专利名称：快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置的制作方法
技术领域：
本实用新型属于评估纳米材料安全性领域，特别是指利用细胞表面微形貌及电生理记录结果的变化来评估纳米材料安全性的技术，即快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置。
背景技术：
纳米材料在其生产、运输、使用和处置的过程中极有可能进入大气环境，通过呼吸道为人体吸收后，很可能给人类健康带来严重损害并成为许多重大疾病的诱因，因此也引起了人们对纳米材料的生物安全性的关注。常用的纳米材料包括纳米aiO，Tio2，c6(l，Cuo等， 其已被广泛应用于量子器件、特种精细陶瓷、太阳能利用、环保催化剂、医药、化妆品等与人类生活相关的诸多方面。尽管已有文献报道了这些纳米材料对不同层次生物系统(如细菌、水生生物、高等植物、哺乳动物等)的毒性效应，借以初步探讨其进入生命体后的生物学效应，但这些纳米材料与生命细胞相互作用的内在机制，尤其是对活体肺泡上皮细胞微观膜结构及生理功能损伤机理的研究，目前缺乏有力的技术手段予以利用。扫描离子电导显微镜技术(scanning ion conductance microscope, SI CM)是 1989年加州大学的Hansma在扫描隧道显微镜基础上设计而成，基本原理为扫描SICM技术依靠负反馈电路和压电陶瓷控制扫描用玻璃微探针，使其与样品表面间距离保持恒定，通过记录玻璃微探针的扫描轨迹来绘制出样品的表面形貌。但是由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品接触并导致针尖或样品损坏，SICM技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的聚酯薄膜扫描成像。1997年伦敦帝国理工学院的Korchev教授等将SICM技术中的直流式负反馈控制改进为交流调制式负反馈控制，使该技术真正实现了在生理液态培养条件下实时、非接触式、 高分辨率对活体生物样品表面三维微观结构的探测，如对细胞膜的纳米尺度微结构进行成像，包括树突突触结构、上皮细胞微绒毛和心肌细胞表面微结构等，并使其逐步发展成为与原子力显微镜技术(atomic force microscopy，AFM) —样广泛应用于纳米生物医学研究领域的一种先进的显微探测技术。70年代德国马普研究所Neher和Mkmarm在青蛙肌细胞上用双电极电压钳方法首次记录到单通道的离子电流，从而创建了膜片钳技术，此技术逐渐发展成为获得活细胞离子通道的特性和分布信息的主要实验方法，其应用使人们对离子通道本质的认识有了质的飞跃。利用膜片钳系统通过软件可采集探针电阻、膜静息电位、细胞膜离子通道的电流等多种电生理信号，这为研究者探讨细胞离子通道功能提供了一种简便有效的方法。目前对细胞结构和功能检测手段存在以下不足之处扫描电镜虽然有很高的分辨率，但由于其对样品导电性的要求使其无法对不导电的活体生物样品进行三维立体成像， 只能通过在样品表面喷镀或溅射导电(钼金)材料的特殊样品制备方法来实现，耗时费力且制样繁琐复杂；原子力显微镜通过针尖与样品间的相互作用力来负反馈控制针尖在样品表面的扫描成像，不仅会对生物样品表面产生或多或少的力作用，且导致柔软生物样品的成像困难，尤其是无法获得肺泡上皮微绒毛的高分辨率成像；普通膜片钳技术虽能评估细胞的生理功能，但由于其仅借助普通光学显微镜进行探针定位，受光学衍射极限限制分辨率不足，难以将细胞生理功能变化与高分辨率的膜结构联系起来。此外，多数纳米材料安全性的评估需进行动物实验，不仅成本高耗时长，且动物个体差异较大，导致结果的可靠性及重复性不好。通过建立合适的细胞模型，利用SICM技术与膜片钳技术的结合，使得在活体细胞上从结构和功能两方面共同探讨纳米材料的安全性成为可能。
(三)实用新型内容本实用新型的目的在于设计一种从结构和功能上快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，它针对现有对细胞结构和功能的检测手段的不足，提供一种利用扫描离子电导显微镜与膜片钳技术结合的在活体细胞上对纳米材料安全性进行评估的简便手段。本实用新型的技术方案快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl 电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、膜片钳前置电流功率放大器、膜片钳数模/模数转换器、SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；所说的充满电解液的玻璃微探针和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接；所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模/模数转换器连接；所说的膜片钳数模/模数转换器与SICM负反馈扫描控制电路连接；所说SICM负反馈扫描控制电路与SICM高精度XYZ 三维压电陶瓷扫描台。上述所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国Molecular Device公司的 Multiclamp700B 放大器。上述所说的膜片钳数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的 Digidata 1440A数模/模数转换器。