专利名称：一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法
技术领域：
本发明属于材料检测方法，具体涉及一种PVY/CMV检测方法
背景技术：
CMV(烟草黄瓜花叶病毒)是一种多寄主病毒，除侵染烟草外，还侵染马铃薯、油菜、黄瓜、天仙子、尤葵、假醢浆、三生烟、昆诺尔藜、白肋烟、详酸浆、洋酸浆、心叶烟、苋色藜和蔓陀萝等多种植物。PVY(烟草马铃薯Y病毒)是一种多寄主病毒，除侵染烟草外，还侵染马铃薯、油菜、天仙子、尤葵、红嘴燕、假醢浆、三生烟、白肋烟、洋酸浆、心叶烟、苋色藜和蔓陀萝等多种植物。自1970s在我国发现CMV感染烟草、1980s在我国发现PVY感染烟草以来，CMV、PVY与烟草花叶病毒等一起感染烟草，造成烟草病毒病害和严重经济损失。由于 CMV和PVY通过蚜虫传播，更增加了对该病害防治的难度。CMV与PVY至今没有有效的防治方法，仍然是烟草生产中危害最大的病原。因此， CMV与PVY的防治应突出早检测、早预报、早防治。检测CMV与PVY的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR检测法、核酸点杂交法、dsRNA法和免疫胶体金检测试纸条等，申请号为“200610160020.0”、专利名称为“烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法”介绍了一种快速检测CMV的方法。但是这些方法检测费用高，灵敏度低，只能定性不能定量，难以满足大量样品的快速以及现场检测的需要。表面等离子体波共振(surface ρlasmon resonance，SPR)检测方法是基于分子间相互作用的检测技术。其原理是在光学全反射界面上的等离子体的共振吸收与界面上的分子状态有关，表现在入射光的强度、角度和相位发生变化。当全反射发生在固液界面上时， 入射光的变化反映出溶液中分子与固体表面分子的吸附或结合。因此，通过在固体表面固化一种可以与溶液中待测物质发生反应的分子，就可以检测溶液中待测物的浓度。自1990 年第一台商业化SI^R检测仪问世以来，基于SI^R原理的传感器及其应用研究有了快速发展。 与常规检测技术相比，sra技术具有高灵敏度、响应快、体积小、机械强度大、检测过程快捷、 能够获得实时数据、操作方便、无须标记、可保持分子的生物活性、既可定性也可定量、可再生重复利用、抗电磁干扰能力强和光纤相连可实现数据的远程采集和连续在线监控等突出优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是PVY/CMV病毒的检测方法费用高、灵敏度低、不能定量检测，提供一种费用低、灵敏度高、可以定量检测的PVY/CMV表面等离子体共振检测方法。本发明的技术方案是以下述方式实现的一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，是按照以下步骤进行的( 一 )制备PVY/CMV抗原和PVY/CMV单克隆体；
( 二 )制备生物传感器芯片；a、芯片的制备在平整的膜片上镀上40 60nm的金膜后用Piranha溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗；b、基膜的固定将芯片浸入MUOH的乙醇中12 20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；C、连接臂分子的固定用等体积的NaOH和表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的MUOH反应 4h活化羧基，之后将含有NaOH的右旋糖苷溶液加入芯片表面反应20h，再用等体积的NaOH 和0. 6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；d、PVY/CMV单抗体的固定将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液反应IOmin (8 12min)活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的PVY单克隆抗体溶液注入到芯片表面， 在25°C孵育16 2anin后用乙醇胺-HCl于25°C处理IOmin以封闭未被活化的羧基，再用 HEPES冲洗。e、玻片的保存将步骤d中制作好的玻片浸泡在IOmM HEPES中在4°C保存。(三)制作标准曲线，得到PVY/CMV病毒计算公式；(四)、测定PVY/CMV的含量I、制取PVY/CMV病毒粗提液；II、取50 μ L病毒粗提液用HEPES稀释后注入SI3R仪器中，测定其共振响应值RU， 代入步骤(三)得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。上述步骤(一)是按照以下步骤进行的①制备PVY/CMV抗原②制备PVY/CMV单克隆体i、首次免疫选取4 6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的PVY/CMV抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射；ii、间隔免疫首次免疫两周后，用浓度为0. 3mg/ml的PVY/CMV与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂；iii、加强免疫在步骤ii实施两周后，用0. 3mg/ml的PVY/CMV对小鼠进行注射；iv、细胞融合加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞与骨髓瘤细胞在PEG400溶液下融合；V、融合细胞的培养将融合后的细胞在HAT培养基中选择培养7 10天，之后在HT培养基中培养14 天，然后在DMEM基中培养；
