专利名称：应用羧酸酯酶显色法快速检测抗性蚊虫的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用羧酸酯酶显色法快速检测抗性蚊虫的试剂盒。
背景技术：
蚊虫由于其特殊的行为、生理特性，成为多种疾病的传播媒介，严重影响了旅游业、饮食业，制约了卫生城市的发展，严重的危害了人类健康。蚊虫的种类繁多，其通过叮咬传播的疾病也比较多，库蚊是丝虫病、乙型脑炎、西尼罗河病毒的主要传播媒介，按蚊是丝虫病和疟疾的主要传播媒介，伊蚊是登革热和乙型脑炎的主要传播媒介(Hemingway J and Ranson H. Insecticide resistance in insect vectors of humandisease[J]. Annu. Rev. Entomo1. 2000,45 :371-391.)。目前主要采取物理防治、化学防治、生物防治(徐承龙，姜志宽.蚊虫防治 (三)-蚊虫防治的原则与方法[J].中华卫生杀虫药械.2006c，12 (6) =494-496.)等方法防止其对疾病的传染，以化学杀虫剂为主的化学防治，以其高效、快速、便捷等优势成为主要的防治方法(王以燕.我国卫生杀虫剂面临的机遇与挑战[J].中华卫生杀虫药械，2009，15(3) :215-216.)。由于大量的使用化学杀虫剂，蚊虫逐渐对有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性(刘维德.我国蚊类抗药性发展动向[J].中国媒介生物学及控制，1990，(1) :41-44.)。蚊虫抗药性主要分为代谢抗药性和靶标抗药性，其中导致代谢抗药性的有三种酶羧酸酯酶(W. G. Brogdon =Comp. Biochem. Physiol. C. 1988, 90, 145-150. ；0. Dary, G. P. Georghiou, E. Parsons and N. Pasteur :J. Econ. Entomol.1990，83，2187-2192. ；C.Brengues, N.J. Hawkes, F. Chandre, L.McCarrol1, S. Duchon, P. Guillet, S. Manguin, J. C. Morgan and J. Hemingway :Med. Vet. Entomo 1. 2003, 17,87-94.)，P450 单加氧酶，谷胱甘肽 S 转移酶(W. G. Brogdon and Α. Μ. Barber Comp. Biochem. Physiol. B1990，96，339-342.)，与抗药性相关的靶标有氨基丁酸受体的突变 (W. Du, T. S. Awolola, P. Howell, L. L. Koekemoer, B. D. Brooke, Μ. Q. Benedict, Μ. Coetzeeand L. Zheng Insect Mol. Biol. 2005,14,179-183. ；R. H. ffrench-Constant, J. C. Steichen and F. Shotkoski :Med. Vet. Entomo 1. 1994，8，99-100.)，乙酰胆碱酯酶的突变，电压门钠离子通道突变(D. Martinez-Torres, F. Chandre, Μ. S. Williamson, F. Darriet, J. B. Berge, A.L.Devonshire, P.Guillet, N.Pasteurand D. Pauron Insect Mol. Biol. 1998,7, 179-184. ；A. Lynd, H. Ranson, P. J. McCal 1, N. P. Randle, W. C. Black, E. D. Walker and M. J. Donnel Iy =Malar. J. 2005，4，16.)。目前对于监测和鉴定蚊虫抗药性，常用方法有4种毒效生物测定法(包括半数致死量法、区分剂量法)、酶测定法、遗传学方法和免疫学方法。其中，WHO生物测定方法 (WHO technical report series，No,818. Vecter resistance to pesticide,1992.62.), 测定蚊虫四龄幼虫对不同杀虫剂的敏感性，计算LC50及抗性指数。区分剂量法，按照世界卫生组织(WHO)及全国蚊虫抗性协作组统一制定的区分剂量法进行，根据死亡率判断抗性级别。为了便于抗性调查和抗性遗传的研究，早在1958年Davidson就提出了 “区分剂量”的概念，此后，大量的抗药性监测工作也使用了区分剂量法(周水森，王漪，汤林华.2005 年全国疟疾形式[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006, :401-403. [2]；李华宪，陈国伟，杨沅川，等.