用于hcv检测的固体支持物的制作方法

专利名称：用于hcv检测的固体支持物的制作方法
用于HCV检测的固体支持物本发明涉及丙型肝炎诊断的领域，以及特别涉及可以用于如下方法的固体支持物，所述方法用于同时检测丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及针对HCV蛋白的抗体。用于检测HCV感染的第一代测试是基于针对NS3/NS4非结构蛋白的抗体的检测 (EP 0 318 216 ；Choo et al (1989))，其特别使用了与超氧化物歧化酶融合的约360个氨基酸的蛋白clOO-3。然而，此第一代测试仅能够检测出70%至80%的感染了所述病毒的血清。第二代测试仍是基于对抗体的检测，结合了若干区域特别是核心蛋白以及NS3和 NS4蛋白的抗原(Mimms et al (1990) ；EP 0 450 931)。此第二代测试表现出显著的进步， 因为其灵敏性超过95% (Alter et al(1992))。第三代测试在这些核心、NS3和NS4抗原之外另外增加了 NS5区域的重组蛋白 (Courouce et al(1994))。不过，此检测局限于展现出HCV所引起的慢性肝疾病症状的患者，而对其早期(疑似患有急性期丙型肝炎的患者)的检测很差。例如，此种形式在输血的情况中可以允许通过某些被污染的供血者的血液材料来进行。对病毒本身的检测在污染后以及抗体出现前是必要的且越早越好。这通过使用PCR(聚合酶链反应)扩增技术检测核酸来实现，如Garson et al. (1990)所述。令人遗憾地是，同等地从样品制备、污染风险、和自动化的角度来看，此种技术的进行依然很复杂。用于HCV感染早期检测目的的另一种手段是检测核心蛋白的循环病毒抗原，如Takahashi et al (1992)所述，不过可检测的核心抗原的量低且此种测定法的进行依然很复杂。为了克服这些缺陷，用于组合HCV抗原及针对HCV的抗体的检测的测定法(称作 COMBO)代表了一种为了得益于以下二者的良好平衡，即通过抗原的检测而实现的早期检测和通过抗体的检测而实现的对患者慢性状况的监测。然而，这引起了一个主要的问题，也即干扰的问题，其涉及到HCV核心抗原的测定中在血清中存在的抗-HCV抗体与用于检测抗原的经标记抗HCV抗体之间的干扰。此种问题尤其存在于在同一固相上对抗HCV核心蛋白抗体和HCV核心抗原进行同时检测的系统中。因此，为了检测抗HCV核心蛋白抗体而将具有相同表位(由用于检测核心抗原的经标记的抗HCV核心蛋白抗体所识别)的核心抗原安置(cbposit)于固相上，会使得经标记的抗体附着至所述固相并导致所述测定的假阳性反应。类似地，在组装固体支持物(其上需要附着核心抗原和抗核心蛋白抗体)的过程中，不可能用含有此二种成分的混合物的溶液来包被固相，否则抗体的位点会被用于包被固体支持物的抗原所封闭，阻止了所述抗体随后与患者血清抗原的反应。因此这些竞争现象非常不利于有效测试的开发。WO 00/07023提出了检测核心抗原和抗核心蛋白抗体的COMBO测试，其中，为了避免干扰的问题，被选择用于试剂盒各种成分的核心蛋白表位是不同的。由于核心表位的数目并不是无限的，因此此种技术具有使用识别很差的次要表位的缺陷。WO 2008/027942中描述的手段类似，但却系统化地组合了最大数目的核心蛋白和抗核心蛋白单克隆抗体的非重叠表位，仍旧是为了克服此种干扰的问题。
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EP 1 251 353使用了相同的技术，却用更完整的抗原混合物(NS3、NS4、NS5、核心)来检测抗体，但是仍存在此种核心蛋白的干扰问题。WO 03/095968通过对用于抗体捕获的抗原的某些靶表位进行结构修饰(特别是通过氨基酸取代)来解决此种问题。经如此修饰的表位因而被破坏。同时，用于捕获和/ 或检测抗原的抗体是经过选择的，从而其事实上识别患者抗原上存在的未经修饰的表位， 并且其因而不能结合经修饰的抗原(不再具有同样的表位)。