专利名称：细胞早期凋亡的检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞凋亡的检测方法，尤其是能区分早期凋 亡细胞和晚期凋亡细胞的检测方法。
背景技术：
细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是指 细胞本身在一定的生理或病理条件下，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程，它是一个 多步骤，由基因调控的发生过程，涉及到一系列基因的激活、表达以及调控作用。细胞凋亡 对胚胎发育及形态发生、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时 引起的细胞损伤老化、肿瘤的发生发展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。进入20世 纪90年代，细胞凋亡的研究一下子被推到了生命科学的前沿，形成了一个几乎涉及生物医 学各个领域的研究高潮。由于细胞凋亡的早期和执行过程中有许多重要事件，因此加强细 胞凋亡检测方法的研究，尤其是细胞早期凋亡检测方法的研究，对于广泛深入地研究严重 威胁人类健康疾病的发生、早期诊断和治疗等重大医学问题具有重要意义。目前，细胞凋亡的检测方法可分为两类形态学特征的检测和生物化学特征的检 测。形态学特征的检测包括光学显微镜检测、电子显微镜检测、荧光显微镜检测和共聚焦激 光扫描显微镜检测等。但是此类方法大多只能定性，不能定量，且只有在发现了凋亡晚期 具有的凋亡小体时才能确定为阳性，因而不易检出早期凋亡细胞。生物化学特征的检测包 括DNA凝胶电泳法、TUNEL法、AnnexinV-FITC/PI法和线粒体膜电位变化的检测等。但是 DNA凝胶电泳法敏感性差，且不适用于细胞早期凋亡的检测，而TUNEL法的实验方法复杂， 费时，每次只能处理少量样本。这类方法中较为常用的是Armexin V-FITC/PI法检测，该法 不需要固定细胞，避免了 TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失，是目前较为理想的凋亡定量 检测方法。但是，该方法中的Armexin V价格昂贵，且标记的荧光染料FITC的荧光强度弱， 长时间容易淬灭，同时PI染料的发射波谱较宽，对FITC的发射波谱有一定的干扰。因此探 求新的、成本低廉且特异性高的细胞早期凋亡检测方法成了众多学者研究的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞早期凋亡的检测方法。该方法不仅能够定量检测早 期凋亡细胞，而且能够区分正常活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞以及机械损伤细胞。本发明通过以下技术方案达到上述目的一种细胞早期凋亡的检测方法，将标记 有荧光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰丝氨酸抗体与核酸荧光染料7-AAD搭配，共同对细 胞进行检测。磷脂酰丝氨酸抗体是一种针对磷脂酰丝氨酸的单克隆抗体，能与细胞凋亡 时外翻的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合，所以将磷脂酰丝氨酸抗体进行Alexa Fluor 488标记后，当细胞发生凋亡时，在合适波长激发光的激发下就可以发出明亮的绿色荧光。 7-AAD是一种核酸荧光染料，它不能透过完整的细胞膜，所以早期凋亡细胞的细胞膜完好 对7-AAD有拒染性，而对晚期凋亡细胞，7-AAD能够透过细胞膜而使细胞核染色发出红色荧光。因此，将磷脂酰丝氨酸抗体-Alexa Fluor 488和7-AAD搭配共同对细胞进行检测，磷 脂酰丝氨酸抗体-Alexa Fluor 488可以区分正常细胞和凋亡细胞，而7-AAD可以区分凋亡 细胞中的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞，从而达到检测细胞早期凋亡的目的。这种细胞早期凋亡的检测方法，细胞经两种荧光染料Alexa Fluor 488和 7-AAD染色后，在流式细胞仪激光束的激发下产生不同的荧光，荧光可被光学系统检测并 输送到计算机进行分析。