云南省2001 2005年疟疾疫情分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 2008,26(1) :46-49.；陈国伟，李唯本，任志先，等.云南省嗜人按蚊分布区疟疾防治对策研究[J].中国热带医学，2004，4(1) :29-31.)。区分计量法用于检测群体中抗性个体的出现频率，半数致死量法用于衡量群体中大多数个体抗性分布状况，但由于缺乏敏感品系做参照，现场测试不能判断其抗药性水平，只能在不同地区之间进行横向比较(孙养信，岳永杰，佘建军，孙亮，阮春来，安翠红，吕文.陕西省流行性乙型脑炎高发区三带喙库蚊的抗药性研究[J].中国媒介生物学及控制.2009，2(K4) :313-316.)。对于蚊虫有机磷抗性，研究发现，酯酶水平的增加标志着对有机磷药物的抗性增力口 (Singh Y, Khanna H, Chopra AP, Mehra V.A dominant negative mutant ofBacillus anthracis protective antigen inhibits anthrax toxin action in vivo[J]. J Biol Chem,2001, 276(25) :22090-22094. ；Leppla SH. Anthrax toxin edemafactor a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrationsof eukaryotic cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1982,79(10) :3162-3166.)，目前常用检测有机磷抗性的方法的就是微量滴定板法(生物化学方法)，通过酶标仪得出羧酸酯酶的活性水平(李士根.非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性关系的研究[J].中华卫生杀虫药械， 2009，15(4) :269-271.)，借以判断个体蚊虫的抗性状况。这种方法的优点是能得到羧酸酯酶活性的准确值，不足之处是必须借助酶标仪才能完成，在日常生活中较麻烦。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用羧酸酯酶显色法快速检测抗性蚊虫的试剂盒。本发明提供的检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性的试剂盒，包括如下组分 β -乙酸萘酯、固兰B盐、50mM pH7. 0磷酸缓冲液和滤纸。所述试剂盒还可包括显色参比卡；所述显色参比卡上具有如下三个比色区敏感区(比色区 I，淡紫色)的颜色为(C) = (145-155) (R)+ (137-147) (G) + (155-165) (B)，低中抗区(比色区 II，中等紫色)的颜色为(C) = (117-127) (R) + (119-129) (G) + (153-163) (B)， 高抗区(比色区 III，深紫色)的颜色为(C) = (88-98) (R)+ (73-83) (G) + (112_122) (B)。 所述敏感区的颜色具体可为(C) = 150 (R)+142 (G)+160 (B)，所述低中抗区的颜色具体可为 (C) = 122 (R)+1 (G)+158 (B)，所述高抗区的颜色具体可为(C) = 93 (R)+78 (G)+117 (B)。所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液具体可由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。所述滤纸上可具有方格(如边长为Icm的方格)。所述试剂盒具体可由β-乙酸萘酯、固兰B盐、所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液、滤纸和所述显色参比卡组成。所述试剂盒中的各个组分独立包装。所述有机磷杀虫剂可为对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种。所述库蚊可为致倦库蚊。所述试剂盒可用于检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性。所述有机磷杀虫剂可为对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种。
