专利名称：一种提高番茄类胡萝卜素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种番茄类胡萝卜素含量的方法，尤其涉及一种通过表达隐花色素基 因提高番茄类胡萝卜素含量的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，其主要成分是含40个碳(C)的类异戊 烯聚合物，即四萜化合物。类胡萝卜素普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中的黄 色、橙红色或红色的色素之中。类胡萝卜素可以抑制人体与衰老有关的疾病，减少某些癌症的发病率[1]。多食 用富含类胡萝卜素的食物如水果、蔬菜等可减少与老化有关的疾病如冠心病(Coronary heartdisease)、老年个生黄斑退化症(age-related macular degeneration,AMD)、白内障等 疾病的发病率。研究表明，如果人体摄取的类胡萝卜素不足而导致体内类胡萝卜素的整体 水平下降，会更容易患退化性疾病[2]。而番茄红素是目前被认为在降低这类疾病的发病率 上最有功效的[3’4]。另外，类胡萝卜素摄取量或在血液中的含量与白内障的发病率呈负相 关，当摄取大量叶黄素和玉米黄质时患白内障的风险会降低，但其他类胡萝卜素则无此功 效[5]。类胡萝卜素就被认为具有抗癌作用，Block等人研究了 172例有关富含类胡萝卜素 的水果和蔬菜的食用和吸收与人们患癌症的机率的关系，表明吸收功能差的人患某些癌症 (肺癌、喉癌、口腔癌、食管癌、胃癌、肠癌、直肠癌、膀胱癌、宫颈癌和卵巢癌)的机率是吸收 功能好的人的2倍左右[6]。研究表明，类胡萝卜素能够在细胞水平上抑制肿瘤细胞的增殖， 如它可以抑制白血病细胞、神经角质瘤细胞的发生和生长[7]。不同的类胡萝卜素抑制肿瘤 细胞繁殖的活性不同，其中番茄红素的抑制癌细胞增殖效果最好。在患有子宫内膜癌、乳腺 癌和肺癌的人体内注射番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，癌细胞都得到了有效抑制， 但是要达到相同的抑制效果，α-胡萝卜素需要四倍于番茄红素的注射量，β-胡萝卜素需 要10倍于番茄红素的注射量[8]。多项流行病学研究显示，多摄取番茄及富含番茄红素的 其他食物与多种癌症如消化道癌、膀胱癌、皮肤癌、乳腺癌、子宫颈癌的发病率呈负相关性。 现在已有多个实验室的研究证明在组织细胞培养实验中番茄红素可抑制癌细胞生长[9]。 β-胡萝卜素等类胡萝卜素在人体内具有维生素A前体(Provitamin Α)的活性，人体内缺 乏维生素A，会使角膜脱落、增厚和角质化，轻者会导致夜盲症，重者引起角膜溃疡、晶体脱 落以致失明。另外，维生素A的缺乏还会损害上皮组织细胞的生长与分化，使皮肤变厚、干 燥、或发生皱纹，因此维生素A可以治疗皮肤角化症[1°]。番茄红素等类胡萝卜素能防止动 脉粥样硬化的发生，降低冠心病的发病率。它还能阻止IDI-胆固醇氧化物之形成，以防止 心血管疾病之发生[11]。类胡萝卜素作为抗氧化剂还能防止类脂的过氧化作用，从而保护卵 泡和子宫的类固醇生成细胞不被氧化[12]。类胡萝卜素在自然界中广泛存在，高等植物、藻类和少数微生物的体内都含有类 胡萝卜素。在人体中存在的主要有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红 素以及隐黄素等。类胡萝卜素是人体必不可少的一类物质，但人体不能自行合成类胡
