专利名称：一种基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试纸的制作方法
技术领域：
一种基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试
纸
发明领域本实用新型涉及一种基于多重上转换发光免疫层析技术的试纸，特别涉及一种可 对霍乱弧菌01群与0139群进行同步检测与分型的基于多重上转换发光免疫层析技术的试 纸。
背景技术：
霍乱(Cholera)是由01血清群和0139血清群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起 的急性肠道传染病，是以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征的国际检疫传 染病之一，也是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一，《国内交通卫生检 疫条例》也将其列为检疫传染病。它可以引起散发、流行、暴发、甚至世界性大流行，不仅危 害人民健康，而且影响人民正常生活、生产、旅游、经贸、交通运输、甚至社会安定。根据菌体(0)抗原的不同，目前已将霍乱弧菌分出200个以上的0血清群0) serogroups)，但仅发现01和0139群霍乱弧菌能引发霍乱。1992年以前，仅01群霍乱弧菌 (V. cholerae 01)的两个生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型(El Tor biotype)引发了七次霍乱世界大流行。而对01群以外的其他血清群，统称为非01群 霍乱弧菌(V. cholerae non-01) 0非01群霍乱弧菌广泛分布于自然界水体中，一般不致病 或仅引起散发性腹泻病例和肠道外感染。但1992年10月，印度首次发生了由非01群霍乱 弧菌引起的霍乱大暴发，其病原被鉴定为0139血清群霍乱弧菌(V. cholerae 0139)。这个 新确认的0139群与其他非01群霍乱弧菌最大的不同点在于，它能产生与01群霍乱弧菌相 同的霍乱毒素(Cholera toxin, CT)，所引起的霍乱在临床和流行病学上也与01群霍乱弧 菌所致霍乱基本相同主要通过水引起暴发流行，人感染后，该菌在肠内大量繁殖，造成腹 泻、呕吐、严重脱水，如不医治会造成死亡。此外，0139群霍乱由于抗原发生了变异，人群对 其缺乏免疫力。发病以青壮年为主，男性病例明显多于女性，无明显季节性，冬春季也可引 起暴发流行。由此可见，霍乱弧菌的快速检测，并在检测中对血清型(01群还是0139群) 进行同步的判断，将对霍乱的预防以及霍乱发生后及时有效的控制处理具有重要的意义。目前所使用的常规的霍乱弧菌检测分型技术包括诊断血清玻片凝集试验、PCR、 胶体金试纸等，这些方法有的只能在实验室进行，无法在野外现场使用；有的操作流程较 为复杂历时较长；有的敏感性低、特异性差；有的一次操作只能对一种目标被检物进行检 测，无法检测与分型同步进行。因而急需操作简便、快速、敏感性高、特异性好、检测分型同 步的现场技术。免疫层析技术是经典的现场快速检测技术，操作简便、快速；上转换发光材 料(Up-Converting Phosphor, UCP)是新型的稀土金属晶体光学材料，其独特的物理结构以 及化学组成使其具有绝无仅有的上转换发光现象，即UCP颗粒可由红外光激发、发射可见 光；上转换发光技术(Up-converting Phosphor Technology, UPT)促成了免疫层析技术与 上转换发光材料的结合，即通过一系列表面修饰与活化后将UCP颗粒作为标记物应用于免 疫层析，在红外光照射下以独特的上转换发光现象揭示生物活性分子之间高灵敏度特异性的识别，进而光信号转换为电信号实现了目标被检物的准确定量。若能建立多重上转换发 光免疫层析技术(UPT-based later-flow assay,UPT-LF assay)则可在保证简便、快速、敏 感性、特异性、定量能力的同时实现01群与0139群霍乱弧菌的检测与分型。
实用新型内容为了克服现有技术中存在的缺陷，本实用新型公开一种基于多重上转换发光免疫 层析技术(基于多重UPT-LF)的霍乱检测分型试纸本实用新型的技术方案是一种霍乱检测分型试纸，包括样品垫[1]、结合垫 [2]、分析膜[3]、吸水垫[4]和粘性底衬[5](如附图1所示)。其中，结合垫[2]中固定有 UCP结合物混合物[6]，UCP结合物混合物[6]中包括两种检测结合物和一种质控结合物， 两种检测结合物为UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结 合物[8]，一种质控结合物为UCP-羊IgG结合物[9]；分析膜[3]上设置有检测带Tl [10]、 检测带T2[ll]和质控带C[12]；样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘贴 于粘性底衬[5]上，其中分析膜[3]贴于粘性底衬[5]的中间，吸水垫[4]贴于分析膜[3] 的一侧，两者重合部分为吸水垫[4]长度的1/15-1/6 ；结合垫[2]贴于分析膜[3]的另一 侧，两者重合部分为结合垫[2]长度的1/10-1/5 ；样品垫[1]贴于结合垫[2]的另一侧，两 者重合部分为样品垫[1]长度的1/5-1/2。本实用新型霍乱检测分型试纸的制备方法为A.