Vi、制备杂交瘤细胞筛选步骤ν中的阳性细胞后亚克隆阳性细胞，之后将细胞扩大培养得到杂交瘤细胞；vii、获得PVY/CMV单克隆体给8 10周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体，7天后注射步骤vi中得到的杂交瘤细胞，6 8天后收集小鼠腹水单克隆体，腹水经凝胶过滤或ftOtein A/G亲和层析法纯化获得PVY单克隆抗体。上述步骤①是按照以下述步骤进行的(1)取感染PVY/CMV的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；(2)在步骤(1)所得滤液中加7 9%正丁醇，搅拌12 ISmin ；(3)取步骤( 所得滤液IOOOOg离心30min，弃沉淀得上清液；(4)将步骤(3)所得上清液中加入3 5% PEG,2 4% NaCl搅拌至溶解，4°C冰箱内保存；(5)取步骤(4)所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃上清液得沉淀；(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于0. 01mol/L PBS缓冲液中，之后离心12 18min，
弃沉淀取上清；(7)将步骤(6)所得上清液按每IOml加入0. 4g NaCl及0. 4g PEG，搅拌至溶解， 然后放置于4°C冰箱内保存；(8)取步骤(7)所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS 将沉淀物溶解；(9)取步骤⑶所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4°C冰箱内即可；(10)将1. 6ml粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1. 5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1. 5h，弃上清，用PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。上述步骤vii中所述的灭菌液体是灭菌石蜡或者降植烷。本发明利用表面等离子体波共振方法，灵敏度高，既可以定性、也可以定量的检测 PVY/CMV，表面等离子体波共振方法检测时候需要制备PVY/CMV生物传感器芯片，之后制作标准曲线，得出计算公式；之后在测取植物中的PVY/CMV病毒的时候，只需提取PVY/CMV病毒粗提液，之后注入SI^R仪器测定共振响应值RU，带入标准计算公式即可。当得出标准曲线和计算公式之后，可以多次测量提取的PVY/CMV病毒，操作方便，费用低廉。
图1是PVY溶液标准测试曲线；图2是CMV溶液标准测试曲线。
具体实施例方式实施例1一种PVY表面等离子体共振检测方法，是按照以下步骤进行的
(一)制备PVY抗原和PVY单克隆体；( 二)制备生物传感器芯片；a、芯片的制备在平整的膜片上镀上40 60nm的金膜后用Piranha (98 %的浓硫酸与30 %的H2R 按照7 3的比例得到的混合液)溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；b、基膜的固定将芯片浸入IOmM MUOH(11-11-巯基i^一醇)的乙醇中12 20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；C、连接臂分子的固定用等体积的0. 4M NaOH和0. 6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的单层MUOH反应4h以活化羧基，之后将含有0. IM NaOH的右旋糖苷溶液(0. 3g/mL)加入芯片表面反应20h，再用等体积的0. 4M NaOH和0. 6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；d、PVY单抗体的固定将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液(0. 4mol/LEDC和0. Imol/ L NHS)反应18 iaiiin活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的PVY单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25°C孵育16 2anin后用乙醇胺-HCl于25°C处理IOmin以封闭未被活化的羧基，再用HEPES冲洗。EDC和NHC的用法和作用可参考《华南理工大学学报自然科学版》，2007年第35 卷第12期，王迎军等作者的《EDC/NHS交联对胶原物理化学性能的影响》。e、玻片的保存将步骤d中制作好的玻片浸泡在IOmM HEPES(PH = 7. 4)中在4°C保存。(三)制作标准曲线，得到PVY病毒计算公式；取PVY病毒纯化溶液的冻干粉，用IOmM HEPES (pH 7. 4)配制5个标准溶液，浓度分别是 ι. ο μ g/ml、2. 0 μ g/ml、4. 0 μ g/ml、8. 0 μ g/ml、16 和 32 μ g/ml。使用IOmM HEPES(pH 7.4)走基线，待基线走稳之后进样，记录曲线平台期数值作为响应值(RU)，每个样品检测3次取平均值。各次检测之间使用0. 2M的甘氨酸盐酸盐 (PH2.5-3)溶液再生敏感膜，并用IOmM HEPES(pH 7.4)走基线。不同浓度的病毒溶液测得的RU值见表1。表 权利要求