3萝卜素，只能从外界摄取这些物质[13]。目前人们获取类胡萝卜素的途径主要有3种化学 合成方法、微生物发酵法和直接从植物中提取。化学合成法已经比较成熟，但是化学合成的 类胡萝卜素不具有天然类胡萝卜素那样的生理和药理功能，而且，随着毒理学和分析检测 技术的发展，合成色素的安全性也受到质疑。微生物发酵途径只能生产胡萝卜素、虾青 素等少数几种类胡萝卜素，远远不能满足当前的需求。相比之下，直接从植物中提取类胡萝 卜素活性高、安全可靠，而且利于规模化生产。然而植物中类胡萝卜素的含量有限，所以培 育高类胡萝卜素含量的蔬菜和水果有重要的应用价值。番茄富含类胡萝卜素，是人们摄取类胡萝卜素的重要来源，在番茄成熟过程中其 类胡萝卜素含量增加10至14倍，其中以番茄红素的积累为主。在成熟的番茄果实中，番茄 红素含量占总类胡萝卜素的70%左右[14]。从番茄中提取番茄红素是目前世界上生产天 然番茄红素的最主要的途径。据有关资料报导，目前全球每年大约消耗西红柿7000万吨用 于番茄红素的提取。近年来，番茄红素的生产有了长足的发展，但仍不能满足市场需求。特 别是当今在人们更加注重天然植物的活性成分对疾病的预防作用，更注重饮食对健康的重 要性的形势下，使得番茄红素等类胡萝卜素越来越受到人们的普遍关注。因此提高番茄中 番茄红素或其它类胡萝卜素的含量将有重要的应用价值。隐花色素(cryptochrome，CRY)是生物体内的一类吸收蓝光和近紫外光的光受 体，它与修复被紫外光(UV)照射后受损的DNA的光裂解酶具有很高的同源性，是一种黄 素蛋白。植物的隐花色素家族调控植物的光形态建成，包括抑制下胚轴伸长、刺激子叶扩 展、调节开花时间、引导昼夜节律时钟等。已有研究表明，在拟南芥中过量表达拟南芥的 CRY1\CRY2基因后，引起植株下胚轴缩短，叶绿素、花青素及类黄酮的合成增加等一系列 的反应。同时，在拟南芥中过量表达拟南芥CRY1\CRY2基因的C末端和GUS的融合基因 (⑶S: :CCT1\OTS: :CCT2)后，植株呈现组成性光形态建成，无论在黑暗或是光照条件下，下 胚轴的伸长受到抑制，叶绿素、花青素、类黄酮的合成增加等。在番茄中过量表达番茄的 CRY2基因，植株矮化，分枝增多，叶片中叶绿素、花青素的合成增加，特别是番茄果实中类胡 萝卜素、类黄酮的含量提高。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键 酶的基因被陆续分离鉴定，这为进一步利用基因工程途径提高作物中类胡萝卜素含量创造 了条件。然而在可检索的现有技术中，通过表达隐花色素基因提高番茄类胡萝卜素含量的 方法还未见报道。参考文献[1]Rice-Evans CA, Sampson J, Bramley PM and Holloway DE. Why do we expectcarotenoidsto be antioxidants in vivo ？ Free RacL Res,1997,26 :381_398.[2]Mayne ST. β-carotenoids and disease prevention in humans. FASEB J, 1996，10 :690-701.[3]Giovannucci E. Tomatoes, tomato-based products, lycopene and cancer reviewof the epidemiologic literature. Natl, Cancer Inst,1999,91 :317_331·[4]Bramley PM. Is lycopene beneficial to human health ？ Phytochemistry, 2000,54 :233-236.[5]Brown L,Rimm EB,Seddon JM,Giovannucci EL,Chasan Taber L,SpiegelmanD, Willett WC and Hankison SE. A prospective study of carotenoid intake and riskof cataract extraction in US men. Am. Clin. Nutr, 1999, 70 :517-524.[6]王永华，梁世中.类胡萝卜素的结构和生理功能研究.广州食品工业科技， 2000，16 (04) 1-4.[7]Wolf G. Retionids and carotenoids as inhibitors of carcinogensis and inducersof cell-cell communication. Nutrition Review，1992，50 :270_274.