结合垫[2]的制备将两种检测结合物(UCP-01群霍乱弧菌单抗A结合物[7] 和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8])和一种质控结合物(UCP-羊IgG结合物[9]) 混合，得UCP结合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖 的混合液作为结合物稀释液将UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为ang/ml，将UCP结合 物混合物[6]加于玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，于40°C下烘干1.证，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将1. 5mg/ml 01群霍乱弧菌单抗B、l. 5mg/ml 0139群霍 乱弧菌单抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带 Tl[10]、检测带T2[ll]和质控带C[12]，于37°C下烘干40分钟，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘贴于粘性底衬[5] 上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为4mm宽单独可用的成品，得 本实用新型霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。使用本实用新型霍乱检测分型试纸检测分型霍乱弧菌的方法A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4. 后再进行检测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至上述本实用新型霍乱检测分型试纸的 样品垫[1]上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[12]有信号产生(如附图3A所示)，则样品为01群霍乱弧菌[13]与0139群霍乱弧菌[14]阴性；检测带Tl [10]与质控带C[12]有信号产生(如 附图3B所示)，则样品为01群霍乱弧菌[13]阳性；检测带T2[ll]与质控带C[12]有信 号产生(如附图3C所示)，则样品为0139群霍乱弧菌[14]阳性；检测带Tl [10]、检测带 T2[ll]、质控带C[12]均有信号产生(如附图3D所示)，则样品为01群霍乱弧菌[13]与 0139群霍乱弧菌[14]阳性；检测带Tl[10]、检测带T2[ll]、质控带C[12]均无信号产生， 则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[10]、检测带T2[ll]、质控带C[12]的信号强度(即峰面 积)依次赋值于Tl、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌[13]的检测值，T2/C为0139群霍乱弧 菌[14]的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获 得该样品中01群霍乱弧菌[13]与0139群霍乱弧菌[14]的有无及具体浓度，从而实现定
量检测。本实用新型霍乱检测分型试纸通过将UCP颗粒作为标记物与免疫层析技术相结 合，并将传统的单靶标检测免疫层析试纸拓展为多重检测，最终所建立的基于多重UPT-LF 的霍乱检测分型试纸，具有操作简便、快速、敏感性高、特异性好的特点，可在野外现场实现 样品中01群与0139群霍乱弧菌的定量检测与分型。
图1 本实用新型霍乱检测分型试纸结构图；图2 本实用新型霍乱检测分型试纸粘贴示意图；图3 本实用新型霍乱检测分型试纸结果判读示意图。1、样品垫、2、结合垫、3、分析膜、4、吸水垫、5、粘性底衬、6、UCP结合物混合物、7、 UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物、8、UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物、9、UCP_羊IgG结 合物、10、检测带Tl、11、检测带T2、12、质控带、13、01群霍乱弧菌、14、0139群霍乱弧菌。a、检测结合物、b、质控结合物、c、UCP结合物混合物、d、液体样品流动方向、e、传 感器扫描方向、χ、试纸条位置、y、检测信号。A、01群与0139群阴性样品、B、01群霍乱弧菌阳性样品(检测带Tl阳性)、C、0139 群霍乱弧菌阳性样品(检测带T2阳性)、D、01群与0139群霍乱弧菌阳性样品(检测带Tl 与检测带T2阳性)。
以下结合附图进一步说明本实用新型。
具体实施方式
实施例1 本实用新型霍乱检测分型试纸及其制备方法本实用新型霍乱检测分型试纸的结构组成为样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜 [3]、吸水垫[4]和粘性底衬[5](如附图1所示)。其中，结合垫[2]中固定有UCP结合物混 合物[6]，UCP结合物混合物[6]中包括两种检测结合物和一种质控结合物，两种检测结合 物为UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]，一种 质控结合物为UCP-羊IgG结合物[9]；分析膜[3]上设置有检测带Tl [10]、检测带T2 [11] 和质控带C[12]；样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘贴于粘性底衬[5] 上，其中分析膜[3]贴于粘性底衬[5]的中间，吸水垫[4]贴于分析膜[3]的一侧，两者重合部分为吸水垫[4]长度的1/10 ；结合垫[2]贴于分析膜[3]的另一侧，两者重合部分为 结合垫[2]长度的1/8 ；样品垫[1]贴于结合垫[2]的另一侧，两者重合部分为样品垫[1] 长度的1/4。