由于表位不再相同，因而用于捕获和/或检测HCV抗原的抗体与患者的抗体之间不再存在竞争。核心抗原的捕获和抗核心蛋白抗体的捕获将能够在核心蛋白的同一蛋白区域进行并且将避免一定数目的抗核心蛋白抗体检测的损失。WO 03/002749中描述了类似的策略，其中的核心蛋白经修饰从而某些表位不被该测定法中所使用的单克隆抗体所识别。WO 01/096875描述了 COMBO测定法，其中通过组合检测HCV核心抗原和针对NS3/ NS4a 680个氨基酸(aa)的蛋白中存在的非连续表位的抗体来解决此种干扰问题。然而，此种应用中的灵敏性/特异性结果非常有限并且未证明其灵敏性水平足以用于检测测试。因此，需要组合的抗原和抗体HCV检测测试，其是灵敏且特异的、尽可能的简单、 并且其避免了抗原和针对核心蛋白的抗体之间的干扰问题。为了此目的，发现了用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)和包含以下的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位以及选自HCV的E1、NS3、NS4和NS5的蛋白的至少一种表位，并且其上的所述至少一种多肽不含有HCV核心蛋白的表位。具体而言，用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含HCV的E2蛋白的至少一种表位的至少一种多肽，c)和包含选自HCV的E1、NS3、NS4和NS5的蛋白的至少一种表位的至少一种多肽，并且在所述支持物上的所述至少一种多肽不含有HCV核心蛋白的表位。本发明也提出了用于在体外检测生物学样品中的HCV感染的方法，其包括检测所述生物学样品中存在的至少一种HCV抗原以及针对HCV的抗体，并且其中提供如上所述的支持物，在使得抗原-抗体复合物形成的条件下将所述支持物与所述生物学样品进行温育，显现所形成的抗原-抗体复合物。有利的是，本发明的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c) 包含或由如下所组成的至少一种多肽选自HCV的NS3、NS4和NS5 (优选NS4B和NS5A)的蛋白的至少一种表位。更有利的是，本发明的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和 c)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS3的至少一种表位和选自HCV的NS4及 NS5的蛋白的至少一种表位。
优选的是，本发明的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c) 包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS3的至少一种表位和选自HCV的NS4B及 NS5A的蛋白的至少一种表位。在本发明的另一个实施方案中，本发明的固体支持物包含或由如下所组成a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的E2蛋白的至少一种表位和c)包含或由如下所组成的至少一种多肽HCV的NS4B蛋白的至少一种表位和HCV的NS5A蛋白的至少一种表位。在任何的情况中，都没有包含HCV核心蛋白表位的多肽附着于所述固体支持物。术语“HCV” (丙型肝炎病毒)涵盖了引起丙型肝炎的病毒的所有病毒株、类型、亚型、和基因型。这包括了 6种主要的基因型1、2、3、4、5和6以及其亚型la、lb等。HCV的区域通过Choo QL et al. 1991中所使用的数字来进行适当的定义，并且在下表中对HCV 1进行了总结