所述库蚊可为致倦库蚊。本发明还保护一种应用所述试剂盒检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性的方法，包括如下步骤(1)在所述50mM ρΗ7· 0磷酸缓冲液中将15只待测蚊虫(如优选成虫)研磨，离心取上清，将100 μ 1上清与100 μ 1所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液混勻，得到蛋白样品；(2)用Iml水(优选蒸馏水)溶解5mg固兰B盐，离心取上清，即为显色剂；(3)用0. 5ml无水乙醇溶解5mg β -乙酸萘酯，取50 μ 1加入150 μ 1无水乙醇和 300 μ 1所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液，得到底物；(4)向滤纸方格位置的中心点滴4μ 1所述蛋白样品，静置1-12分钟(如5分钟)， 再向上述方格的中心点滴2 μ 1所述底物，室温放置10分钟以上，再向上述方格的中心点滴 2μ 1所述显色剂，2分钟之内观察颜色变化，通过与所述显色参比卡对照对待测蚊虫的抗性进行评价。所述有机磷杀虫剂可为对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种。所述库蚊可为致倦库蚊。随着待测蚊虫中酯酶含量的增加，滤纸颜色由粉红逐渐变成紫色，将待测蚊虫显示的颜色与显色参比卡对比即可得到抗性水平。如果与显色参比卡中的比色区I接近，待测样本为敏感品系；如果与显色参比卡中的比色区II接近，待测样本为低、中抗蚊虫；如果与显色参比卡中的比色区III接近，待测样本为高抗蚊虫。已有研究发现，冰冻储存不影响蚊虫体内羧酸酯酶的含量，这样就既可以进行现场测定，也可采集蚊虫带回实验室集中测定(李士根，王霄，谭文彬，甄天民，全芯，高红刚， 刘永春.冰冻储存对淡色库蚊非特异性酯酶活性的影响。中国媒介生物学及控制杂志， 2009，20(3) :187-188)。本试剂盒操作简单，整个反应及显色都在滤纸上进行，快速且灵敏度高，通过与不同抗性倍数的显色参比卡对比即可得到蚊虫对3种有机磷农药的抗性水平，从而得到控制所检测蚊虫的最佳杀虫剂类型及浓度，可随时现场检测蚊虫抗药性水平。本发明利用化学杀虫剂对蚊虫的控制力，通过实验得出针对待测蚊虫最有效的化学杀虫剂的类型及浓度， 为人们在日常蚊虫控制方面提供现场快速检测的方法，这样既解决了因大量杀虫剂的应用而导致蚊虫抗药性增强的问题，也有效降低了杀虫剂对环境的污染和对自然生态平衡的影响。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。β -乙酸萘酯国药集团化学试剂有限公司，产品目录号301276Μ。固兰B盐国药集团化学试剂有限公司，产品目录号70117082。敌敌畏(DDVP)北京市农药检定所62-73-7。对硫磷北京市农药检定所56-38-2。
杀螟硫磷北京市农药检定所122-14-5。致倦库蚊S-LAB品系(敏感品系)；参考文献Feng Cui，Michel Raymond, ArnaudBerthomieu, Haoues Alout, Mylene Weill and Chuan-Ling Qiao.2006. Recentemergence of insensitive acetylcholinesterase in Chinese populations of themosquito Culex pipiens. Journal of Medical Entomology，43。实施例1、显色参比卡的发现将在野外采集的致倦库蚊种群进行多代抗性筛选，抗性筛选的方法(幼虫浸渍法，这是国际通用的方法)如下将三龄末的幼虫放在100毫升的水中，加入一系列梯度的对硫磷，24小时后观察死亡率，计算LC50，将抗性蚊虫与敏感蚊虫S-LAB品系的LC50相比， 即获得抗性倍数。用筛选获得的三种抗性水平的蚊虫进行如下操作1、将成虫放到1. 5ml离心管中，每管15只，2管重复。2、向装有蚊虫的离心管中各加入800 μ 1预冷的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，将蚊虫充分研磨均勻，放在冰浴中。3、于4°C，IOOOrpm离心10分钟，取上清液100 μ 1到一只新的1. 5ml离心管中，同时加入ΙΟΟμ 1预冷的50mM磷酸缓冲液(pH7. 0)充分混勻将其稀释1倍，得到蛋白样品，在冰浴中备用。4、取一支装有5mg固兰B盐的离心管，加入Iml蒸馏水，摇勻，使固兰B盐充分溶解，6000rpm离心，配成显色剂备用，使用时取上清液。5、取一支装有5mg β -乙酸萘酯的离心管，加入0. 5ml无水乙醇，摇勻，使药充分溶解，从中取50 μ 1加到一只新的1. 5ml离心管中，再分别加入150 μ 1无水乙醇和300 μ 1 50mM磷酸缓冲液(pH7. 0)，混勻配成底物备用。6、分别向滤纸方格位置的中心点滴4 μ 1蛋白样品，静置5分钟，再向每个方格的中心点滴2μ 1底物，室温放置10分钟以上，再向上述每个方格的中心点滴2μ 1显色剂，1 分钟之内观察颜色变化并拍照。