分析后，细胞分为4个亚群，分别为正常活细胞Alexa Fluor 48877-AAD\ 早期凋亡细胞 Alexa Fluor 488+/7-AAD\ 晚期凋亡细胞 Alexa Fluor 488+/7-AAD+和机械性损伤细胞 Alexa Fluor 48877-AAD+。细胞早期凋亡的检测方法的具体步骤为(1)将0. 2 μ g标记有荧光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰丝氨酸抗体与细胞悬液 在4°C避光孵育20 30分钟，此时Alexa Fluor 488可以对凋亡细胞进行标记；(2)用1 μ g的核酸荧光染料7-AAD与细胞悬液在4°C避光孵育5分钟，此时7-AAD 只标记凋亡细胞中的晚期凋亡细胞；(3)通过流式细胞仪的检测分析，标记上Alexa Fluor 488的凋亡细胞发出绿色 荧光，而标记上7-AAD的晚期凋亡细胞发出红色荧光，因此Alexa Fluor488+/7-AAD_即为早 期凋亡细胞。本发明的有益效果是本发明所述方法可以定量检测细胞早期凋亡的发生比例，检测成本低廉，操作简 单，且荧光染料Alexa Fluor 488的荧光强度强，长时间不易淬灭，同时7-AAD的发射波谱 窄，对其他检测通道的干扰更小，与Alexa Fluor 488联合使用具有较好的效果。
图1至图6为采用本发明所述细胞早期凋亡的检测方法，通过流式细胞仪检测0， 20，50，80，100，120mg/L六个不同浓度EGCG诱导人白血病T淋巴细胞系(Jurkat细胞)早 期凋亡的变化图谱，图中右下象限为早期凋亡细胞。图7至图12为采用本发明所述细胞早期凋亡的检测方法，通过流式细胞仪检测0， 50，100，125，150，175mg/L六个不同浓度EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的变化 图谱，图中右下象限为早期凋亡细胞。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，这些实例仅用于说明本发明的具体 方案，而不是于限制本发明范围。实施例1本实施例为采用本发明对人白血病T淋巴细胞系(Jurkat细胞)早期凋亡的检测 的一个实例。人白血病T淋巴细胞系(Jurkat悬浮细胞)，生长在含10%胎牛血清，100U/ml青 霉素_链霉素的RPMI-1640完全培养液中，置于37°C、5% CO2的培养箱中培养。将对数生长 期的Jurkat悬浮细胞悬液的密度调整到2. 5X IO5个/ml，然后用吸管吸取3ml细胞悬液加 入到60mm的无菌培养皿中，每个培养皿中加入凋亡诱导药物EGCG，使其终浓度分别为20，50，80，100和120mg/L，同时设置未经药物处理的细胞作为空白对照，然后放在37°C培养箱 静置培养24小时。将EGCG作用24小时后的Jurkat细胞收集到离心管中，IOOOrpm离心10分钟，除 去上清，用4°C预冷的PBS重悬细胞，IOOOrpm离心10分钟，再重复一次，最后除去上清。在 冰浴上，加入500μ 1的含胎牛血清的PBS上样缓冲液到离心管中，用吸管吹打使细胞重 悬，加入标记有Alexa Fluor 488荧光染料的磷脂酰丝氨酸抗体0.2 μ g，振荡均勻后4°C避 光孵育20 30分钟。然后加入7-AAD 1 μ g，振荡均勻后4°C避光孵育5分钟，孵育后即可 上流式细胞仪检测分析。流式细胞仪分析的原始数据用FCS Express V3软件处理，选择Create FreeForm Gate工具设置门，选择Show Quadrants工具确定十字中心位置。在数据处理中，所有样本 的流式细胞仪数据都采用同一个门来圈选细胞，并且将十字中心点置于同一位置，以保证 所有样本的数据处理都采用同一标准。Jurkat细胞早期凋亡的检测结果如下Jurkat细胞分为4个亚群=Alexa Fluor 488_/7_AAD_亚群为正常活细胞，流式图中左下象限；Alexa Fluor 488+/7_AAD_亚群为早期 凋亡细胞，流式图中右下象限；Alexa Fluor 488+/7-AAD+亚群为晚期凋亡细胞，流式图中右 上象限；Alexa Fluor 488_/7-AAD+亚群为机械损伤细胞，流式图中左上象限。随着EGCG浓 度的增加，Jurkat细胞的早期凋亡率先升后降，正常活细胞的比例不断下降，晚期凋亡细胞 的百分比明显升高，如图1至图6所示。实施例2本实施例为采用本发明对人肝癌SMMC-7721早期凋亡的检测的一个实例。