结构域aa氨基酸位置核心1-191El192-383E2384-746P7747-809NS2810-1026NS31027-1657NS4A1658-1711NS4B1712-1972NS5A1973-2420NS5B2421-3011术语“多肽”(或“抗原”)是指氨基酸的聚合物并且不限于最小数目的氨基酸或者特定的大小。氨基酸可以是天然的(编码蛋白的那20种)或合成的，如鸟氨酸或Y-氨基丁酸，或者经糖基化、乙酰化、磷酸化等修饰的，这样该多肽保持所需的关于由患者所产生的针对HCV的抗体的活性，特别是抗原活性。术语“表位”是指结合抗体的至少3、4或5个氨基酸、特别是6-8和12_15个氨基酸的序列。对于表位没有临界的上限大小。表位的序列可以包含“保守的”修饰，其从特异性的角度来看不显著改变表位和抗体之间的结合。
“X蛋白的至少一种表位”的表述是指该X蛋白或者其一或多个表位。因此，例如表述“E2蛋白的至少一种表位”是指E2蛋白本身或者其一或多个表位。因此，根据本发明的一个优选实施方案，用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，和b)由以下所组成的多肽⑴HCV的E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和(ii)HCV的E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，(iii) NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。优选地，所述肽(ii)选自NS4B和NS5A蛋白及其一或多种表位。更优选地，所述肽(iii)不存在于多肽b)中。根据本发明的另一个实施方案，用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)HCV的E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和c) HCV的El、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位， 以及，在适当的情况下，d)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。优选地，所述肽c)选自NS4B和NS5A蛋白及其一或多种表位。更优选地，所述支持物不含有肽d)。附着于固体支持物的多肽可以含有不同蛋白的或者甚至是不同亚型的若干表位。 此种类型(多表位融合抗原MEFA)的构建在WO 01/096875或WO 97/44469中有很好的描述。优选地，包含E2蛋白的至少一种表位的多肽将不同于包含El和/或NS4和/或 NS5的至少一种表位的多肽。术语“E2蛋白”是指具有约70_72kd的分子量的包膜糖蛋白。术语“E2蛋白”也包括具有类似于E2蛋白免疫学行为(与参考抗体在二者之间的相同的交叉反应性)的突变体或截断的蛋白。例如，现有技术中所描述的一种形式的E2从位置384延伸至746，但是另一种形式的E2延伸至位置809并且在位置683截断的E2蛋白在此应用中也有描述。在氨基酸383和384之间的插入也有描述，以及位置384-387之间的缺失(Kato et al 1992)。 优选地，E2蛋白C-末端部分的至少10、30、50、60、63、70、80、90或1 个氨基酸被从其上截掉。术语“抗体”是指任何完整的抗体或抗体的功能性片段，其包含或者由如下所组成至少一个抗原组合位点，其允许所述抗体结合至抗原化合物的至少一个表位。通过对抗体片段举例的方式，可以提及的有Fab、Fab'和F(ab' ) 2片段以及还有scFv (单链可变片段)及dsFv(双链可变片段)链。这些功能性片段可以特别通过遗传工程而获得。“至少一种针对核心蛋白的抗体”的表述是指一或多种抗核心蛋白的抗体。本发明的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。上述的多克隆抗体可以通过以下获得用至少一种感兴趣的抗原免疫动物，随后回收纯化形式的感兴趣的抗体，这是通过从所述动物取血清样品，并将所述抗体从血清的其他组分中分离，特别是通过在柱上的亲和层析，在所述柱上附着有特异性地识别所述抗体的抗原特别是感兴趣的抗原。