上述所说的SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台均采用英国Ionscope公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜系统。本实用新型的工作过程(1)得到适合于利用SICM技术进行高分辨率扫描的玻璃微探针将拉制的扫描用玻璃微探针内冲灌电极内液，装置于SICM系统中内置Ag/AgCl电极的电极夹持器上，活体细胞浸润于电极外液中，内置参比Ag/AgCl电极；通过商用膜片钳技术来测量此玻璃微探针的电阻，选用阻值 150ΜΩ用于后续扫描；(2)利用SICM技术对在生理条件下培养的活体细胞表面形貌进行观测以SICM放大器监控流入玻璃微探针电流的变化，通过负反馈控制使得玻璃微探针与细胞保持恒定距离，玻璃微探针在细胞表面的轨迹即为正常生理条件下活体细胞的表面三维拓扑结构；(3)利用SICM技术对加入纳米材料下培养的活体细胞表面形貌进行观测以SICM放大器监控流入玻璃微探针电流的变化，通过负反馈控制使得玻璃微探针与细胞保持恒定距离，此细胞仍为加入纳米材料前所扫描的细胞，玻璃微探针在细胞表面的轨迹即为加入纳米材料后活体细胞的表面三维拓扑结构；利用SICM可得到纳米材料作用前后活体细胞膜表面结构的变化，即从细胞结构的角度评估了纳米材料的生物安全性；(4)得到适合于利用膜片钳技术进行离子通道电流记录的玻璃微探针将拉制的扫描用玻璃微探针内冲灌电极内液，装置于SICM系统中的电极夹持器上，电极夹持器内置Ag/AgCl电极，细胞浸润于电极外液中，内置参比Ag/AgCl电极；通过商用膜片钳技术来测量此玻璃微探针的电阻，选用阻值3 5ΜΩ用于后续离子通道电流的记录；(5)利用膜片钳技术记录在生理条件下培养的活体细胞离子通道电流利用SICM 技术控制软件将玻璃微探针准确定位于细胞胞体上，关闭SICM负反馈控制，然后手动控制玻璃微探针以垂直方向逐步接近细胞胞体，接近过程中通过电阻检测软件连续观测探针阻值变化，直至电阻达到GQ即形成高阻抗封接；通过膜片钳记录软件中ZAP功能或人工吮吸将玻璃微探针钳制的膜片打破，此时形成全细胞记录模式，即可得到生理条件下培养的活体细胞离子通道电流结果；(6)利用膜片钳技术记录在加入纳米材料后活体细胞的离子通道电流在步骤(5)记录的基础上完成；具体过程为通过步骤(5)得到正常的细胞离子通道电流，在细胞外液中加入纳米材料，采用与步骤( 相同的记录步骤，即可得到加入纳米材料后活体细胞的离子通道电流；利用膜片钳技术可得到纳米材料作用前后细胞膜离子通道电流的变化，即从细胞功能的角度评估了纳米材料的生物安全性。上述所说的纳米材料为纳米&ι0、纳米TiO2、纳米C6tl或纳米CuO。上述所说的步骤(5)中的电阻检测软件采用 Clampex 10. 2 软件。本实用新型的优越性1、本实用新型采用一种在生理液态培养条件下实时、非接触式、高分辨率对活体生物样品表面三维结构进行探测的SICM技术，它可用于观测在活体细胞上加入纳米材料前后细胞表面微观形貌的变化；对于纳米材料影响活体细胞功能的研究，采用传统的膜片钳技术，通过记录活体细胞在加入纳米材料前后离子通道电流的变化来评估纳米材料的生物安全性；2、利用SICM与膜片钳技术相结合的手段较易实现、简便快捷，更重要的是能够直观地从结构和功能两方面来评估纳米材料的安全性。
图1为本实用新型所涉快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置的结构示意图。图2-A、图2-B、图2-C为本实用新型所涉利用膜片钳技术记录加入纳米ZnO前后 A549细胞的离子通道电流图，其中纳米ZnO作用浓度为100mg/L(其中，图2-A为记录所用程序；图2-B为加入纳米ZnO前记录的A549细胞离子通道电流图；图2-C为加入纳米ZnO 后记录的A549细胞离子通道电流图)。
具体实施方式
实施例快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置(见图1)，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、 内含细胞与细胞培养液的培养皿、膜片钳前置电流功率放大器、膜片钳数模/模数转换器、 SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；所说的充满电解液的玻璃微探针和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接；所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模/模数转换器连接；所说的膜片钳数模/模数转换器与SICM负反馈扫描控制电路连接；所说SICM负反馈扫描控制电路与SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台。上述所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国Molecular Device公司的 Multiclamp 700B 放大器。上述所说的膜片钳数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的 Digidata 1440A数模/模数转换器；上述所说的SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台均采用英国Ionscope公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜系统。