本实用新型霍乱检测分型试纸的制备方法为A.结合垫[2]的制备将两种检测结合物(UCP-01群霍乱弧菌单抗A结合物[7] 和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8])和一种质控结合物(UCP-羊IgG结合物[9]) 混合，得UCP结合物混合物W]，用pH = 7. 2的0. 03MPB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖 的混合液作为结合物稀释液将UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为2mg/ml，将UCP结合 物混合物[6]加于玻璃纤维上，于40°C下烘干1.5h，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将1. 5mg/ml 01群霍乱弧菌单抗BU. 5mg/ml 0139群霍乱 弧菌单抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测带Tl [10]、检测带 T2[ll]和质控带C[12]，于37°C下烘干40分钟，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘贴于粘性底衬[5] 上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为4mm宽单独可用的成品，得 本实用新型霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。使用本实用新型霍乱检测分型试纸检测分型霍乱弧菌的方法A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4. 5h 后再进行检测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至上述本实用新型霍乱检测分型试纸的 样品垫[1]上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[12]有信号产生(如附图3A所示)，则样品为01群霍乱 弧菌[13]与0139群霍乱弧菌[14]阴性；检测带Tl [10]与质控带C[12]有信号产生(如 附图3B所示)，则样品为01群霍乱弧菌[13]阳性；检测带T2[ll]与质控带C[12]有信 号产生(如附图3C所示)，则样品为0139群霍乱弧菌[14]阳性；检测带Tl [10]、检测带 T2[ll]、质控带C[12]均有信号产生(如附图3D所示)，则样品为01群霍乱弧菌[13]与 0139群霍乱弧菌[14]阳性；检测带Tl[10]、检测带T2[ll]、质控带C[12]均无信号产生， 则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[10]、检测带T2[ll]、质控带C[12]的信号强度(即峰面 积)依次赋值于Tl、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌[13]的检测值，T2/C为0139群霍乱弧 菌[14]的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获 得该样品中01群霍乱弧菌[13]与0139群霍乱弧菌[14]的有无及具体浓度，从而实现定
量检测。
权利要求1. 一种基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试纸，其特征在于该检测分 型试纸的结构组成为样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]、吸水垫[4]和粘性底衬[5]；其 中，结合垫[2]中固定有UCP结合物混合物[6]；分析膜[3]上设置有检测带Tl [10]、检测 带T2[ll]和质控带C[12]；样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘贴于 粘性底衬[5]上，其中分析膜[3]贴于粘性底衬[5]的中间，吸水垫[4]贴于分析膜[3]的 一侧，两者重合部分为吸水垫[4]长度的1/15-1/6 ；结合垫[2]贴于分析膜[3]的另一侧， 两者重合部分为结合垫[2]长度的1/10-1/5 ；样品垫[1]贴于结合垫[2]的另一侧，两者 重合部分为样品垫[1]长度的1/5-1/2。
专利摘要本实用新型基于多重上转换发光免疫层析技术(UPT-LF)的霍乱检测分型试纸通过将UCP颗粒作为标记物与免疫层析技术相结合，并将传统的单靶标检测免疫层析试纸拓展为多重检测，最终所建立的基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸，该检测分型试纸的结构组成为样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和粘性底衬，具有操作简便、快速、敏感性高、特异性好的特点，可在野外现场实现样品中O1群与O139群霍乱弧菌的定量检测与分型。
文档编号G01N21/76GK201892680SQ20102029799
公开日2011年7月6日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者周蕾, 杨瑞馥, 邱海燕, 郝民, 郭兆彪, 阚飙 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所