，其特征是水相可以为磷酸盐溶液，所述磷酸盐选自磷酸氢二 钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或其混合物。所述磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液，其 浓度为0. 05mol/L。优选的所述磷酸盐溶液为0. 05mol/L磷酸氢二钠溶液，用磷酸调pH值 为3. 0 6. 0。最优选的所述磷酸盐溶液为0. 05mol/L磷酸氢二钠溶液。本发明的测定方法，其特征是检测波长为200nm 400nm，优选的检测波长为 210nm。本发明的测定方法，其特征是柱温为10 50°C。优选的柱温为25°C。本发明的测定方法，其特征是流速为0. lml/min 5ml/min。优选的流速为0. 5ml/ min 1. Oml/min。本发明的测定方法，其特征是供试品溶液为每Iml约含马来酸桂哌齐特0. 5 IOmg的溶液。优选0. 5mg ；B+C对照品溶液为每Iml约含0. 5 10 μ g的溶液。优选0. 5 2. 5 μ g0本发明的测定方法，其特征是精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μ 1，分别注 入液相色谱仪，按外标法以峰面积(或峰高)或峰面积归一化法计算B+C的含量。本发明的测定方法，优选采用以下步骤取马来酸桂哌齐特适量，加流动相溶解并 稀释制成每Iml约含0. 5mg的溶液，作为供试品溶液；流速为1. Oml/min，检测波长210nm。 取供试品溶液20μ 1，注入高效液相色谱仪，完成马来酸桂哌齐特与B+C的分离测定。因此，本发明的测定方法包括以下三种优选的方法1>StfflIlzJc^ffifeif (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC) 色谱柱，(5 μ m, 100 X,4.6X 250mm)，以乙腈-0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH 至4. 5) (10 90)为流动相，流速为1. Oml/min，检测波长为210nm。方法 2、采用亲水作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC) 色谱柱，(5 μ m, 1001，4. 6 X 250mm)，以甲醇_0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH 至4. 5) (20 80)为流动相，流速为0. 5ml/min，检测波长为210nm。方法3、用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂的色谱柱(5 μ m，100义，4. 6X 250mm)； 以甲醇-0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5) (20 80)为流动相，流速 为1. 0ml/min，检测波长为210nm。本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱法分离测定马来酸桂哌齐特与B+C 的方法，可用于马来酸桂哌齐特的制备过程和最终产品的质量控制。
本发明的测定方法，优选的可按以下方法实现(1)取马来酸桂哌齐特或马来酸桂哌齐特的制剂样品适量，用流动相溶解样品，并 配制成配制成每Iml含马来酸桂哌齐特0. 5mg的供试品溶液。精密称取B+C对照品适量， 加流动相溶解并稀释制成每Iml中约含0. 5μ g的溶液，作为对照品溶液。(2)设置流动相流速为0. 5 1. Oml/min,流动相的流速优选为1. Oml/min ；检测 波长为210 230nm，最佳检测波长为210nm。选用Venusil HILIC色谱柱。(3)设置流动相流速为0. 5 2. Oml/min,流动相的流速优选为1. Oml/min ；检测 波长为210 230nm，最佳检测波长为210nm。选用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂的色谱 柱。(4)取1的供试品溶液、对照品溶液5 20 μ 1，优选20 μ 1，注入高效液相色谱仪， 完成马来酸桂哌齐特与B+C的分离测定。本发明相比现有技术具有如下优点采用本方法分离测定马来酸桂哌齐特与 B+C，在国内属于首创，方法简单快捷，分析灵敏度高，结果准确可靠。