专利名称：一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法。本发明还涉及所 述寡聚体在制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物中的应用。
背景技术：
淀粉样肽寡聚体(亦称为Αβ寡聚体)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)早期病理改变的始动因素。最新研究表明，只有低分子量A β寡聚体才是引 起AD神经元损伤的毒性物质，高分子量聚集物和纤维成分不具有这种作用。在人体外人工 制备该淀粉样肽寡聚体，有助于研究阿尔茨海默病的致病机理和治疗方法。淀粉样肽在体外容易形成包含纤维和不具有纤维形态的高分子量或低分子量聚 集物在内的混合物。这种组分不均一的混合物影响研究的准确性和可靠性。因此，获得稳 定均一的低分子量Αβ寡聚体对科研工作非常重要。众多学者曾采用多种方法制备Αβ寡聚体，但收率和效果比较低，并且所得Αβ寡 聚体的成分不均一，含有较多成分的高分子量聚集物和纤维状成分，难以进一步提纯。如， 利用化学交联法制备的寡聚体在成分上有差异，不能真实反应低分子量A β寡聚体的作用 特点。而且各制备方法的条件不稳定，所得结果难以比较。有些方法和材料具有较大的不 良反应，影响试验者和应用者的健康。因此，研制一种新型人工体外淀粉样肽寡聚体制备方法，获得均一可溶性低分子 量的淀粉样肽寡聚体，确有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种低分子量淀粉样肽寡聚体的制备方法，直接目的是提供 均一分子量的淀粉样肽寡聚体，具有特征性的超微形态和二级结构，可用于制备阿尔茨海 默病的诊断试剂和治疗药物。本发明的技术方案如下一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将A β多肽的单 体用无水二甲基亚砜溶解后，于4°C置于缓冲体系中反应22 26小时，使其自然聚合形 成寡聚体；所述缓冲体系组成是NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L, NaHC0326mmol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, MgS04 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L。所述淀粉样肽特指由其前体蛋白APP(amyloid precourcer protein)经过蛋白酶 降解形成的表观分子量为4kD的多肽；本发明所用的缓冲体系是改良的人工脑脊液，在传统人工脑脊液的基础上调整了 葡萄糖和氨基酸含量，其改良后的组成接近于正常脑脊液，有利于模拟体内生理条件。最佳反应时间为24小时。所得寡聚体是在透射电镜下观察为直径IOOnm以下的球形颗粒物，分子量为16 40kD。
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所述Αβ多肽的单体可以用传统的化学合成方法制备，如，以Αβ 42为原料，通过 六氟异丙醇(l，l，l，3，3，3-hexafluoro-2-propannol，HFIP)的作用使其单体化。所述A β 42基因序列是已知的，Genebank登录号BC065529 ；本发明提供了一种用基因重组的方法得到淀粉样肽单体，更为经济和环保，所得 到的淀粉样肽单体质量更好，方法是在N端加组氨酸标签(6XHis)，C端加终止子序列 TGA,构建A β 42单体表达载体，按照常规方法在大肠杆菌表达体系内表达，用Ni柱纯化目 的多肽。然后于室温下将A β 42单体溶于冰预冷1 2h的六氟异丙醇，通过送风挥发，完 全除去六氟异丙醇，形成肽膜。本发明所制备的人工体外淀粉样肽寡聚体在电子显微镜下分析，可以看到纳米级 的微粒。利用圆二色谱(Circular dichroism,⑶)法分析其二级结构，可以检测到特征性 的寡聚体负峰。利用蛋白免疫印迹的方法可以验证制备出分子量在16. 5kD范围内的Αβ寡聚体。本研究首先构建了 Αβ单体的原核表达杂载体，诱导表达并且纯化后，通过HFIP 将其单体化，用蛋白免疫印迹的方法验证获得了所需的单体。本发明对制备的人工体外淀粉样肽寡聚体进行了如下实验1、免疫印迹(Western blot)实验目的验证所得寡聚体是成分均一的，并且具有免疫反应性。结果显示所得寡聚体能够被抗人Αβ单克隆抗体6Ε10特异性识别，并且在 16. 5kD左右的范围内有均一条带(见实施例3)。