[8]Levy J，Bosin E，Feldman B，Giat Y，Miinster A，Danilenko M，Sharoni Y.Locopeneis a more potent inhibitor of human cancer proliferation than eitheralpha-carotene or beta-carotene. Nutr. Cancer,24,257-266.[9]Organ JF, Sowell A， Swanson CA, Potischman N， Miller R, Schussler N， StephensonJr. HE. Relationship of serum carotenoids, retinal，α -tocopherol and seleniumwith breast cancer risk :results from a prospective study in Columbia， Missouri.Cancer Causes Control，1998，9 :89_97.[10]韩雅珊.类胡萝卜素的功能研究进展.中国农业大学学报，1999，4(01) 5-9.[11]李璐.番茄红素的预防保健作用及其分子生物学机制.长春中医学院学报， 2003，19 (03) -.121-122.[12]李福枝，刘飞，曾晓希，李小龙，张凤琴.天然类胡萝卜素的研究进展.食品工 业科技，2007，28 (09) 227-231.[13] Eugenia Μ. A. Enf issi , Paul D. Fraser and Peter Μ. Bramley. Geneticengineering of carotenoid formation in tomato. Phytochemistry Reviews, 2006,2 :59-65.[14]李京，惠伯棣，裴凌鹏.番茄果实在成熟过程中类胡萝卜素含量的变化.中国 食品学报，2006，6 (02) 122-125.
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种在番茄果实中提高番茄类 胡萝卜素含量的方法，实现转基因番茄果实中番茄红素及总的类胡萝卜素的含量较大幅度 的提高。本发明所述的在番茄果实中提高番茄类胡萝卜素含量的方法，步骤包括(1)构 建隐花色素基因l(cryl)、隐花色素基因1羧基端(GUS::CCT1)和隐花色素基因2羧基端 (GUS :CCT2)的过量表达载体；(2)植物的转化；(3)转基因番茄果实的获得；(4)转基因番 茄的PCR检测和Western Blot验证；(5)转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的测定。其中所述构建隐花色素基因1(GFP::CRY1)、隐花色素基因1羧基端(⑶S::CCT1) 和隐花色素基因2羧基端(GUS::CCT2)的过量表达载体的方法是通过花椰菜花叶病 毒(CaMV)35S启动子构建cryl基因和绿色荧光蛋白标签(GFP tag)的过量表达载体 GFP: :CRY1 ；通过花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和β-葡糖醛酸糖苷酶(⑶S)构建cryl 基因羧基端和cry2基因羧基端的⑶S: :CCT1和⑶S: :CCT2过量表达载体；其中，所述cryl 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述cryl基因羧基端(CCTl)的核苷酸序列如SEQID No. 2所示；所述cry2基因羧基端(CCT2)的核苷酸序列如SEQID No. 3所示。所述植物的转化方法是将带有目的基因的植物表达载体(GFP::CRY1)、 (⑶S::CCT1)和(⑶S::CCT2)通过农杆菌侵染的方法转化番茄植株。所述转基因番茄果实的获得是收获第二代的转基因番茄纯合体的果实。所述转基因番茄的Western Blot验证方法是用CRYl和CRY2的抗体作为一抗， 用碱性磷酸酶作为二抗的免疫印迹杂交检测。