专利名称：PKN3/RhoC大分子复合体及其使用方法
PKN3/RhoC大分子复合体及其使用方法
背景技术：
本发明涉及使用蛋白激酶N3 (PKN3)和I^hoC来筛选具有抗癌活性的化合物和诊断患有进展性癌症的患者。开发有效的癌症治疗方法越来越依赖于对疾病的潜在分子机制的认识以及鉴定到这些机制中可用于研发新药的靶分子。一旦获得此类靶分子，便能够针对这些靶分子来测试候选化合物。在许多情况中，此类药物候选物是由合成的或天然的化合物所组成的化合物文库的成员。十分需要鉴定到与高度进展形式的癌症相关的新的靶分子，以便能够鉴定并验证新的治疗性化合物和方案。
发明内容
在第一方面，本发明提供鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法。所述方法的步骤包括将测试化合物与蛋白激酶N3 (PKN3)多肽(或其片段)、RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依赖型激酶-1 (PDKl)多肽(或其片段)混合，然后确定所形成的含有PKN3和I^hoC 的复合体(“complex”)的量，这称为所述复合体的“测试水平”。然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与参照之间的任何差异代表所述测试化合物可能具有癌症治疗活性。在一些实施方式中，PKN3 AhoC和PDKl多肽(或它们的片段)在与所述测试化合物混合之前先进行一定程度的纯化。在一些实施方式中，一或多种所述组份(所述组份为PKN3、RhoC和PDKl，或其相应的片段)含有分子标签，所述标签用于鉴定所述组份并有助于分离所述组份以及与之连接的任何其他组份。分子标签通常是本领域已知的。实例包括多组氨酸、GST和FLAG。在一些实施方式中，PKN3多肽包含分子标签，并通过其分子标签捕获(pull down)PKN3多肽而分离所述复合体。在一些实施方式中，参照是在缺乏所述测试化合物的情况下所形成的复合体的水平。在其他实施方式中，参照是当所述测试化合物与PKN3、I^hoC和PDKl (或它们的相应的片段)混合时所形成的复合体的水平，其中所述激酶的任一或两者无激酶活性 (kinase一dead)0在一些实施方式中，所述测试水平低于参照。在一些实施方式中，所述测试化合物是降低癌细胞的侵袭性或降低肿瘤生长速度的化合物。在第二方面，本发明提供基于细胞的鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法。所述方法的步骤包括将细胞与测试化合物接触，然后确定在存在所述测试化合物的情况下所述细胞中形成的复合体的量(测试水平)。所述细胞含有PKN3多肽(或其片段),RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依赖型激酶-I(PDKl)多肽，而所述复合体也含有每一所述组份。然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与所述参照之间的任何差异代表所述测试化合物可能具有癌症治疗活性。在一些实施方式中，所述细胞是干细胞，例如长期造血干细胞(LT-HSC)。在其他实施方式中，所述细胞是来自肿瘤的培养细胞。在一些实施方式中，所述细胞具有高的转移能力。在一些实施方式中，所述细胞例如是以下细胞中的一种PC3细胞、HEK293细胞、 MDA-MB231细胞、MCF7细胞、MDA361细胞、MCF468细胞、BT549细胞和HeLa细胞。在其他实施方式中，所述细胞含有作为异源重组多肽的所述组份的一种或多种或全部。在一些实施方式中，一或多种所述组份(所述组份是PKN3、RhoC和PDKl或其片段)对于所述细胞而言是内源的。在一些实施方式中，一或多种所述组份是重组的并含有分子标签，所述标签用于鉴定所述组份并有助于分离所述组份以及与之连接的任何其他组份。分子标签通常是本领域已知的。实例包括多组氨酸、GST和FLAG。在一些实施方式中， PKN3多肽包含分子标签，并通过其分子标签捕获PKN3多肽而分离所述复合体。在一些实施方式中，参照是在缺乏所述测试化合物的情况下所形成的复合体的水平。在其他实施方式中，参照是当所述测试化合物与PKN3、MioC和PDKl (或它们的相应的片段)混合时所形成的复合体的水平，其中所述激酶的任一或两者无激酶活性。在一些实施方式中，所述测试水平低于参照。