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术而获得，其一般原理总结如下在第一步中，用感兴趣的抗原来免疫动物(通常是小鼠或者在体外免疫的情况下是培养中的细胞)，其B淋巴细胞继而可以产生针对所述抗原的抗体。随后将这些产抗体的淋巴细胞与“永生的”骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤细胞。使用如此所获得的细胞的异源混合物，然后选择能够产生特定抗体并且能够无限复制的细胞。每种杂交瘤以克隆的形式复制，均导致单克隆抗体的产生，所述单克隆抗体识别感兴趣抗原的性质可以通过例如如下来测试，ELISA、一维或二维Western印迹、免疫荧光、或生物传感器的方法。经如此所选择的单克隆抗体随后被纯化，特别是根据亲和层析技术。在本发明的背景下，生物学样品优选由生物学液体所构成，如血清、血浆、血液或全血，还有尿、组织、脑脊液等。生物学样品可以在之前的步骤中经过处理或者在促进待测抗原暴露的条件例如酸性条件下与固相接触。可以使用离子或非离子类型的洗涤剂，例如 triton XlOO或SDS (十二烷基硫酸钠)以及聚(氧乙烯)衍生物如NP40。本发明的多肽通过其本身为本领域技术人员所熟知的技术而产生，使用标准的分子生物学和基因工程技术，或者在大小较小的肽的情况中使用化学技术，例如通过固相合成。所有这些技术均为本领域技术人员所熟知。抗原的表位区域可以通过如Methods in Molecular Biology, Epitope Mapping Protocols，vol 66，GE. Morris ed.，1996，Humana Press中所述的“表位作图”技术来确定。术语“标记”是指能够直接或间接产生可检测信号的标记的附着。这些标记的非限制性列表由如下组成产生可由例如比色法、荧光或冷光所检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、α -半乳糖苷酶或葡糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光、冷光或产色化合物，放射性分子例如％P、MS或1251，以及荧光分子如罗丹明或藻蓝蛋白。也可使用间接体系，例如能够与抗-配体反应的配体。配体/抗-配体的配对是本领域技术人员所熟知的，例如如下配对就是这种情形生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与其互补的多核苷酸。在这种情况下附着至多肽或抗体的是配体。抗配体可以直接由前面段落中所述的标记的方法来检测，或者其本身可以通过配体/抗配体的方法来检测。如本文所用，术语“固体支持物”包括其上可以固定抗原和/或抗体用于诊断测试的所有材料。天然的或合成的材料(其可以经过或未经化学修饰)可被用作固体支持物， 特别是聚合物如聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚酰胺，或者是基于乙烯基芳香单体的共聚物，不饱和羧酸的酯，二氯乙烯，二烯或者具有腈功能的化合物(丙烯腈)；氯乙烯和丙烯的聚合物、氯乙烯和乙酸乙烯酯的聚合物；基于苯乙烯或苯乙烯的取代衍生物的共聚物；合成纤维，如尼龙；无机材料如硅石、玻璃、陶瓷或石英；胶乳，磁性颗粒；金属衍生物。本发明的固体支持物可以是(非限制意义)如下形式微滴定板、片层、锥体、管、孔、 珠、颗粒等，或者是平支持物如硅石或硅片。抗原和抗体或者抗体在固体支持物上的附着可以通过任何直接或间接的方法来实现，特别是通过被动吸附。抗原和抗体的附着可以作为混合物或者依次、或者组合二者来实现。在一个具体的实施方案中，本发明所有的抗原和抗体将被附着在同一区域，例如微滴定板的孔中。在另一个实施方案中，抗原和抗体将被分离地附着而因此附着在固体支持物的不同区域,例如在VIDAS锥体(bioMerieux, Marcy 1，Etoile)上，例如HIV DUO试剂盒中所使用的。生物学样品中抗体和抗原的存在通过检测方法来显现。对于抗原的检测，本发明特别提供了使用至少一种检测抗体的检测。