所述转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的测定方法是将获得的转基因番茄种子 研磨，经过丙酮石油醚提取液反复提取，无水硫酸钠脱水，乙酸乙酯溶解步骤后，用高效液 相色谱(HPLC)测定其中类胡萝卜素的含量。上述提高番茄类胡萝卜素含量的方法是在番茄中过量隐花色素基因1((^1)、隐 花色素基因1的羧基端和隐花色素基因2的羧基端调高番茄类胡萝卜素的含量。上述番茄植株品种优先选用野生番茄或美国品种Money maker。类胡萝卜素是人体必不可少的一类物质，具有抗氧化、免疫调节、延缓衰老和抗癌 等功效。但人体不能自行合成类胡萝卜素，只能从外界摄取这些物质。目前直接通过化学 合成法人工合成的类胡萝卜素不具有天然类胡萝卜素那样的生理和药理功能，而且合成色 素的安全性也受到质疑；利用微生物发酵的途径也只能生产胡萝卜素、虾青素等少数 几种类胡萝卜素，远远不能满足当前的需求。直接从植物中提取类胡萝卜素活性高、安全可 靠，然而植物中类胡萝卜素含量有限，所以培育高类胡萝卜素含量的蔬菜和水果有重要的 应用价值。本发明以番茄为受体植物，采用构建隐花色素基因l(cryl)、隐花色素基因1羧基 端(⑶S::CCT1)和隐花色素基因2羧基端(⑶S::CCT2)的过量表达载体，番茄的遗传转化， 转基因植株的Western检测，转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的测定等方法，成功实现 了一种在番茄果实中提高番茄类胡萝卜素含量的方法，实现转基因番茄果实中番茄红素及 总的类胡萝卜素的含量得到了较大幅度的提高，最大可分别提高3. 6倍和3. 4倍。本发明的突出优点是(1)番茄是深受全世界人民喜爱的一种营养丰富的蔬菜和水果，番茄中富含番茄 红素、胡萝卜素、维生素、矿物质等营养成分，提高类胡萝卜素的含量可以增加番茄产品的 附加值。(2)类胡萝卜素在番茄果实中高水平积累，在其成熟过程中类胡萝卜素含量可以 增加10至14倍，其中以番茄红素的积累为主。本发明可以将番茄果实中番茄红素和类胡 萝卜素的含量分别提高3. 6倍和3. 4倍，使得从番茄中提取天热的番茄红素将更高效。(3)番茄栽培面积广、产量高、生产容易，而且从番茄果实中提取类胡萝卜素的方 法简单、易操作、成本低。
图1隐花色素基因1 (cryl)、隐花色素基因1羧基端(⑶S: :CCT1)和隐花色素基因 2羧基端(⑶S::CCT2)的过量表达载体构建图。图2番茄再生体系的建立。图3农杆菌介导的番茄遗传转化体系；其中A 抗生素筛选培养基上的再生小苗；B 再生小苗生根；C 转化苗的移栽；D 获得的转基因番茄植株。 图4转基因番茄的PCR鉴定；其中:M,分子量标准；1-13，转基因植株；14，野生型； 15，正对照。图5Western blot鉴定；其中A =CRYl在转基因植株中的表达；B :CRY2在转基因 植株中的表达。图6转基因番茄的表型分析；其中A 叶片腹面的颜色比较；B 叶片背面的颜色 比较；C 未成熟果实的颜色比较；D 成熟果实的颜色比较。
具体实施例方式以下结合实例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例1构建隐花色素基因1 (cryl)、隐花色素基因1羧基端(GUS: :CCT1)和隐花 色素基因2羧基端(⑶S: :CCT2)的过量表达载体。根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)中拟南芥隐花色素基因cryl (基因登录 号AY124863. 1)和cry2(基因登录号NM_100320. 3)设计引物。提取拟南芥总RNA，RT-PCR 的方法从拟南芥中扩增得到cryl、CCTl、CCT2的序列(见序列表)。