说明所得寡聚体是低分子量的均一成分， 并且具有免疫反应性。用于蛋白质免疫印迹的最佳淀粉样肽寡聚体样品质量为5 μ g/孔。2、透射电镜检测目的验证所得寡聚体是纳米级的均一微粒。结果显示在透射电镜下观察到5nm到IOnm左右的球形寡聚体，随着聚集过程，出 现颗粒状以及20-30nm的卷曲结构和丝状或分枝状的纤维(见实施例4)。说明所得寡聚体 具有特征性的超微结构。3、圆二色谱检测目的验证所得寡聚体具有特征性的二级结构。结果显示聚集过程中α螺旋向β折叠转变(见实施例5)。说明所得寡聚体获 得了特征性的二级结构。用本发明获得的淀粉样肽寡聚体可以制备出诊断、预防和治疗阿尔茨海默病的药 物、试剂等。例如，可以采用基因工程方法，构建和/或表达多种小分子基因工程疫苗、多肽疫 苗，以便用于AD预防和早期治疗的基础与临床研究和应用。本发明人以所获得的淀粉样肽寡聚体作为标准品，利用夹心ELISA法(酶联免疫 吸附试验)^Western blot实验、透射电镜和CD等实验方法，分别制备出了四种不同方法的 检测阿尔茨海默病的试剂。本发明的优点首先，本发明模拟体内生理条件，以Αβ为原料在体外组装淀粉样肽寡聚体，所得
4产物稳定均一。这一点优于其它“化学交联”法的效果。其次，本发明优化了制备中的关键参数，所得产物可以作为多种AD检测和治疗研 究的标准参照物。确定了获得Αβ单体的最佳方法、改良人工脑脊液组成、确定关键时间点 为 24h。第三，用基因重组方法得到单体的好处是，经济、环保、基因能够在体外扩增和表 达，可再生性强。
图1为Western blot实验验证单体的获得。单体条带位于6. 5kD下方附近约4kD 的位置。图2为Western blot实验验证淀粉样肽寡聚体形成的结果。图中1为淀粉样肽 的单体；图中2为淀粉样肽的寡聚体，条带位于16. 5kD下方位置。图3为透射电镜下淀粉样肽寡聚体的形态特征。A.只有寡聚体形成，没有纤维状 或分枝状的结构；B.有大量纤维形成。图4圆二色谱检测淀粉样肽寡聚体二级结构特征(于24h时可见明显的负峰)。
具体实施例方式
实施例1淀粉样肽单体的获得1、基因重组法Αβ 42基因(Genebank登录号BC065529)委托上海生工生物工程技术服务有限 公司合成，并安装在带有6XHis标签的原核表达载体上组成NAbeB-pET30a表达质粒。然 后转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达。取NAbeB-pET30a-BL21冻存菌液，在Kana抗性的 LB培养板上划线，37°C培养12 16h ；挑取生长良好的单菌落到7ml具有Kana抗性的LB 培养液中，260rpm，37°C过夜培养；大约培养4h后菌液OD值达到0. 6，此时加入终浓度为 lmmol/1的IPTG进行诱导，6h后12000rpm，4°C离心15min收集菌体；用PBS洗涤菌体两次， 12000rpm，4°C离心15min收集菌体；每500ml菌液收集的菌体中加入30ml裂解液重悬细 菌，充分混和，300w，工作10s，间歇15s超声破碎菌体90分钟；12000rpm，4°C离心15min，将 上清转移到新的离心管中，-80°C保存。对表达产物进行纯化。平衡Ni柱子，每个15ml离心管中取0.6ml Ni-NTA Agarose (QIAGEN公司产品)，分别加入2ml裂解缓冲液(QIAGEN公司产品)，混勻，室 温5440g离心Imin弃上清，重复3次；将菌液上清30ml于Ni-NTAAgarose混合后，室温 200rpm摇动IOmin ；5440g离心lmin，上清转入一新的离心管中，标记为FL ；每个离心管 中的Ni-NTAAgarose用5ml的洗涤缓冲液(washing buffer) (QIAGEN公司产品)洗涤两 次，5440g，离心lmin，上清转入新的离心管中，标记为Wl和W2 ；每管用2ml的洗脱缓冲液 (elution buffer) (QIAGEN公司产品)洗脱三次，5440g，离心lmin，上清转入新的离心管中 标记为El ；将上述得到的上清取少量行SDS-PAGE电泳，其余_80°C保存。El即为Aβ 42多 肽。对淀粉样肽进行单体化处理。将其Img溶于冰预冷的六氟异丙醇(1，1，1，3，3， 3-hexaf luoro-2-propannol, HFIP) (Sigma)，室温，风速 4. 5m/s，2. 5h 后使 HFIP 挥发殆尽。这时，在微量离心管的底部管壁形成薄薄的一层肽膜。2、化学合成法A β 42肽(Genebank登录号BC065529)也可以由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。