此种经标记的检测抗体，能够通过亲和性结合、 通过识别表位位点结合所捕获的抗原，所述表位位点与捕获抗体所识别的不同，或者由于抗原中存在重复基序而相同。对于抗体的检测，特别可以使用经标记的抗免疫球蛋白或抗同种型抗体，例如抗免疫球蛋白G抗体或者经标记的抗原。所有这些检测技术均为本领域技术人员所熟知。本发明的固体支持物包含至少一种针对核心蛋白的抗体，优选至少两种针对核心蛋白的抗体。在一个优选实施方案中，这些抗体的至少一种识别选择核心蛋白如下氨基酸位置的表位2-120，特别是 15-90，有利的是表位 20-24 (SEQ ID No. 10 =QDVKF) ,29-33 (SEQ ID No. 11 =QIVGG),58-65(SEQ ID No. 12 :PRGRRQPI)、29_37(SEQ ID No. 13 :QIVGGVYL)、 7-17(SEQ ID No. 14 :RKTKRNTN)、34-39(SEQ ID No. 15 =VYLLPR),73-86(SEQ ID No. 16 GRTWAQPGYPWPLY)，如C. Jolivet-Reynaud et al (1998)中所定义。由于本发明的固体支持物上缺少核心抗原而使得所述支持物不具有竞争的问题，这使得可以将附着于所述固体支持物的抗核心抗体的数目加倍以改善灵敏性或特异性。因此可以在所述固体支持物上附着至少2种或至少3种抗体。在本发明的一种特定组合中，至少一种多肽附着于所述固体支持物用于检测部分，所述多肽包含SEQ ID No. 2序列和/或SEQ ID No. 4序列和/或SEQ ID No. 5序列和/ 或SEQ ID No. 7序列和/或SEQ ID No. 9序列的至少10个、有利的是12个、优选15个连
续的氨基酸。根据一个具体的实施方案，本发明的支持物满足至少一个以下特性-肽(ii)包含SEQID No. 5和/或SEQ ID No. 7序列的至少10个连续的氨基酸， 和-肽(i)包含SEQID No. 2序列的至少10个连续的氨基酸。在本发明另一个具体的组合中，至少3种不同的多肽附着于所述固体支持物上， 其中第一种多肽包含SEQ ID No. 2序列的至少10个、有利的是12个、优选15个连续的氨基酸，第二种多肽包含SEQ ID No. 2序列的至少10个、有利的是12个、优选15个连续的氨基酸，以及第三种多肽包含SEQ ID No. 5和/或SEQ ID No. 7序列的至少10个、有利的是 12个、优选15个连续的氨基酸。根据一个具体的实施方案，本发明的支持物满足至少一个以下特性-肽c)包含SEQID No. 5和/或SEQ ID No. 7序列的至少10个连续的氨基酸，和-肽b)包含SEQID No. 2序列的至少10个连续的氨基酸。此种组合的免疫测定可以根据本领域技术人员熟知的各种形式来进行(非限制性地举例)在固相中或在均相中；在一个步骤中或在两个步骤中；在双夹心方法中(用于
8抗原和抗体两者检测的夹心)；或者在间接的方法中(用于抗体的检测)组合夹心方法(用于抗原的检测)。两种抗体类型(捕获和检测)之间夹心的免疫测定形式特别有利于检测生物学样品中存在的抗原，而抗体可以通过使用捕获抗原和结合所述抗体的经标记的缀合物来进行显现(依据通常表示为间接形式的形式)。用于通过竞争检测抗原的免疫测定形式也是可能的。其它的免疫测定模式也可以进行设想并且是本领域技术人员所熟知的。对HCV抗原和针对HCV微生物的抗体的同时检测可以在一个步骤里实现，也即通过将生物学样品同时与检测工具接触，如特别是检测抗体或抗体，与捕获抗体和捕获抗原同时。在这种情况下，抗原检测免疫测定以及抗体检测免疫测定都优选以夹心形式进行。或者，可以将检测工具，如特别是检测抗体，在第二步中，即在第一个抗原/抗体复合物形成之后加入到混合物中。这因而被称为二步测定法。通过如下以非限制性的说明方式给出的实施例以及