已知抗性的三种蚊虫分别显示三种颜色，根据三种颜色制作参比卡。实施例2、试剂盒的制备试剂盒由缓冲液、A管(装有5mg β -乙酸萘酯的1. 5ml离心管)、B管(装有5mg 固兰B盐的1.5ml离心管)、具有方格(IXlcm)的滤纸和显色参比卡组成。磷酸缓冲液50mM，pH7. 0 ；由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。显色参比卡具有如下三个比色区1(敏感区)为淡紫色，具体颜色为 (C) = 150 (R)+142 (G)+160 (B), II (低中抗区)为中等紫色，具体颜色为(C)= 122 (R)+1 (G)+158 (B)，111(高抗区)为深紫色，具体颜色为(C) = 93 (R)+78 (G)+117 (B)。如果应用试剂盒检测待测样本显示的颜色与I接近，待测样本为敏感品系。如果应用试剂盒检测待测样本显示的颜色与II接近，待测样本为低、中抗蚊虫(与致倦库蚊 S-LAB品系相比，对硫磷4-8倍抗性和/或敌敌畏10-20倍抗性和/或杀螟硫磷3_6倍抗性)。如果应用试剂盒检测待测样本显示的颜色与III接近，待测样本为高抗蚊虫(与致倦库蚊S-LAB品系相比，对硫磷20-30倍抗性和/或敌敌畏30-60倍抗性和/或杀螟硫磷 20-30倍抗性)。
储存条件本试剂盒在室温(15_25°C )干燥下储存，缓冲液使用前需预冷。实施例3、试剂盒的应用一、试剂盒的应用将采集自不同地域的3组致倦库蚊蚊虫分别用实施例2制备的试剂盒进行检测。1、将蚊虫成虫放到1. 5ml离心管中，每管15只，2管重复。2、向装有蚊虫的离心管中各加入800μ 1预冷的缓冲液，将蚊虫充分研磨均勻，放在冰浴中。3、于4°C，IOOOrpm离心10分钟，取上清液100 μ 1到一只新的1. 5ml离心管中，同时加入100μ 1预冷的缓冲液充分混勻将其稀释1倍，得到蛋白样品，在冰浴中备用。4、取一支B管，少许离心使药聚集到管底，取Iml蒸馏水加到B管中，摇勻，使药充分溶解，BOOOrpm离心，配成显色剂备用，使用时取上清液。5、取一支A管，少许离心使药聚集到管底，取0. 5ml无水乙醇加到A管中，摇勻，使药充分溶解，从中取50 μ 1加到一只新的1. 5ml离心管中，再分别加入150 μ 1无水乙醇和 300 μ 1缓冲液，混勻配成底物备用。6、分别向滤纸方格位置的中心点滴4μ 1蛋白样品，静置5分钟(1-12分钟均可)， 再向上述每个方格的中心点滴2 μ 1底物，室温放置10分钟以上，再向上述每个方格的中心点滴2 μ 1显色剂，2分钟之内观察颜色变化，与显色参比卡对照，即可对蚊虫的抗性进行评价。备注底物和显色剂很易降解，现用现配。第一组蚊虫与显色参比卡中的I接近，待测样本为敏感品系。第二组蚊虫与显色参比卡中的II接近，待测样本为低、中抗蚊虫。第三组蚊虫与显色参比卡中的III接近，待测样本为高抗蚊虫。二、检测结果的验证1、分别检测致倦库蚊S-LAB品系对不同杀虫剂(对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷)的抗性，方法如下将三龄末的幼虫放在100毫升的水中，加入一系列梯度的杀虫剂，24小时后观察死亡率，计算LC50。致倦库蚊S-LAB品系对对硫磷的LC50为0. 0004mg/l。致倦库蚊S-LAB品系对敌敌畏的LC50为0. 027mg/l。致倦库蚊S-LAB品系对杀螟硫磷的LC50为0. 0074mg/l。2、分别检测三组待测蚊虫对不同杀虫剂(对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷)的抗性，方法如下将三龄末的幼虫放在100毫升的水中，加入一系列梯度的杀虫剂，M小时后观察死亡率，计算LC50。第一组蚊虫对对硫磷的LC50为0. 00042mg/l。第一组蚊虫对敌敌畏的LC50为0. 030mg/l。第一组蚊虫对杀螟硫磷的LC50为0. 0083mg/l。第二组蚊虫对对硫磷的LC50为0. 00256mg/l。第二组蚊虫对敌敌畏的LC50为0. 427mg/l。第二组蚊虫对杀螟硫磷的LC50为0. 034mg/l。第三组蚊虫对对硫磷的LC50为0. 01mg/l。
第三组蚊虫对敌敌畏的LC50为1. lmg/1。第三组蚊虫对杀螟硫磷的LC50为0. 187mg/l。3、计算待测蚊虫的抗性倍数待测蚊虫的LC50值倦库蚊S-LAB品系的LC50值即为待测蚊虫对该杀虫剂的抗
性倍数。第一组蚊虫对对硫磷的抗性倍数为1.05。第一组蚊虫对敌敌畏的抗性倍数为1. 11。第一组蚊虫对杀螟硫磷抗性倍数为1. 12。第二组蚊虫对对硫磷的抗性倍数为6. 4。第二组蚊虫对敌敌畏的抗性倍数为15. 8。第二组蚊虫对杀螟硫磷抗性倍数为4. 6。第三组蚊虫对对硫磷的抗性倍数为25。第三组蚊虫对敌敌畏的抗性倍数为40。第三组蚊虫对杀螟硫磷抗性倍数为25。