在一些实施方式中，所述测试化合物是降低癌细胞的侵袭性或降低原发肿瘤生长速度的化合物。在第三方面，本发明提供通过评估患者的PKN3活性和IihoC活性水平而诊断患者的癌症的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此为所述测试水平)，然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者具有进展性癌症。在第四方面，本发明提供通过评估患者的PKN3活性和I^hoC活性水平而鉴定会对癌症治疗发生反应的患者的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中 PKN3活性和IihoC活性的水平(此为所述测试水平)，然后将所述测试水平与参照相比较。 所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者是否会对所述癌症治疗发生反应的可能性。在第三和第四方面的一些实施方式中，所述参照是在非癌症组织中确定的PKN3 活性和IihoC活性的水平。在一些实施方式中，所述样品是肿瘤活检样品，且通过对肿瘤进行原位测定而确定所述测试水平，例如通过原位杂交、原位PCR或免疫染色。在一些实施方式中，所述参照仅仅是肿瘤样品周围或内部的任何非癌症组织。在一些实施方式中，所述测试水平高于所述参照。在第五方面，本发明提供通过评估施用处理之前和施用处理之后PKN3和IihoC活性水平的改变而确定癌症治疗性处理方案对患者的有效性的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此为治疗前水平或第一水平)，然后给所述患者施用处理方案。在施用该处理后一段时间，从患者获得第二样品，并确定所述第二样品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此为治疗后水平或第二水平)。将所述第一水平与第二水平相互比较。PKN3活性和I^hoC活性的第二水平相对于第一水平均降低代表所述处理方案对所述患者的癌症是有效的。在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，PKN3活性是表达编码PKN3多肽或其片段的RNA。在其他实施方式中，PKN3活性表达PKN3多肽或其片段。在其他实施方式中， PKN3活性PKN3多肽的磷酸化。在另一些实施方式中，PKN3活性是PKN3的下游效应物(例如糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽)(另见表1)被磷酸化。
在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，IihoC活性是表达编码IihoC多肽或其片段的RNA。在其他实施方式中，MioC活性是表达IihoC多肽或其片段。在其他实施方式中，RhoC活性是I^hoC的下游效应物(例如PKN3或糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽)(另见表1)被磷酸化。在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，通过使用特异性结合PKN3的转角基序磷酸化位点T860的抗体或其他多肽来确定PKN3多肽的磷酸化状态。见例如SEQ ID NO. 36。在第一至第五方面的一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、皮肤黑素瘤和前列腺癌(CaP)中的一或多种。在第六方面，本发明提供组合物，其包含破坏或阻断形成包含PKN3多肽和IihoC多肽的复合体的多肽或肽模拟物。在一些实施方式中，所述多肽或肽模拟物结合PKN3中与 RhoC结合的区域。在其他实施方式中，所述多肽或肽模拟物结合MioC中与PKN3结合的区域。在一些实施方式中，所述多肽或肽模拟物含有一或多个互补决定区(CDR)，所述CDR 识别PKN3或IihoC上的表位。在一些实施方式中，所述含CDR的多肽是抗体、单克隆抗体、 人源化抗体、单链、单链可变区片段(“ScFv”)、小模块免疫药物(“SMIP”)和纳米抗体 (nanobody)(也称为单结构域抗体或VHH抗体)中的任何一种。