如图1所示，改造植物 表达载体PBI121，用绿色荧光蛋白标签(GFP tag)基因替换其β _葡糖醛酸糖苷酶(⑶S)， 将CRYl基因正向连接到花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子的后面，构建入植物表达载体 ΡΒΙ121中，得到植物表达载体GFP: CRYl ；将CRYl基因的羧基端和CRY2基因的羧基端分 别正向连接到ΡΒΙ121载体花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子的后面，构建⑶S: :CCT1和 ⑶S: :CCT2过量表达载体(图1)。实施例2植物的转化一、番茄组培再生体系的建立将番茄种子用次氯酸钠消毒10分中，用无菌水冲洗5遍，种植在1/2MS培养基上， 在25°C培养室中萌发6天，当幼苗的子叶完全伸开，真叶刚刚出现时，剪取幼苗的子叶或下 胚轴，放在再生培养基上培养。1个月后，当外植体上长出明显的小芽时，将外植体连同小芽 移到伸长培养基上。当再生芽长到Icm左右时，将小芽剪下，置于生根培养基上，诱导生根。 当根的长度在Icm左右时，将再生苗移到土壤中。通过培养基、培养条件的优化以及外植体的妙龄的选择，番茄的再生频率可以达 到90%以上，该再生系统适于多个番茄品种的再生，如野生番茄，美国品种Money maker,我 国栽培品种中蔬4号等(图2)。再生芽的生根率可达100%。二、根癌农杆菌介导的番茄外植体的遗传转化利用农杆菌介导的转化体系，将不同载体转入番茄，经卡那霉素筛选获得抗性小 苗(图3)，具体实验步骤如下(1)快速将_70°C储备的菌液转入YEB筛选培养基上，28°C培养24_48小时；(2)挑选生长良好的单克隆转入20ml YEB筛选培养基上，28°C摇床转速250rpm培 养过夜；检测菌液OD值，最适OD6tltl = 0. 6-0. 7 ；如果OD6tltl > 1. 0，稀释OD6tltl低于0. 5再培养一个小时，定期检测OD值；(3)将菌液在常温转速6000rpm离心IOmin ；菌液沉淀用IOml MSO液体培养基冲 洗两次；没有必要重悬沉淀，每次清洗后6000rpm离心5min ；
(4)清洗后的菌液沉淀用IOml MSO液体培养基重悬，稀释到OD6tltl = 0. 3-0. 4 ；(5)在IOml MSO培养基菌液离心管中加入18. 5ul 0. 2M的乙酰丁香酮；1小时左 右农杆菌就会聚集，因此菌液应该立即使用；(6)用灭过菌的5ml移液枪将IOml菌液吸到在预培养培养基上预培养1_2天的子 叶外植体上；(7)子叶外植体在菌液中处理lOmin，其间时常摇晃菌液；(8)将多余的菌液用移液枪移出；将子叶外植体用刀刃转移入一新的含有滤纸和 共培养培养基的90mm培养皿中(滤纸事先放入培养皿上)。每盘放置大约20个子叶；培 养皿用封口膜封好；(9)培养皿于28°C培养箱中放置2天(16h光照/8h黑暗)；(10)将子叶外植体转入后培养培养基(不带滤纸)，培养基中添加不同浓度的头 孢霉素150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L。观察不同浓度的头孢霉素对农杆菌 的抑制效果；每盘10-20个子叶以预留出生长空间；(11)培养皿用封口膜封好，于24°C培养箱中放置10天(16h光照/8h黑暗)；(12)第10天，将子叶转入新鲜的分化培养基，之后，每隔2-3周继代一次。三、生根(1)当幼苗长至2cm且至少包含一个节点时从外植体上切除下来(不包含愈伤)； 将幼苗转入含40ml生根培养基(加0. 5mg/L IBA, 25mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素) 的IOOml三角瓶内培养；(2)根会在2周左右开始出现。当幼苗长到足够大时就转入含蛭石与土的栽培钵 内进行培养，并浇营养液；(3)转入栽培钵中的小苗可在普通的培养室内生长。为防止小苗萎蔫，将小苗放入 方形的塑料盆中并用地膜覆盖。2-3天后当小苗坚挺后可以逐步掀开地膜，1周后将地膜撤 掉。之后，植株被移入大盆的土中并置于温室培养，称之为TO代。实施例3转基因番茄果实的获得收获番茄种子，种植并获得第二代种子，提取DNA进行PCR检测和Western杂交， 验证转基因植株，收获得T2代纯合体的果实。