一种快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的方法实验纳米材料选用纳米 ZnO,实验对象选用A549细胞株(人II型肺泡上皮细胞株)。SICM扫描实验细胞内外液选用L 15培养基。将采用激光拉制仪拉制的扫描用玻璃微探针内冲灌L15培养基，装置于SICM系统中的电极夹持器上，将A549细胞也浸润于 L15培养基中，通过商用膜片钳技术测量此玻璃微探针的阻值 150ΜΩ ；通过SICM扫描软件设定好扫描参数后，通过负反馈控制使得玻璃微探针逐渐接近A549细胞，并最终达到微探针与A549细胞保持恒定距离的状态，同时应监控流入玻璃微探针电流的变化，以监测整个接近过程的稳定性。微探针达到in control状态时，即可开始对A549细胞膜表面进行扫描成像，其走过的轨迹即为正常A549细胞的表面三维拓扑结构。扫描完成后，加入纳米 &ι0，其终浓度为100mg/L，作用时间为池。纳米ZnO作用完毕后，用L15培养基将其洗脱， 通过负反馈控制使得玻璃微探针再次接近A549细胞并进行扫描成像，即可得到100mg/L纳米ZnO作用于A549细胞池时的表面三维拓扑结构。离子通道电流记录时所用的细胞内外液根据A549细胞生理特性而配制。将采用激光拉制仪拉制的膜片钳记录用玻璃微探针内冲灌电极内液，装置于SICM系统中的电极夹持器上，将A549细胞浸润于细胞外液中，通过商用膜片钳技术测量此玻璃微探针的阻值3 5MΩ ；利用SICM负反馈控制软件将玻璃微探针准确定位于Α549细胞胞体上，关闭 SICM负反馈控制，然后手动控制玻璃微探针以垂直方向逐步接近Α549细胞胞体，接近过程中连续观测Clampex 10. 2软件中的探针阻值变化，直至电阻达到GQ即形成高阻抗封接。 通过膜片钳记录软件中ZAP功能或人工吮吸将玻璃微探针钳制的膜片打破，此时形成全细胞记录模式。实验中钳制电位为_70mV，采样频率为10kHz，低通滤波频率为2kHz，采用 ClampexlO. 2记录电流所用的设置程序见图2-A，即可得到正常A549细胞离子通道电流图 (见图2-B)；此基础上，在细胞外液中加入纳米&ι0，终浓度为100mg/L，采用的记录参数同加药前记录参数，即可得到100mg/L纳米ZnO作用于A549细胞后的离子通道电流图(见图 2-C)。利用SICM可得到纳米ZnO作用前后A549细胞膜表面结构的变化，即从细胞结构的角度评估了纳米材料的生物安全性；利用膜片钳技术可得到纳米SiO作用前后A549细胞膜离子通道电流的变化，即从细胞功能的角度评估了纳米材料的生物安全性。
权利要求1.快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、膜片钳前置电流功率放大器、膜片钳数模/模数转换器、SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；所说的充满电解液的玻璃微探针和参比Ag/ AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比 Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接；所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模/模数转换器连接；所说的膜片钳数模/模数转换器与SICM负反馈扫描控制电路连接；所说SICM负反馈扫描控制电路与SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台。
2.根据权利要求1所说的快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器。
3.根据权利要求1所说的快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于所说的膜片钳数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模/模数转换器。
4.根据权利要求1所说的快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于所说的SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台均采用英国 Ionscope公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜系统。
专利摘要快速评估纳米材料对呼吸系统生物安全性的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、膜片钳前置电流功率放大器、膜片钳数模/模数转换器、SICM负反馈扫描控制电路及SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；优越性利用SICM与膜片钳技术相结合的手段较易实现、简便快捷，从结构和功能两方面来评估纳米材料的安全性。
文档编号G01N27/26GK201955323SQ20102057229
公开日2011年8月31日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者刘晓, 张彦军, 杨茜 申请人:国家纳米技术与工程研究院