在第六方面的一些实施方式中，PKN3中与IihoC结合的区域包含ACC1、ACC2或 ACC3氨基酸序列中的任何一或多种。在其他实施方式中，所述多肽或肽模拟物含有相应于 PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的一或多种的氨基酸序列。在第七方面，本发明提供多肽，其含有至少一种识别PKN3转角基序磷酸化位点 T860的互补决定区(⑶R)。在一些实施方式中，所述多肽是抗体，包括例如，单克隆抗体、人源化抗体、单链、单链可变区片段(“&Fv”)、小模块免疫药物(“SMIP”)和纳米抗体(也称为单结构域抗体或VHH抗体)。在第八方面，本发明提供试剂盒，其用于筛选调节PKN3和IihoC之间的相互作用的化合物，并可用于治疗癌症。所述试剂盒还可用于确定患者的癌症的进展性或侵袭性。所述试剂盒还可用于评估癌症治疗对患者的有效性。在一些实施方式中，所述试剂盒含有(a) 检测PKN3活性的物质，(b)检测MioC活性的物质，(c)标签和(d)包装。在一些实施方式中，所述试剂盒还含有癌症治疗化合物。癌症治疗化合物是预防或延缓个体的癌细胞的生长或转移的化合物、组合物或处理方案。此类癌症治疗化合物包括，但不限于，化疗药、基因治疗组合物、影响激素的化合物、免疫治疗化合物、抗体和反义寡核苷酸。有用的化疗药的实例包括，但不限于，博来霉素、新制癌菌素(neocarcinostatin)、舒拉明、阿霉素、紫杉醇、 丝裂霉素C和顺钼。应该理解，可用于本发明的癌症治疗化合物还包括那些将来研发出的新的化合物或疗法。
图1显示了乳腺癌细胞系的蛋白质印迹，细胞的恶性潜能越高，磷酸化的PKN3的水平也随之升高。图2显示了非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的蛋白质印迹，细胞的抗药性越高，磷酸化的PKN3的水平也随之升高。
图3A显示了来自以Myc标记的他0和Rac构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗磷酸化的PKN抗体和抗Myc抗体进行检测。图:3B显示了来自以Myc标记的他0 和Rac构建体转染的细胞的抗Myc免疫沉淀物的蛋白质印迹，使用抗磷酸化的PKN抗体和抗Myc抗体进行检测。图4A显示了来自以Myc标记的Rho构建体和Flag标记的PKN3构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗Myc抗体和抗Flag抗体进行检测。图4B显示了抗Flag 免疫沉淀物的蛋白质印迹，其显示以激酶依赖性方式形成含PKN3、I h0C和PDKl的三元复合体。图5A显示了来自以Myc标记的Rho构建体和Flag标记的PKN3构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗Myc、抗PDK1、和抗PKN3抗体检测。图5B显示了抗Flag 免疫沉淀物的蛋白质印迹，其显示PKN3的激酶活性受到I h0C/PDKl/PKN3三元复合体的调控。图6A显示了来自PC-3细胞的裂解物的蛋白质印迹，所述PC-3细胞表达由多西环素(Dox或Doxy)诱导的靶向PKN3或pllO β的shRNA。图6B显示了接种于MATRIGEL的代表性细胞群体。图7A和图7B显示了对来自携带移植的PKN3 shRNA PC-3细胞的小鼠的肿瘤体积进行定量的直方图。图8A显示了来自MDA-MB-231细胞的裂解物的蛋白质印迹，所述MDA-MB-231细胞表达由Dox诱导的靶向ΡΚΝ3、ρ110β或CKI ε的shRNA。图8B显示了接种于MATRIGEL 的代表性细胞群体。图9的散点图显示了携带PKN3 shRNA MDA-MB-231细胞的小鼠的肿瘤体积(经或未经多西环素诱导)。发明详述本申请令人惊讶地发现(a)蛋白激酶N3 (PKN3)优先结合I^hoC，(b) PKN3以激酶依赖性方式结合MioC，和(c) PKN3和IihoC的结合有助于形成含有PDKl (PKN3/PDKl/RhoC复合体或PPRC复合体)的三元复合体。PPRC复合体是与高度进展性癌症相关联的可用靶点。 本申请还公开了 PPRC复合体的形成提高了 PKN3的磷酸化并继而提高其激酶活性。PKN3是长度为889个氨基酸(人直系同源物)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其具有N端推定的调控区，该调控区含有三个反向平行卷曲螺旋(ACC)结构域ACC1、ACC2和 ACC3，分别位于大约第15-77、97-170和184-236位残基；C端催化区，位于第559-882位残基；以及长度为大约100至130个残基的C2样结构域，其位于所述推定的调控结构域和催化结构域之间。哺乳动物中存在至少三种不同的PKN同种型(PKNl/PKNa/PAK-1/PRK-l、 PKN2/PRK2/PAK-2/PKN γ和ΡΚΝ3/ΡΚΝ β )，各自具有不同的酶学特性、组织分布和不同的功能。有关PKN的综述见Mukai，H.，J. Biochem. 133 :17-27，2003。也请参见
