专利名称：一种蜂胶新鲜度的测定方法
技术领域：
本发明属蜂胶检测方法，主要涉及一种蜂胶新鲜度的测定方法，通过测定蜂胶中 β-葡萄糖苷酶活力高低来判定蜂胶的新鲜程度。
背景技术：
蜂胶是西方蜜蜂从植物上采集加工而成的树脂状的复杂产品。现代药理研究表 明，蜂胶具有抗病毒、抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、调节机体免疫功能等多种生物活 性作用，在药品、保健品及化妆品等方面具有广阔的应用前景。蜂胶化学成分复杂，目前已从蜂胶中分离鉴定出的化学成分有黄酮类、萜烯类、醌 类、酯类、醇类、醛类、酚类、有机酸类，还有大量的氨基酸、酶类、维生素类、多糖及多种微量 元素等。尤其是含有大量的类黄酮、酚酸和萜烯类化合物是蜂胶的重要特征。尽管类黄酮类化合物和多酚类相对比较稳定，但在空气中与氧接触会被氧化分 解。有研究表明，随储存时间的延长，蜂胶的主要活性成分(多酚和类黄酮)及生物学活性 明显降低(Bonvehi & Coll，2000)。除了主要活性成分类黄酮外，蜂胶中还含有约10%的 芳香挥发油，蜂胶中挥发油含量虽然不高，但成分相当复杂，发挥着许多药理活性，如抑菌 (Trusheva et al. ,2010 ；Popovaet al. ,2009)，抗真菌(Ota et al. ,2001)等。然而，这些 挥发性成分随储存时间延长会慢慢挥发掉，从而使蜂胶药理活性降低。蜂胶的化学成分复杂，药理活性的发挥是多种成分协同作用的结果，而目前我国 的蜂胶国标仍以总黄酮的高低来确定蜂胶的质量，从而忽视了酚酸及挥发性成分的作用。 蜂胶国家标准中也没有与新鲜度相关的理化指标，而蜂胶从蜂箱中采集后基本在室温下自 然储存，不同储存时间的蜂胶其活性成分组成可能差异很大，这对蜂胶化学成分的稳定性 及产品稳定性不利。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种蜂胶新鲜度的测定方法，是 一种适用于蜂胶原材料，可以测定蜂胶新鲜的方法。为了实现上述的发明目的，本发明的蜂胶新鲜度的测定方法包括从蜂胶中提取 出β -葡萄糖苷酶；对提取出的β -葡萄糖苷酶进行活力测定；根据活力高低来确定蜂胶 的新鲜与否。本发明具体通过以下步骤实现(1)蜂胶中β-葡萄糖苷酶的提取蜂胶捣碎，过30目筛。取蜂胶粉末3. Og加入 25mL pH6. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0. 6g PVPP及少许石英砂。在冰浴上 研磨成糊状。低温高速离心15min，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取 上清液定容至WmL，为粗酶液；(2)取0. 5mL粗酶液，加入0. 5mL 30mM对-硝基β -D-葡萄糖苷(pNPG)混合，混 合液在57°C的水浴锅中温育1.证，加入2. 5mL IM Na2CO3终止反应，冷却至室温后，用分光
3光度计在400nm处测定吸光度。空白对照为混合液立即在100°C水浴中加热5min使酶灭 活，然后加入2. 5mL IM Na2CO3终止反应。(3)根据所测得的β-葡萄糖苷酶活力高低判定蜂胶新鲜度。由于吸光度准确范 围为0. 100 0. 900absU,当吸光度低于0. IabsU时，认为蜂胶中已没有β -葡萄糖苷酶 活力，这样的蜂胶被认为是不新鲜的。葡萄糖苷酶活力以反应所测得的吸光度为单位 (absU)ο新鲜度判定标准蜂胶的新鲜度与所测得的吸光度成正比，吸光度越高，蜂胶越新鲜；吸光度越低， 蜂胶越不新鲜。由于吸光度准确范围为0. 100 0. 900absU,当吸光度低于0. IabsU时，认 为蜂胶中已没有葡萄糖苷酶活力，这样的蜂胶被认为是不新鲜的。本发明提供的方法具有以下优点1、蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力随蜂胶储存温度、储存时间呈现明显的规律性，可 以反应蜂胶在不同储存条件下的新鲜程度。2、该方法灵敏度高，不同产地的蜂胶呈现相似的变化规律。3、方法简单，仪器常见，检测费用低。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步的说明。实施例1分别取-20°C、4°C和室温下储存60天的三个蜂胶样本(分别产自山东、浙江、福 建)，捣碎，过30目筛。分别取蜂胶粉末3.0g，加入25mL pH6. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓 冲液，然后加入0.6g PVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min，上 清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL。 分别取0. 5mL粗酶液，加入0. 5mL 30mM的pNPG。反应混合57°C的水浴锅中温育 1.5h，WA2.5mL IM Na2CO3终止反应。冷却至室温后在400nm处测定吸光度。空白对照为 反应混合液立即在100°C水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL IM Na2CO3终止反应。 测得蜂胶中葡萄糖苷酶反应的吸光度，结果见表1。表1不同储存温度下贮存60天蜂胶中的β -葡萄糖苷酶活力(absU)
-20 "C4 "C室温蜂胶样本10. 5780. 5250. 119蜂胶样本20. 4450. 3890. 086蜂胶样本30. 3670. 3390. 081从表1可见，随着储存时间的升高，蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力逐渐降低。三个不 同的蜂胶样本表现出相同的降低趋势。室温下储存60天的三个蜂胶样本基本没有酶活力。 而-20°C和4°C储存60天的蜂胶样本，酶活力仍较高，因此，蜂胶不宜在室温下长时间保存。实施例2
分别取室温下储存0、10、20、30、45、60、90天的三个蜂胶样本(分别产自山东、浙 江、福建)，捣碎，过30目筛。分别取蜂胶粉末3.0g，加入25mLpH6.0的柠檬酸-磷酸氢二 钠缓冲液，然后加入0. 6gPVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min， 上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL。分别取0. 5mL粗酶液，加入0. 5mL 30mM的pNPG。反应混合57°C的水浴锅中温育 1.5h，WA2.5mL IM Na2CO3终止反应。冷却至室温后在400nm处测定吸光度。空白对照为 反应混合液立即在100°C水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL IM Na2CO3终止反应。 测得蜂胶中葡萄糖苷酶反应的吸光度，结果见表2。表2室温下储存不同时间的蜂胶中的β -葡萄糖苷酶活力(absU)
权利要求
1.一种蜂胶新鲜度的测定方法，其特征在于，采用β-葡萄糖苷酶活力为指标，通过以 下步骤实现(1)从蜂胶中提取β-葡萄糖苷酶取蜂胶粉末，加入ΡΗ6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓 冲液，然后加入PVPP及少许石英砂，在冰浴上研磨成糊状，低温高速离心15分钟，上清液转 移到另一只离心管中，低温高速离心30分钟取上清液定容至25mL，为粗酶液；(2)β -葡萄糖苷酶活力的测定取粗酶液，加入30mM对-硝基β -D-葡萄糖苷混合， 混合液在57°C的水浴锅中温育，加入IM Na2CO3终止反应，冷却至室温后，用分光光度计在 400nm处测定吸光度；(3)根据葡萄糖苷酶活力的大小判定蜂胶的新鲜度当吸光度低于0.IabsU时，认 为蜂胶中已没有葡萄糖苷酶活力，确认蜂胶为不新鲜。
2.根据权利要求书1所述的一种蜂胶新鲜度的测定方法，其特征在于，步骤(2)中空白 对照是将混合液立即在100°C水浴中加热5分钟使酶灭活，然后加入IM Na2CO3终止反应。
3.根据权利要求1或2所述的一种蜂胶新鲜度的测定方法在测定蜂胶新鲜度中的应用。
全文摘要
本发明提供一种蜂胶新鲜度的测定方法，是从蜂胶中提取出β-葡萄糖苷酶；对提取出的β-葡萄糖苷酶进行活力测定；根据活力高低来确定蜂胶的新鲜度，当吸光度低于0.1absU时，认为蜂胶中已没有β-葡萄糖苷酶活力，确认蜂胶为不新鲜。本发明提供的方法根据蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力随蜂胶储存温度、储存时间呈现明显的规律性，可以反应蜂胶在不同储存条件下的新鲜程度；该方法灵敏度高，不同产地的蜂胶呈现相似的变化规律；方法简单，仪器常见，具备实用性，检测费用低。
文档编号G01N21/27GK102128795SQ20101055616
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者张翠平, 柳刚, 胡福良, 郑火青 申请人:浙江大学