1. 一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，其特征在于是按照以下步骤进行的(一)制备PVY/CMV抗原和PVY/CMV单克隆体；(二)制备生物传感器芯片；a、芯片的制备在平整的膜片上镀上40 60nm的金膜后用Piranha溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗；b、基膜的固定将芯片浸入MUOH的乙醇中12 20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；c、连接臂分子的固定用等体积的NaOH和表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的MUOH反应4h 活化羧基，之后将含有NaOH的右旋糖苷溶液加入芯片表面反应20h，再用等体积的NaOH和 0. 6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；d、PVY/CMV单抗体的固定将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液反应IOmin (8 12min)活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的PVY单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25°C 孵育16 22min后用乙醇胺-HCl于25°C处理IOmin以封闭未被活化的羧基，再用HEPES 冲洗。e、玻片的保存将步骤d中制作好的玻片浸泡在IOmM HEPES中在4°C保存。(三)制作标准曲线，得到PVY/CMV病毒计算公式；(四)、测定PVY/CMV的含量1、制取PVY/CMV病毒粗提液；II、取50 μ L病毒粗提液用HEPES稀释后注入SI5R仪器中，测定其共振响应值RU，代入步骤(三)得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。
2.根据权利要求1所述的PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，其特征在于所述步骤 (一)是按照以下步骤进行的①制备PVY/CMV抗原②制备PVY/CMV单克隆体i、首次免疫选取4 6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的PVY/CMV抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射；ii、间隔免疫首次免疫两周后，用浓度为0. 3mg/ml的PVY/CMV与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂；iii、加强免疫在步骤ii实施两周后，用0. 3mg/ml的PVY/CMV对小鼠进行注射；iv、细胞融合加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞与骨髓瘤细胞在PEG400溶液下融合；V、融合细胞的培养将融合后的细胞在HAT培养基中选择培养7 10天，之后在HT培养基中培养14天， 然后在DMEM基中培养；vi、制备杂交瘤细胞筛选步骤ν中的阳性细胞后亚克隆阳性细胞，之后将细胞扩大培养得到杂交瘤细胞；vii、获得PVY/CMV单克隆体给8 10周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体，7天后注射步骤vi中得到的杂交瘤细胞， 6 8天后收集小鼠腹水单克隆体，腹水经凝胶过滤或ftOtein A/G亲和层析法纯化获得 PVY单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的PVY表面等离子体共振检测方法，其特征在于所述步骤①是按照以下述步骤进行的(1)取感染PVY/CMV的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；(2)在步骤(1)所得滤液中加7 9%正丁醇，搅拌12 ISmin；(3)取步骤( 所得滤液IOOOOg离心30min，弃沉淀得上清液；(4)将步骤(3)所得上清液中加入3 5%PEG,2 4% NaCl搅拌至溶解，4°C冰箱内保存；(5)取步骤(4)所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃上清液得沉淀；(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于0.01mol/L PBS缓冲液中，之后离心12 18min，弃沉淀取上清；(7)将步骤(6)所得上清液按每IOml加入0.4g NaCl及0. 4g PEG，搅拌至溶解，然后放置于4°C冰箱内保存；(8)取步骤(7)所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS将沉淀物溶解；(9)取步骤(8)所得溶液IOOOOg离心12 18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4°C冰箱内即可；(10)将1.6ml粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1. 5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1. 5h，弃上清，用PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。
4.根据权利要求3所述的PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，其特征在于步骤vii 中所述的灭菌液体是灭菌石蜡或者降植烷。
全文摘要
本发明公开一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，属于材料检测方法。本发明是通过下述几个步骤实现的1、制备PVY/CMV抗原和单克隆体；2、制备生物传感器芯片；3、制作标准曲线，得到病毒计算公式；之后利用病毒计算公式测定PVY/CMV的含量。本发明利用表面等离子体波共振方法，灵敏度高，既可以定性、也可以定量的检测PVY/CMV，且操作方便，费用低廉。
文档编号G01N33/569GK102297967SQ20101020570
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘剑君, 李富欣, 邱立友 申请人:河南农业大学