实施例4转基因番茄的PCR检测和Western Blot验证一、转基因番茄的PCR检测番茄基因组DNA的提取将番茄叶片放入1. 5ml离心管中，加入100 μ 1 DNA提取 液，研磨；加入300μ 1 DNA提取液，冲洗研磨棒；涡旋20Sec ； 13000rpm室温离心5min，将上 清转到新的离心管中；加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒5-6次，混勻；室温静止5min;室 温13000rpm离心IOmin ；倒掉上清，加入500 μ 1 70%的乙醇，涡旋；室温离心5min，倒掉上 清，室温凉干，加100 μ 1 TE (含0. 5 μ 1 RNase)溶解DNA0以(GUSF :5’ GGGCAGGCCAGCGTATCGTG 3，，GUSR :5’ GTCCCGCTAGTGCCTTGTCCAGTT 3，)为引物，番茄基因组DNA为模板，PCR扩增⑶S基因。反应程序如下模板DNA lyL,2x pfumix 10.0yL，(iUSF(10um)0.5yL，(;USR(10um)0.5yL，ddH208.0yL。在 PCR 仪(TaKaRa TP650)上设置 94°C 5min,随后 94°C 50s, 58°C 45s, 72°C 2min,共 30 个循环后 72°C 7min 结 束反应。
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以(NPT II-F 5' GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG 3 ‘ , NPT II-R 5，GGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC 3，)为引物，番茄基因组DNA为模板，PCR扩增GUS基 因。反应程序如下模板 DNA 1 μ L,2x pfu mix 10. OyL, NPT II-F(IOum)0. 5 μ L, NPT II-R(IOum)O. 5 μ L，ddH208. 0 μ L。在 PCR 仪(TaKaRa TP650)上设置 94 "C 5min,随后 940C 50s，54°C 45s, 72°C 2min，共 30 个循环后 72°C 7min 结束反应。取上述PCR反应的产物5 μ L经1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。结果见 图4。二、转基因番茄的Western Blot鉴定番茄总蛋白的提取取野生和转基因番茄叶片，称重，在研钵中用液氮研磨； 根据重量(1克样品加入3. 5ml提取液)，加入预冷的提取液(Tris-HCl，Glycerol, Polyvinylpolypryrroordone)，混勻在冰上静止 3-4 小时；12000rpm，4°C离心 20 分钟；取 上清；用BCA法蛋白质定量试剂盒定量。制备12%的SDS-PAGE胶，加入提取的总蛋白，电泳；电泳结束后拆下电泳板，将胶 切角，切去点样孔，用转膜液平衡3次，每次5分钟，同时将PVDF膜剪成胶的大小，在甲醇中 润洗；电转膜(北京六一转膜仪，2h，100V)；转膜后用PBS洗膜3次，每次15分钟；用5%的 脱脂奶粉4°C浸泡包被2小时；取出膜，用PBS洗膜2次，每次10分钟；加入一抗，室温培养 2h ；弃一抗，用PBS洗膜4次，每次5分钟；加入碱性磷酸酶的二抗，室温摇2h ；弃二抗，加入 显色液显色。结果见图5。实施例5转基因番茄的表型分析和类胡萝卜素含量的测定一、转基因番茄果实的表型分析观察转基因番茄植株与对照植株它们的生长情况，结果发现，转基因番茄植株的 叶片较对照植株的叶片均呈现更深的绿色，叶脉的颜色也更深。与叶片类似，转基因番茄植 株的果实与对照植株相比，无论是在未成熟的绿色果实阶段还是在成熟的红色果实阶段， 着色更深(图6)。二、转基因番茄类胡萝卜素含量的测定称取3g样品，液氮中研成粉末，迅速转移到离心管中，加入30ml丙酮石油醚 (1 2)提取液，常温条件下提取Ih ;12000rpm离心3min，留取液相，重复三次，合并提取 液，35°C减压蒸干，加入石油醚溶解，加等体积10% KOH-甲醇溶液，皂化3h，加等体积的 10% NaCl使之分层，取石油醚相，水相用石油醚反复提取至醚相无色，合并石油醚相，蒸馏 水洗至中性；无水Na2SO4脱水10min，35°C减压蒸干，乙酸乙脂溶解，高效液相色谱(HPLC) 法测定其中类胡萝卜素的含量。测定结果见表1和表2。表1转基因的野生番茄植株成熟果实中类胡萝卜素的含量(ug/g)基因型