公开日为2004 年6月3日的美国专利申请20040106569，通过引用将其全部内容并入本申请。本申请还发现，在具有高进展性和抗药性的癌细胞中，PKN3是上调的(分别见图 1和图2·)。高进展性指的是癌细胞是转移的，发生转移的潜能高，增殖速度快，或是具有抗药性。进展性癌症的实例例如为三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer)(见，例如，Dent 等，Clinical Cancer Research 13 :4429-4434, Aug. 1, 2007) 进展性癌症还包括其中涉及PKN3/I h0C途径的那些癌症。抑制PPRC复合体活性的化合物可用于控制细胞的转移和增殖行为，因此这为治疗肿瘤和癌症，特别是进展性的肿瘤和癌症，提供了方法。受PPRC活性影响的信号途径和其他活性的降低可能是源于转录水平、或翻译水平、或一或多种PPRC复合体组份翻译后修饰的水平或四级结构形成水平(即，形成三元复合体)的降低。由于进展性癌症中有PPRC复合体和I h0C/PKN3途径的参与，因此该复合体及其组份可用作预后标记物、疾病分期标记物、患者分层标记物或用于诊断细胞的状态或体内具有这样的细胞的患者中所述细胞是否会发生转移或变成进展性的标记物。PKN3是PII诱导的细胞迁移和侵袭的发育调控介导物，其在表达和催化活性水平以Akt非依赖型方式受到PII调控。其具有限制性表达模式(内皮、胚胎和肿瘤细胞)， 而对于大多数正常细胞功能而言不是必需的。其对于转移性PC-3(PTEN-/_)细胞在同位移植小鼠模型中的生长是必需的。在正常细胞中，PI3激酶(磷脂酰肌醇-3-激酶)途径的特征在于经生长因子诱导的PI3激酶活性和平行的信号途径。以生长因子刺激细胞引起细胞膜上其同源受体的活化，后者随后与细胞内信号途径分子(例如PI3激酶)结合并使之活化。PI3激酶(由p85 调节亚单位和PllO催化亚单位组成)的活化导致Akt经由磷酸化而激活，由此支持更下游的细胞应答，例如增殖、存活或迁移。因此，PTEN是肿瘤抑制物，其参与磷脂酰肌醇(PI)3激酶途径，其在调控细胞生长和转化中的作用在过去已经得到了深入的研究(综述请参见， 例如，Stein, R. C. and ffaterfield, Μ. D. Mol Med Today 6 :347-357, 2000)。肿瘤抑制物PTEN的功能是通过逆转PI3激酶催化的反应而作为PI3激酶的负调节物，由此确保该途径的活化以暂时的和可控的方式发生。功能性灭活PTEN引起PI3激酶信号途径持久过度活化。加入小分子抑制剂LY^4002阻断PI3激酶活性。可通过例如小分子抑制剂PD98059抑制作为平行途径起作用的信号途径激酶MEK的活性以及下游应答。因丧失PTEN功能而持久活化的PI3激酶途径是肿瘤发生和转移的主要促成因素， 这表明该肿瘤抑制物是受控细胞增殖的一个重要检查点。PTEN敲除细胞显示出与其中PI3 激酶途径被活化形式的PI3激酶持久诱导的那些细胞具有类似的特征。磷脂酰肌醇3激酶活化足以造成进入细胞周期和促成癌性转化特有的细胞改变。涉及PI3激酶途径失调的疾病和状况是已知的。因此，任何这些状况和疾病均可通过本发明的方法以及药物和诊断剂来解决，本文教导了本发明的方法以及药物和诊断剂的设计、筛选或制造。状况和疾病指的是以下示例性而非限制性的情况子宫内膜癌、结直肠癌、胶质瘤、子宫内膜癌、腺癌、子宫内膜增生、Cowden综合征、遗传性非息肉性结直肠癌、Li-Fraumene综合征、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、Barmayan-Zonana综合征、LDD(Lhermitte-Duklos "综合征)、错构瘤-大头畸形病(hamartoma-macrocephaly diseases)(包括 Cow 病(CD)和 Bannayan-Ruvalcaba Rily 综合征(BRR))、皮肤粘膜病变 (例如，Trichilemmonmas)、大头畸形、智力低下、胃肠道错构瘤、脂肪瘤，甲状腺腺瘤，乳房纤维囊性疾病，小脑发育不良性神经节细胞瘤和乳腺癌和甲状腺恶性肿瘤。