权利要求
1.检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性的试剂盒，包括如下组分β-乙酸萘酯、固兰B 盐、50mM pH7.0磷酸缓冲液和滤纸。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括显色参比卡；所述显色参比卡上具有如下三个比色区敏感区的颜色为(C) = (145-155) (R)+ (137-147) (G)+ (155-165) (B)，低中抗区的颜色为(C) = (117-127) (R)+ (119-129) (G)+ (153-163) (B)，高抗区的颜色为(C) = (88-98) (R)+ (73-83) (G)+ (112-122) (B)。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述敏感区的颜色为(C)= 150 (R)+142 (G)+160 (B)，所述低中抗区的颜色为(C) = 122 (R)+1 (G)+158 (B)，所述高抗区的颜色为(C) = 93 (R)+78 (G)+117 (B)。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由β-乙酸萘酯、固兰B 盐、所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液、滤纸和所述显色参比卡组成。
5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的各个组分独立包装；所述滤纸上具有边长为Icm的方格。
6.如权利要求1至5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述有机磷杀虫剂为对硫磷、 敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种；所述库蚊为致倦库蚊。
7.权利要求1至5中任一所述试剂盒在检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述有机磷杀虫剂为对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种；所述库蚊为致倦库蚊。
9.一种应用权利要求4或5所述试剂盒检测蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性的方法，包括如下步骤(1)在所述50mMpH7. 0磷酸缓冲液中将15只待测蚊虫研磨，离心取上清，将100 μ 1上清与100 μ 1所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液混勻，得到蛋白样品；(2)用Iml水溶解5mg固兰B盐，离心取上清，即为显色剂；(3)用0.5ml无水乙醇溶解5mgβ -乙酸萘酯，取50 μ 1加入150 μ 1无水乙醇和300 μ 1 所述50mM pH7. 0磷酸缓冲液，得到底物；(4)向滤纸方格位置的中心点滴4μ1所述蛋白样品，静置1-12分钟，再向上述方格的中心点滴2μ 1所述底物，室温放置10分钟以上，再向上述方格的中心点滴2μ 1所述显色剂，2分钟之内观察颜色变化，通过与所述显色参比卡对照对待测蚊虫的抗性进行评价。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述有机磷杀虫剂为对硫磷、敌敌畏和杀螟硫磷中的至少一种；所述库蚊为致倦库蚊。
全文摘要
本发明公开了一种应用羧酸酯酶显色法快速检测抗性蚊虫的试剂盒。本发明的试剂盒包括β-乙酸萘酯、固兰B盐、磷酸缓冲液和滤纸，还包括具三个比色区的显色参比卡敏感区颜色为(C)＝(145-155)(R)+(137-147)(G)+(155-165)(B)，低中抗区颜色为(C)＝(117-127)(R)+(119-129)(G)+(153-163)(B)，高抗区颜色为(C)＝(88-98)(R)+(73-83)(G)+(112-122)(B)。试剂盒操作简单，反应及显色都在滤纸上进行，快速且灵敏度高，与显色参比卡对比可得到蚊虫对有机磷农药的抗性水平，得到最佳杀虫剂类型及浓度，可随时现场检测。本发明既解决了大量杀虫剂应用导致蚊虫抗药性增强的问题，也有效降低了杀虫剂对环境的污染和对自然生态平衡的影响。
文档编号G01N21/78GK102486459SQ20101057502
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者乔传令, 刘斯璐, 刘洋洋, 崔峰, 江红 申请人:中国科学院动物研究所