类胡萝卜素wiId typeCRYlGUS::CCT1株系Wl株系Al株系Α4株系Α5株系Dl株系D2株系D5ζ-胡萝卜素2·23±0· 859. 75±1.103. 05±0. 0912±0. 9524±4. 6617±2.313.94±0. 95链孢红素16±1. 1232±2· 3025±2. 2330±1.8142±8. 0142 ±6. 7821±1.86番茄红素150±13562±23293 ±19458 士 31439±17550±29320±11β-胡萝卜素13±0· 908. 15±1.1414 ±1. 438. 75 土α8612±1. 3414 土 3. 1010±1. 95叶黄质1. 88±0. 110. 76±0.051.47±0. 10ι.9 土 α351.64±0. 130. 06±0. 011.28±0. 68紫黄质0. 73 士 0. 090. 22 土 0.010. 37±0. 090. 38±0.060. 80±0. 010. 94 ±0. 090. 43 ±0. 17玉米黄质1. 00±0. 030. 25 士 0.030. 65±0. 030. 57±0.010. 70±0. 020.祁 ±0. 050. 49±0. 22类胡萝卜素总量187±11614±32342±17512 + 31531±27627±53359±46表2转基因的Moneymaker植株成熟果实中类胡萝卜素的含量(ug/g)
基因型
类胡萝卜素 wildtypeGUS::CCTlGUS: :CCT2
株系Ml株系Β3株系Β4株系Β7株系Cl株系C3株系C5ζ -胡萝卜素0. 85±0.115. 71±1.617. 63 ±2. 186.38±1.085.45±1, 318. 34 ±0. 996. 67±0.77链孢红索19±0. 9724 士 3. 5323±2· 5625±5. 5122±3· 3031±2.8924±4. 13番茄红索239±24341 士 55303 土 22296 ±18239 土 7. 90423±8. 01301 土 10β-胡萝卜素1.93±0.093. 59±0.976. 26 ±0. 994. 50±1.033. 25±1. 016. 22 ±0· 864. 88 ±0.69叶黄质0. 38±0.100. 63 ±0.190. 56 ±0. 080.48±0.190.65 士 0. 130. 78 ±0. 170. 50 ±0.21紫黄质0. 10±0.030. 15 ±0.010. 31±0. 050. 25±0.040. 09±0. 010. 21±0. 050. 30±0.03玉米黄质0.04 土 0.010. 10±0.030. 05 ±0. 020. 06±0.010. 02±0. 010. 16±0· 070. 2C±0.05类胡萝卜素总量261±18374±35341 士 43333±29271±6. 93470 土 15338±17 由以上两表可以看出过量表达CRYl的番茄植株，ζ _胡萝卜素，链孢红素和番茄 红素的含量与对照植株相比有较大提高，而紫黄质、玉米黄质的含量减少，β-胡萝卜素、叶 黄质的含量变化不明显，总的类胡萝卜素含量提高了 1.8-3. 3倍。过量表达⑶S::CCT1的 野生番茄植株，胡萝卜素，链孢红素和番茄红素的含量提高，胡萝卜素、紫黄质的含 量变化不明显，叶黄质、玉米黄质的含量减少。总的类胡萝卜素含量提高了 1.9-3. 4倍。过 量表达⑶S:: CCTl的Moneymaker植株，ζ -胡萝卜素的含量提高了 6. 7-9倍，β -胡萝卜素 的含量提高了 1.9-3. 2倍，链孢红素、番茄红素、叶黄质的含量稍有提高，与对照相比差异 不显著。紫黄质、玉米黄质的含量提高。过量表达⑶S:: CCT2的Moneymaker植株，ζ-胡 萝卜素的含量提高了 6. 4-9. 8倍，β-胡萝卜素的含量提高了 1.7-3. 2倍，链孢红素、番茄红 素、叶黄质和总的类胡萝卜素含量Cl、C5株系与对照相比变化不明显或无变化，C3株系提 高程度较大，番茄红素的含量较对照相比提高了 1.8倍，总的类胡萝卜素含量也提高了 1.8 倍。