人肝癌SMMC-7721细胞生长在含10 %胎牛血清，100U/ml青霉素-链霉素的 RPMI-1640完全培养液中，置于37°C、5% CO2的培养箱中培养。将对数生长期的SMMC-7721 细胞消化成细胞悬液，密度调整到2. 5X IO5个/ml，然后用吸管吸取3ml细胞悬液加入到 60mm的无菌培养皿中。培养过夜待细胞贴壁后，每个培养皿中加入凋亡诱导药物EGCGdi 其终浓度分别为50，100，125，150和175mg/L，同时设置未经药物处理的细胞作为空白对 照，然后放在37°C培养箱静置培养24小时。将EGCG作用24小时后的SMMC-7721细胞收集到离心管中，IOOOrpm离心10分钟， 除去上清，用4°C预冷的PBS重悬细胞，IOOOrpm离心10分钟，再重复一次，最后除去上清。 在冰浴上，加入500 μ 1的含1 %胎牛血清的PBS上样缓冲液到离心管中，用吸管吹打使细胞 重悬，加入标记有Alexa Fluor488荧光染料的磷脂酰丝氨酸抗体0. 2 μ g，振荡均勻后4°C 避光孵育20 30分钟。然后加入7-AAD 1 μ g，振荡均勻后4°C避光孵育5分钟，孵育后即 可上流式细胞仪检测分析。流式细胞仪分析的原始数据用FCS Express V3软件处理，选择CreateFreeForm Gate工具设置门，选择Show Quadrants工具确定十字中心位置。在数据处理中，所有样本 的流式细胞仪数据都采用同一个门来圈选细胞，并且将十字中心点置于同一位置，以保证 所有样本的数据处理都采用同一标准。SMMC-7721细胞早期凋亡的检测结果如下SMMC_7721细胞分为4个亚群=Alexa Fluor 48877-AAD—亚群为正常活细胞，流式图中左下象限；Alexa Fluor48877-AAD_亚群 为早期凋亡细胞，流式图中右下象限；Alexa Fluor 488+/7-MD+亚群为晚期凋亡细胞，流式图中右上象限；Alexa Fluor 48877-AAD+亚群为机械损伤细胞，流式图中左上象限。随着 EGCG浓度的增加，SMMC-7721细胞的早期凋亡率先升后降，正常活细胞的比例不断下降，晚 期凋亡细胞的百分比明显升高，如图7至图12所示。
权利要求
一种细胞早期凋亡的检测方法，其特征在于，该检测方法是将标记有荧光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰丝氨酸抗体与核酸荧光染料7 AAD搭配，共同对细胞进行检测，前者用于区分正常活细胞和凋亡细胞，后者用于区分凋亡细胞中的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞早期凋亡的检测方法，其特征在于，所述方法的具体步 骤为(1)将0.2yg标记有荧光染料AlexaFluor 488的磷脂酰丝氨酸抗体与细胞悬液在 4°C避光孵育20 30分钟，此时Alexa Fluor 488对凋亡细胞进行标记；(2)用1μ g的核酸荧光染料7-AAD与细胞悬液在4°C避光孵育5分钟，此时7-AAD只 标记凋亡细胞中的晚期凋亡细胞；(3)通过流式细胞仪的检测分析，标记上AlexaFluor 488的凋亡细胞发出绿色荧光， 而标记上7-AAD的晚期凋亡细胞发出红色荧光，因此Alexa Fluor488+/7-AAD"即为早期凋 亡细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞早期凋亡的检测方法，其特征在于，所述AlexaFluor 488和7-AAD两种不同发射波长的荧光染料同时对细胞进行染色，通过流式细胞仪检测细 胞早期凋亡的发生。
全文摘要
一种细胞早期凋亡的检测方法，将标记有荧光染料Alexa Fluor 488的磷脂酰丝氨酸抗体与核酸荧光染料7-AAD搭配，共同对细胞进行检测，前者用于区分正常活细胞和凋亡细胞，后者用于区分凋亡细胞中的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。通过流式细胞仪对不同发射波长的两种荧光染料Alexa Fluor 488和7-AAD进行检测分析后，细胞分为4个亚群，其中Alexa Fluor 488+/7-AAD-亚群即为早期凋亡细胞。
文档编号G01N21/64GK101893572SQ201010205808
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者何敏, 李刚, 萧浩, 钟艳平 申请人:广西医科大学