有鉴于此，PPRC复合体及其各组分是PI3激酶途径的有价值的下游药物靶点，可通过那些可能具有较低不良反应的药物而不是针对PPRC上游靶点的药物来克服PI3激酶途径。因此，本发明提供适合用于设计、筛选、研发和制备具有药物活性的化合物的药物靶点，所述化合物比本领域已知的那些通常靶向PI3激酶的化合物，例如2-(4-吗啉基)8-苯并色酮(“LY^4002”)，具有更高的选择性。通过控制这一特殊部分的效应物分子，即MioC 和PKN3以及该途径中涉及的任何更加下游的分子，仅有数量非常有限的其平行分支或该信号级联中更加上游的靶点才可能引起不良反应。因此，与细胞周期、DNA修复、凋亡、葡萄糖转运、翻译有关的PI-3激酶/PTEN途径的其他活性将不受影响。胰岛素信号途径也不会被诱导，这意味着可切实避免与使用LY^4002有关的糖尿病反应或其他不良反应。编码PKN3的完整核酸序列通常可从数据库获得，例如登录号NM_013355. 3。PKN3 的氨基酸序列也可以登录号NP_037487.2从数据库获得。编码IihoC的完整核酸序列通常可从数据库获得，例如登录号 NM_001042678. 1、NM_001042679. 1 和 NM_175744. 4。RhoC 的氨基酸序列也可以登录号NP_001036143. 1、ΝΡ_001036144. 1和NP_786886. 1从数据库获得。 PKN3和IihoC的衍生物或其截短形式可用于本发明，条件是它们可实现所需的效果，这也属于本发明的范围。本领域人员可通过常规分析确定衍生化和截短的程度。就本发明而言，编码PKN3和IihoC的核酸序列也包括与上述登录号的核酸序列杂交的核酸或任何可衍生自上述氨基酸序列的核酸序列。此类杂交是本领域人员已知的。 此类杂交的细节可参见 Sambrook，J. Fritsch, Ε. F. and Maniatis, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor :Cold Spring Harbor Laboratory.在优选的实施方式中，杂交在严格性条件下进行，例如Sambrook所述的严格性条件。此外，编码PKN3和IihoC的核酸还包括含有与上述任一核酸序列具有同源性的序列的核酸序列，其中序列同源性的程度为75 %、80 %、85 %、90 %或95 %。人PKN3的直系同源物可见于，例如，多种不同进化方向的生物体，例如小家鼠(M. musculus)和褐家鼠(R. norvegicus)、拟南芥(A. thaliana)，秀丽隐杆线虫 (C. elegans)，黑腹果蝇(D. melanogaster)和酿酒酵母(S. cerevisiae)。对于 PKN3，上述各物种的百分比相同性分别是67 %、51 %、38 %、36 %、63 %和44%。人RhoC的直系同源物可见于小鼠、大鼠、拟南芥和果蝇，百分比相同性分别为100 %、99 %、47 %和86 %。本领域人员可以理解，任何这些或者其他直系同源物和同源物原则上都适用于本发明，条件是使用所述同源物产生的药物或诊断剂仍然可与人PKN3或I^hoC或任何其他靶PKN3或I^hoC相互作用。PPRC复合体及其各成员可作为那些可用作药物或候选药物或用作诊断剂的化合物所针对的靶。可以使用不同类别的合适的化合物，例如抗体、肽、Anticalines、适体、镜像适体(Spiegelmers)、核酶、反义寡核苷酸和siRNA、以及小有机分子。通过使用PPRC复合体(所述复合体本身、其各成员或其组合)或与所述PPRC复合体有关的信息来设计、选择、 筛选、产生或制备恶心化合物。在此类化合物的设计、选择、筛选、产生和植被过程中，PPRC也被称为靶，但该靶是在这一过程中使用的，而不是在最终将相应的化合物施用于需要该化合物的患者这一过程中所使用的靶。在提供各类化合物的过程中，可以使用完整的PPRC复合体、其各成员或它们的组合、或编码PPRC的任一或所有蛋白质组份的核酸。术语“PPRC复合体或其组份”在本申请中包括PPRC及其组成成员的任何片段或衍生物，其使得能够设计、选择、筛选、产生或制备可用作药物或诊断剂的所述化合物。