单体化的方法同“基因重组法”的处理所获得的单体溶解后取样，通过免疫印迹验证，详细步骤见实施例3，结果见图1。实施例2淀粉样肽寡聚体的组装将实施例1所得的肽膜用无水二甲基亚砜(DMSO) (Sigma) 20 μ 1溶解，最后将其 置于改良的人工脑脊液缓冲体系(体积相应补足至1ml)、置4°C，24h，使其自然聚合，用 Western blot检测寡聚体的制备情况。改良的人工脑脊液缓冲体系的组成NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L，NaHCO3 26mmol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, MgSO4 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L.在肽膜刚刚被DMSO溶解加入到改良的人工脑脊液缓冲体系时，也就是组装过程 中的Os取样品5 μ L，以备Western blot检测来验证单体的获得。在组装过程中的24h取 样品，以备Western blot检测来验证寡聚体的获得。详细步骤见实施例3。实施例3免疫印迹(Western blot)实验1、实验目的通过分子量和免疫反应性验证单体和寡聚体的获得2、实验方法取组装过程中Os和24h留取的5 μ g样品，加上1/4体积的5X样品缓冲液，混 勻后上样，先以100V电压使蛋白通过浓缩胶。当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在 120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，结束电泳，取下凝胶，常规用考马斯亮蓝R-250染色法 染色；将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装有印迹缓冲液的容器里平衡lOmin，依次在放入 滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，成“三明治”状，倒入转膜缓冲液，胶面朝负极，NC膜面朝向正极，小 心避免并赶去气泡。接通电源，使恒流80mA连续转移2h，切断电源。转膜结束后，用丽春红S染色液(10X丽春红S贮存液配制方法为称取丽春红S 2g，三氯乙酸30g，璜基水杨酸30g，加水至100ml;用时按照1 10的比例用用去离子水稀 释)确定蛋白条带位置，做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜(称取脱脂奶粉5g， 溶于 0. lmol/LPBST (NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4. 1. 44g, KH2PO4. 0. 44g, Tween-200. 05ml，补 ddH20至1L，pH7. 2 7. 4) 100ml)，4°C封闭过夜。用封闭液稀释单抗6E10 (Sigma)，浓度一 般为0. 2 1 μ g/ml，于4°C孵育12 14h，或于20 37°C孵育2h。用0. lmol/L PBST洗 涤硝酸纤维素膜4次，每次5 lOmin。用PBS稀释HRP标记的二抗，稀释度为1 1000， 室温孵育lh。用0. lmol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5min。按照PIERCE化学发 光试剂盒说明，将A液和B液等体积混合，加在硝酸纤维素膜上，2 5min后，用X光片曝光 显影，观察结果。用Quantity One software (BIO-RAD)软件进行条带半定量。3、实验结果组装Os时样品内的蛋白条带位于6. 5kD下方附近约4kD的位置，这是对A β 42单 体化以后的结果，见图1和图2的第1泳道。组装24h时样品内的蛋白条带位于16. 5kD下 方附近约15kD的位置，这是对A β 42寡聚体的位置，可能是3 4聚体的位置，见图2的第2泳道。4、结论通过基因重组的方法获得了 A β 42单体，约4kD左右，分子量大小符合。在体外组 装后获得了 A β 42寡聚体，约15kD左右。并别这些蛋白能够被抗人A β单抗6Ε10特异性 识别，说明其具有正确的免疫反应性。实施例4透射电镜检测1、实验目的从形态上验证获得了 A β 42寡聚体。2、实验方法以铜网正面吸附样品1.5min，吸去铜网上过量的样品。将铜网正面贴附于 PH6.8的磷钨酸lmin，然后吸去铜网上多余的磷钨酸，将铜网置室温干燥。