可用于马来酸桂哌齐 特及含有马来酸桂哌齐特的药物组合物的质量控制。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受此局限实施例1高效液 相色谱分离测定马来酸桂哌齐特与B+C的方法的条件选择(1)检测波长的选择取B+C对照品适量，用流动相溶解并定容，照紫外分光光度法(中国药典2005年 版二部附录IV Α)，在200 400nm波长范围内分别进行紫外扫描，结果显示B+C对照品仅 有末端吸收，因此将检测波长定为210nm。(2)色谱条件的选择马来酸桂哌齐特原料国家标准[WS-069(X-060)_2002]和马来酸桂哌齐特注射液 国家标准[WS1-(X-SZS)IOiMZ]中，高效液相法测定有关物质的方法中的色谱条件为采用 十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，以乙腈-0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH 至4. 5) (40 60)为流动相。按照国家标准中的方法，进样检测，检验结果显示，B+C与马来 酸峰完全重合，无法有效检出杂质B+C(见附
图1)。在国家标准的基础上，调整流动相比例， 均不理想，B+C与马来酸峰完全重合，无法有效检出杂质B+C。将色谱条件修订为用十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5) (20 80)为流动相，B+C与马来酸能达到有效分离(见附图2)，但此流动相比例下不适用 与采集桂哌齐特峰，如有需要，可根据需要在上述比例采集若干分钟后，调节流动相比例， 使桂哌齐特峰出现(即梯度洗脱法)。另选用亲水作用色谱(HydrophilicInteraction Chromatography, HILIC)色谱 柱，以乙腈-0.05!1101/1磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节？!1至4.5)(10 90)为流动相。 B+C与马来酸桂哌齐特能达到理想的分离效果，可有效控制杂质B+C(见附图3)。实施例2测定方法的验证(1)仪器与条件液相色谱仪SHIMADZU SPD-IOAiVP型高效液相色谱仪，检测器SPD_10AVP型紫外-可见检测器，工作站LCsolution Lite，岛津公司；用Venusil HILIC色谱柱(5 μ m， 100A，4. 6 X 250mm)；以乙腈_0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5) (10 90)为流动相，流速为l.Oml/min，检测波长为210nm。(2)色谱条件与系统适用性试验取B+C对照品适量，加流动相制成每Iml中含0. 5 μ g的溶液，精密量取1ml，加马 来酸对照品溶液(浓度为0. 2mg/ml) lml，摇勻，作为系统适用性试验溶液，注入液相色谱 仪，理论板数按B+C峰计算不得低于1500，B+C与马来酸的分离度应不得小于1. 5。表1系统适用性试验结果 (3)重复性试验精密称取B+C对照品适量，加入流动相制成每Iml含0. 5 μ g的溶液，作为对照品 溶液。同法操作5次，考察重复性。表2重复性试验结果 试验结果表明，该检测方法具有较高的重复性，相对标准偏差小于2%，说明该方 法较为可靠。(4)线性、范围精密称取B+C对照品适量，精密称定，加流动相制成浓度如下表的系列标准溶液。 分别取20 μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(C)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标作 图。表3线性结果 结果表明，在0.0125 1.0 μ g/ml范围，B+C线性良好。(5)溶液稳定性取B+C对照品适量，精密称定，加入流动相制成约每Iml含0. 5μ g的溶液，作为供 试品溶液。取上述溶液，分别于0、2、4、6、8小时，精密量取20 μ 1，注入液相色谱仪，测定考 察溶液的稳定性。表4溶液稳定性试验结果 结论综上所述，本方法符合《中国药典》2010年版规定。实施例3马来酸桂哌齐特原料中B+C的测定方法(1)仪器与条件液相色谱仪SHIMADZU SPD-IOAiVP型高效液相色谱仪，检测器SPD_10AVP型紫 外-可见检测器，工作站LCsolution Lite，岛津公司；用Venusil HILIC色谱柱(5 μ m， 100A，4. 