权利要求
一种提高番茄类胡萝卜素含量的方法，步骤包括(1)构建隐花色素基因1(cry1)、隐花色素基因1羧基端(GUS::CCT1)和隐花色素基因2羧基端(GUS::CCT2)的过量表达载体；(2)植物的转化；(3)转基因番茄果实的获得；(4)转基因番茄的PCR检测和Western Blot验证；(5)转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的测定；其特征是所述构建隐花色素基因1(GFP::CRY1)、隐花色素基因1羧基端(GUS::CCT1)和隐花色素基因2羧基端(GUS::CCT2)的过量表达载体的方法是通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子构建cry1基因和绿色荧光蛋白标签(GFP tag)的过量表达载体GFP::CRY1；通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和β 葡糖醛酸糖苷酶(GUS)构建cry1基因羧基端和cry2基因羧基端的GUS::CCT1和GUS::CCT2过量表达载体；其中，所述cry1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述cry1基因羧基端(CCT1)的核苷酸序列如SEQID No.2所示；所述cry2基因羧基端(CCT2)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述植物的转化是将带有目的基因的植物表达载体(GFP::CRY1)、(GUS::CCT1)和(GUS::CCT2)通过农杆菌侵染的方法转化番茄植株；所述转基因番茄果实的获得是收获第二代的转基因番茄纯合体的果实；所述转基因番茄的Western Blot验证方法是用CRY1和CRY2的抗体作为一抗，用碱性磷酸酶作为二抗的免疫印迹杂交检测；所述转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的测定方法是将获得的转基因番茄种子研磨，经过丙酮石油醚提取液反复提取，无水硫酸钠脱水，乙酸乙酯溶解步骤后，用高效液相色谱(HPLC)测定其中类胡萝卜素的含量。
2.根据权利要求1所述提高番茄类胡萝卜素含量的方法，其特征是所述提高番茄类 胡萝卜素含量的方法是在番茄中过量隐花色素基因1 (cryl)、隐花色素基因1的羧基端和 隐花色素基因2的羧基端调高番茄类胡萝卜素的含量。
3.根据权利要求1或2所述提高番茄类胡萝卜素含量的方法，其特征是所述番茄植 株品种选用野生番茄或美国品种Money maker。
全文摘要
本发明公开了一种提高番茄类胡萝卜素含量的方法，是利用基因工程手段构建隐花色素基因1、隐花色素基因1的羧基端和隐花色素基因2的羧基端的过量表达载体，转化番茄，获得转基因番茄。本发明方法实现了转基因番茄果实中番茄红素及总的类胡萝卜素的含量较大幅度的提高，最大可分别提高3.6倍和3.4倍，使得从番茄中提取天然的番茄红素等将更加高效，大大提高了番茄产品的附加值。
文档编号G01N33/53GK101979601SQ201010288489
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者姜娜娜, 洛佩斯·哈维尔, 王兴军, 赵传志 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心