利用透射电镜 TECNAI12 (FEI，Eindhoven, Netherlands)在加速电压100KV，放大倍数为5-11万倍的条件 下观察。3、实验结果结果显示，体外组装24h时，寡聚体最稳定。在透射电镜下，观察到从5nm到IOnm 左右的球形、颗粒状无定形结构，见图3A。此外，可以观察到这种小颗粒进一步聚集，形成直 径约5-lOnm，长约20-30nm的卷曲分支样结构。未观察到丝状、棒状长短不同的纤维状结 构。但是，24h之后，就进入快速纤维化的过程。在透射电镜下，观察到丝状和分枝状的纤维 结构，见图3B。4、实验结论本方法制备的Αβ 42寡聚体具有正确的超微形态特征。实施例5圆二色谱检测1、实验目的从分子二级结构上验证获得了 A β 42寡聚体。2、实验方法取体外组装的Aβ 42寡聚体，进行圆二色谱(Circular dichroism, CD)检测。CD 色谱仪为JASC0-J700SpectrOpOlarimeter(中科院生物物理研究所大分子国家重点实验 室)。扫描条件范围240 190nm，石英杯径1mm，灵敏度5m° /cm，分辨率0. 5nm，狭缝lnm， 时间常数8sec，扫描速度5mm/min，每个样品累计3次。测定温度为室温，以同种离子条件 的缓冲液作为参比。3、实验结果结果发现，在本研究的实验体系中，在0s、8h、和12h抽取的样品检测到正峰，代表 其二级结构以α-螺旋结构为主；从24h的样品中检测到明显的负峰，提示形成了 β-折 叠，见图4。4、实验结论本方法制备的A β 42寡聚体具有正确的二级结构特征。
权利要求
一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将Aβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，于4℃置于缓冲体系中反应22～26小时，使其自然聚合形成寡聚体；所述缓冲体系组成是NaCl 125mmol/L，KCl 3.3mmol/L，KH2PO4 1.2mmol/L，NaHCO3 26mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，MgSO4 2.4mmol/L，葡萄糖5mmol/L，氨基酸0.3g/L。
2.权利要求1所述的方法，所述Aβ多肽的单体是用基因重组的方法得到淀粉样肽单体。
3.权利要求1所述的方法，反应时间为24小时。
4.权利要求1或2所述的方法，所得的寡聚体是在透射电镜下观察直径IOOnm以下的 球形颗粒物，分子量为16 40kD。
5.一种基因重组制备Αβ多肽的单体的方法，在N端加组氨酸标签组6XHis，C端加 终止子序列TGA，构建A β 42单体表达载体，在大肠杆菌表达体系内表达，用Ni柱纯化目的 多肽；然后于室温下将A β 42单体溶于冰预冷1 2h的六氟异丙醇，通过送风挥发，完全除 去六氟异丙醇，形成肽膜。
6.一种人工脑脊液，其组成是NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L, NaHCO3 26mmol/L, CaC12 2. 5mmol/L, MgS04 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L。
7.权利要求1所得到的低分子量淀粉样肽寡聚体在制备诊断、预防和治疗阿尔茨海默 病的药物、试剂中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征是将权利要求1所得到的低分子量淀粉样肽寡聚体 作为标准品，分别利用酶联免疫吸附试验、Western blot实验、透射电镜或CD实验方法，分 别制备检测阿尔茨海默病的试剂。
全文摘要
一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途，其特征是将基因重组方法得到的Aβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，置于缓冲体系中反应，使其自然聚合形成寡聚体。本发明提供的基因重组得到单体的方法经济、环保；以Aβ为原料在体外组装淀粉样肽寡聚体时，通过模拟体内生理条件，改良人工脑脊液组成，所得产物稳定均一。本方法制备的寡聚体可以作为多种阿尔茨海默病检测和治疗研究的标准参照物，在制备阿尔茨海默病诊断试剂和治疗药物中获得应用。
文档编号G01N30/00GK101948523SQ20101026425
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者张莹, 彭向雷, 洪涛 申请人:北京交通大学