6 X 250mm)；以乙腈_0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5) (10 90)为流动相，流速为l.Oml/min，检测波长为210nm。(2)测定法取马来酸桂哌齐特原料适量，精密称定，加入流动相制成每Iml约含马来酸桂哌 齐特0. 5mg的溶液，作为供试品溶液，精密称取B+C对照品适量，加入流动相制成每Iml含 2. 5 μ g的溶液，作为对照品溶液。试验中3分钟的色谱峰为B+C峰，6分钟的色谱峰为马来酸峰，9分钟的色谱峰为 为桂哌齐特峰。在上述色谱条件下，各峰分离度良好，符合中国药典规定。结果表明，马来酸桂哌齐特原料达到原料药要求，本法可用于马来酸桂哌齐特原 料药的质量监控。实施例4马来酸桂哌齐特注射液中B+C的测定方法(1)仪器与条件液相色谱仪SHIMADZU SPD-IOAiVP型高效液相色谱仪，检测器SPD_10AVP型紫 外-可见检测器，工作站LCsolution Lite，岛津公司；用Venusil HILIC色谱柱(5 μ m， 100A，4. 6 X 250mm)；以乙腈_0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5) (10 90)为流动相，流速为l.Oml/min，检测波长为210nm。(2)测定法精密量取马来酸桂哌齐特注射液适量，加入流动相制成每Iml约含马来酸桂哌齐 特0. 5mg的溶液，作为供试品溶液，精密称取B+C对照品适量，加入流动相制成每Iml含 2. 5μ g的溶液，作为对照品溶液。同法进行空白辅料溶液的试验。试验中3分钟的色谱峰为B+C峰，6分钟的色谱峰为马来酸峰，9分钟的色谱峰为 为桂哌齐特峰。在上述色谱条件下，各峰分离度良好，符合中国药典规定。
结果表明，空白辅料不干扰测定，马来酸桂哌齐特注射液达到制剂要求，本法可用 于马来酸桂哌齐特制剂的质量监控。实施例5马来酸桂哌齐特原料中B+C的测定方法(1)仪器与条件液相色谱仪SHIMADZU SPD-IOAiVP型高效液相色谱仪，检测器SPD_10AVP型紫 外_可见检测器，工作站resolution Lite,岛津公司；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂；以甲醇为流动相A，以0. 05mol/L磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节pH至4. 5)为流动相 B，按下表进行梯度洗脱；流速为1. Oml/min，检测波长为210nm。 (2)测定法取马来酸桂哌齐特原料适量，精密称定，加入流动相制成每Iml约含马来酸桂哌 齐特0. 5mg的溶液，作为供试品溶液，精密称取B+C对照品适量，加入流动相制成每Iml含 0. 5 μ g的溶液，作为对照品溶液。试验中3分钟的色谱峰为马来酸峰，4分钟的色谱峰为B+C峰，30分钟的色谱峰为 桂哌齐特峰。在上述色谱条件下，各峰分离度良好，符合中国药典规定。结果表明，马来酸桂哌齐特原料达到原料药要求，本法可用于马来酸桂哌齐特原 料药的质量监控。实施例6马来酸桂哌齐特注射液中B+C的测定方法(1)仪器与条件液相色谱仪SHIMADZU SPD-IOAiVP型高效液相色谱仪，检测器SPD_10AVP型紫 外_可见检测器，工作站resolution Lite,岛津公司；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂；以甲醇-0.05!1101/1磷酸氢二钠缓冲液(用磷酸调节？!1至4.5)(20 80)为流动相，流 速为1. 0ml/min，检测波长为210nm。(2)测定法精密量取马来酸桂哌齐特注射液适量，加入流动相制成每Iml约含马来酸桂哌齐 特0. 5mg的溶液，作为供试品溶液，精密称取B+C对照品适量，加入流动相制成每Iml含 0. 5μ g的溶液，作为对照品溶液。同法进行空白辅料溶液的试验。试验中3分钟的色谱峰为马来酸峰，4分钟的色谱峰为B+C峰。在上述色谱条件 下，各峰分离度良好，符合中国药典规定。结果表明，空白辅料不干扰测定，马来酸桂哌齐特注射液达到制剂要求，本法可用 于马来酸桂哌齐特制剂的质量监控。
权利要求