术语“编码PPRC复合体或其组份的核酸”在本申请中包括含有编码PPRC复合体的任何组份或其片段的核酸的任何核酸。对于编码PPRC复合体或其组份的核酸的一部分也是如此看待，条件是其适合用于设计、选择、筛选、产生或制备可用作药物或诊断剂的所述化合物。编码PPRC复合体或其组份的核酸可以是基因组核酸、hnRNA、mRNA、cDNA或它们各自的一部分。如上所述，除了本文所述的PPRC复合体或其组份或相应的核酸序列以外，本发明还包括可用于产生或抑制由PPRC复合体的内源性活性所引起的效应的手段或化合物。可在筛选方法中确定或选择此类手段。在此类筛选方法中，第一步骤是提供一或多种所谓的候选或测试化合物。在本申请中，候选化合物指的是准备在一测试系统中测试其是否适合用于治疗或减轻本文中所述的癌症或用作癌症的诊断手段或诊断剂的那些化合物。如果候选化合物在该系统中显示出相应的效应，则该候选化合物是用于治疗所述疾病和疾病状况的合适的手段或治疗剂，且原则上也是该疾病和疾病状况的合适的诊断剂。在第二步骤中，使所述候选化合物接触PPRC表达系统、PPRC基因产物、PPRC活性系统、 或PPRC复合体或组份。PPRC活性系统在本文中也称为检测PPRC复合体的活性的系统，例如检测PPRC激酶活性。在一些实施方式中，可通过确定底物的磷酸化来评估PPRC复合体的激酶活性，所述底物例如为诊断用GSK3 α衍生片段，其序列为GPGRRGRRRTSSFAEGG(SEQ ID NO :1)。表1给出了可用于实施本发明的一些额外的PPRC激酶底物。本文中所提到的PPRC筛选方法还可用于将非功能性或无活性化合物排除在进一步考虑之外。因此，可测定获自对象或测试系统的第一样品的PPRC活性，产生处理前水平， 随后给所述对象或测试系统施用测试化合物，并在施用所述测试化合物一段时间后测定获自所述对象或测试系统的第二样品的PPRC复合体的活性或其各组份的活性，由此产生测试水平数据。可将处理前水平(第一水平)与所述测试水平(第二水平)相比较，如果数据显示所述测试水平相对于处理前水平无降低，则代表所述测试化合物对所述对象无效， 那么可将该测试化合物排除在进一步评价或研究之外。相反，数值的变化可代表所述测试化合物适合用作PPRC抑制剂或用于进一步的究中。表1 受PKN3调控的含磷蛋白质
权利要求
1.鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法，所述方法包括a.将细胞与测试化合物接触，所述细胞是离体的并包含PKN3多肽或其片段、I^hoC多肽或其片段和PDKl多肽或其片段；b.确定复合体的测试水平，所述复合体是在存在所述测试化合物时形成的，且所述复合体包含H(N3多肽、IihoC多肽和PDKl多肽；和c.将步骤(b)中确定的测试水平与参照相比较，其中在步骤(C)中，步骤(b)中确定的测试水平与所述参照之间的差异代表所述测试化合物具有癌症治疗潜能。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞选自PC3细胞、HEK293细胞、MDA-MB231细胞和 HeLa细胞。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述PKN3多肽包含分子标签，所述分子标签选自FLAG标签、GST标签和Myc标签，且通过其分子标签捕获PKN3多肽而分离所述复合体。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述参照是(a)在缺乏所述测试化合物的情况下形成的包含PKN3多肽和IihoC多肽的复合体的水平，或(b)在存在所述测试化合物的情况下形成的包含PKN3多肽和I^hoC多肽的复合体的水平，其中所述H(N3多肽或PDKl多肽无激酶活性。
5.诊断患者的癌症的方法，包括a.从患者获得样品；b.确定所述样品中PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此产生测试水平；和c.将所述测试水平与参照比较，其中所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述癌症是进展性的可能性。