一种马来酸桂哌齐特中氯乙酰吡咯啶哌嗪的高效液相色谱测定方法，步骤如下取马来酸桂哌齐特样品，加流动相溶解制成溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，根据保留时间不同分离出氯乙酰吡咯啶哌嗪；其特征在于，其中选用亲水作用的色谱柱，色谱柱采用一～四根串联，以甲醇、乙腈或其混合物为有机相，其与水相混合的溶剂作为流动相，其中流动相中的有机相为乙腈时，乙腈与水相的比例为90～10∶10～90，流动相中的有机相为甲醇时，甲醇与水相的比例为90～10∶10～90，检测波长为200nm～400nm，柱温为10～50℃，流速为0.1ml/min～5ml/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中流动相中的有机相和水相的比例为 40 10 60 90。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中流动相中的有机相和水相的比例为 10 90，检测波长为210nm。
4.一种马来酸桂哌齐特中氯乙酰吡咯啶哌嗪的高效液相色谱测定方法，步骤如下取 马来酸桂哌齐特样品，加流动相溶解制成溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液，注入高效 液相色谱仪，根据保留时间不同分离出氯乙酰吡咯啶哌嗪；其特征在于选用型号为十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇为有机相，其与水相混合的溶剂作为流动相，甲 醇与水相的比例为90 10 10 90，检测波长200nm 400nm，柱温为10 50°C，流速 为 0. lml/min 5ml/min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中甲醇与水相的比例为40 20 60 80。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中甲醇与水相的比例为20 80，检测 波长为210nm。
7.根据权利要求1或4任意一项所述的方法，其特征是水相为磷酸盐溶液，所述磷酸盐 选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或其混合物，。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是所述磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液，其浓度 为 0. 05mol/L，pH 值为 3. 0 6. 0，ρΗ 值优选 4. 5，柱温为 25°C，流速为 0. 5ml/min 1. Oml/min。
9.根据权利要求1或4任意一项所述的方法，其特征是供试品溶液为每Iml含马来酸 桂哌齐特0. 5 IOmg的溶液，氯乙酰吡咯啶哌嗪对照品溶液为每Iml含0. 5 10 μ g的氯 乙酰吡咯啶哌嗪溶液。
10.根据权利要求1或4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤如下取马来酸桂 哌齐特样品，加流动相溶解并稀释制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为供试品溶液；流速为 1. Oml/min，检测波长210nm，用亲水作用色谱柱或以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色 谱柱，取供试品溶液20μ1，注入高效液相色谱仪，根据保留时间不同分离出氯乙酰吡咯啶 哌嗪，氯乙酰吡咯啶哌嗪的保留时间用氯乙酰吡咯啶哌嗪对照品溶液确定，氯乙酰吡咯啶 哌嗪的含量以外标法按峰面积或峰高计算，对照溶液为每Iml含0. 5 10 μ g氯乙酰吡咯 啶哌嗪对照品的溶液。
全文摘要
本发明涉及一种马来酸桂哌齐特中氯乙酰吡咯啶哌嗪的测定方法，本发明的测定方法，步骤如下取马来酸桂哌齐特样品，加流动相溶解制成溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，根据保留时间不同分离出氯乙酰吡咯啶哌嗪；其特征在于，其中选用亲水作用的色谱柱，色谱柱采用一～四根串联，以甲醇、乙腈或其混合物为有机相，其与水相混合的溶剂作为流动相，其中流动相中的有机相为乙腈时，乙腈与水相的比例为90～10∶10～90，流动相中的有机相为甲醇时，甲醇与水相的比例为90～10∶10～90，检测波长为200nm～400nm，柱温为10～50℃，流速为0.1ml/min～5ml/min。
文档编号G01N30/36GK101887050SQ20101020297
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者周芳, 王颖 申请人:王颖