6.鉴定会对癌症治疗有反应的患者的方法，包括a.从患者获得样品；b.确定所述样品中PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此产生测试水平；和c.将所述测试水平与参照比较，其中所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者将对癌症治疗发生反应的可能性。
7.权利要求5或6的方法，其中所述参照包含在非癌症组织中确定的PKN3活性和I^hoC 活性的水平。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述测试水平高于所述参照。
9.确定患者的癌症治疗性处理方案的效果的方法，包括a.从患者获得第一样品；b.确定所述第一样品中的PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此产生第一水平；c.给所述患者施用所述处理方案；d.在施用所述处理方案后从所述患者获得第二样品；e.确定所述第二样品中的PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此产生第二水平；和f.比较所述第一和第二水平，其中PKN3活性和IihoC活性的第二水平相对于第一水平均降低代表所述处理方案对所述患者的癌症是有效的。
10.权利要求5-9中任一项的方法，其中所述PKN3活性选自(i)表达编码PKN3多肽或其片段的RNA，(ii)表达PKN3多肽或其片段，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽的磷酸化。
11.权利要求5-10中任一项的方法，其中所述MioC活性选自(i)表达编码IihoC多肽的RNA, (ii)表达RhoC多肽，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3 (GSK-3)的磷酸化。
12.权利要求10或11的方法，其中以抗体检测所述PKN3多肽的磷酸化，所述抗体结合 PKN3转角基序磷酸化位点T860。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述PNK3多肽包含(a)与SEQID NO 26具有至少95%相同性的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO :36具有至少95%相同性的氨基酸序列。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、皮肤黑素瘤和前列腺癌(CaP)。
15.多肽，包含结合PKN3转角基序磷酸化位点T860的互补决定区(⑶R)。
16.权利要求15的多肽，其中所述多肽是单克隆抗体。
17.试剂盒，包含检测PKN3活性的物质、检测MioC活性的物质、标签和包装。
18.权利要求17的试剂盒，还包含癌症治疗性化合物。
19.灭活PPRC复合体的多肽，其中a.所述PPRC复合体包含PKN3多肽、IihoC多肽和PDKl多肽，b.所述多肽结合(i)MioC多肽上与PKN3多肽的同源结构域结合的结构域，或(ii) PKN3多肽上与IihoC多肽的同源结构域结合的结构域，和c.所述多肽⑴抑制PPRC复合体的形成或(ii)抑制与PPRC复合体相关的激酶活性。
20.权利要求19的多肽，其中所述多肽包含选自PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的至少一个ACC结构域，但不包含PKN3的激酶结构域。
全文摘要
本发明公开了包含新的大分子组件的组合物和所述大分子组件的使用方法，所述大分子组件包含PKN3、PDK1和RhoC(PPRC复合体)。发现PPRC复合体具有激酶活性，并存在于高度恶性的细胞中，例如高度进展性的癌症。在一些方面，本发明提供筛选具有癌症治疗潜能的化合物的方法，诊断进展性癌症的方法，确定癌症患者预后的方法，在临床试验中对患者进行分层或确定特定处理方案的有效性的方法，并提供调节PPRC复合体的形成的多肽以及包含PPRC复合体的一或多种组份的试剂盒。
文档编号G01N33/50GK102348981SQ201080011777
公开日2012年2月8日 申请日期2010年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者A·克利佩尔-吉泽, K·云萨尔-卡奇马兹 申请人:惠氏有限责任公司