图1和图2而更清楚地理解本发明。其中附图图1表示了使用本发明的固体支持物的ELISA测定的实例，在所述支持物上附着有抗核心蛋白抗体以及4种HCV抗原，分别是E2、NS3、NS4和NS5。将来自患者A的生物学样品与此固体支持物接触而进行温育。此样品(其可以是血清)潜在地含有抗-HCV(特别是抗-E2和/或NS3和/或NS4和/或NSQ抗体以及病毒的抗原(特别是核心抗原)，其能够与该固体支持物上存在的生物学试剂反应。用连接至碱性磷酸酶(AP)的单克隆抗-核心抗体和其本身也标记有碱性磷酸酶单克隆抗-人IgG抗体(在该图中，Fab’片段)使得来自该样品的这些抗体和抗原的结合显现出来。图2表示了 PI~alpha-E2-M克隆的序列组成EF1 α启动子之后是EcoRI限制性位点和含有免疫球蛋白G可变区重链序列的区域(VH前导，有下划线的序列)其中被内含子序列(斜体序列)所中断。编码含有标签(Maximilian :MRGSHHH和His6 =HHHHHH)的E2 蛋白(H384至Q673)的克隆是在经Bsu361和)(baI消化的PCR片段的连接之后进行的。实施例1 所使用的材料蛋白序列根据氨基酸的单字母代码从N-端至C-端表示。1. 1抗-核心蛋白单克隆抗体在4-周龄至 6-周龄的雌性 BALB/c JYco 小鼠(IFFA Credo, Les Oncins, L'Arbresle,France)的免疫之后获得单克隆抗体。小鼠经腹膜内免疫。方案的组成为经纯化的HCV核心蛋白(10微克/mi)注射7次，所述注射以2周的间隔进行。蛋白注射中第一次注射用完全弗氏佐剂进行而随后的注射用不完全弗氏佐剂进行。最终注射的4天后， 根据Kdhler和Milstein (1975，1976)所提出的方案选择脾细胞并将其与Sp2/0_Agl4小鼠骨髓瘤细胞融合。12至14天后，用免疫酶测定(ELISA)来评估细胞培养物的上清，其中将用于免疫的相同的抗原安置于固相至中。通过有限稀释的方法将分泌抗-核心蛋白抗体的阳性克隆亚克隆两次。腹膜内注射0. 5ml的降植烷和IO6杂交瘤细胞之后从小鼠获得腹水。 在蛋白-A Sepharose 4FF柱上根据Wiarmacia的说明书纯化抗-核心蛋白IgG单克隆抗体。用 Sulfo-NHS-LC-Biotin 试剂(Merck，Rockford，IL)根据 Gretch et al (1987)将经纯化的单克隆抗体生物素化用于抗原确定测试。一旦抗体可用，可以对HCV核心蛋白上被识别的表位进行鉴定。由所获得的 9种抗-核心蛋白单克隆抗体所进行的特异性表位的鉴定结果由Jolivet-Reynaud et al(1998)发表。通过此种方法选择出若干抗体，特别是19D9D6、7G9B8和7G12A8。所述 19D9D6单克隆抗体属于组I并且识别HCV核心蛋白的最初45个氨基酸，更准确地说是包含氨基酸25至45的区域。根据复合有19D9D6单克隆抗体的HCV核心蛋白的免疫优势抗原位点的晶体结构，看起来所识别的最小线性表位是QIVGGVYLL，其位于氨基酸四_37之间 (Menez et al(2003)) 1·2Ε2 蛋白为了进行ELISA测定，有必要产生并纯化E2包膜蛋白。通过PCR从HCV-JA株(基因型lb，质粒pCMV_C980)扩增编码包膜2的胞外结构域(根据Choo et al 1991，HCV基因组的aa 384-673)的DNA片段并将其克隆至稳定的表达载体ρΤ-α中。包膜基因在人EFl启动子和人脊髓灰质炎病毒IRES (“内部核糖体进入位点”)的控制下，其中含有小鼠DHFR(二氢叶酸还原酶)基因(选择性标记)。在克隆期间引入两个另外的“标签”特征序列，第一个标签称作Maximilian标签(单字母编码所表示的MRGSHHH氨基酸(aa)序列)，位于翻译的蛋白的N-末端基因的5’，而第二个标签 His6-标签(HHHHHH)，位于3’。通过测序来检查HCV E2构建物并在转染后通过免疫印迹 (抗-Maximilian标签和抗-HiS6-标签抗体)来验证其表达。CHO(中国仓鼠卵巢)DHFR-细胞的转染是通过ρΤ-αΕ2质粒的电穿孔来进行。无核苷的培养基被用于选择阳性克隆。将所述克隆扩增以提高整合至质粒内的编码包膜2的基因的拷贝数，其中使用浓度升高的甲氨蝶呤(MTX) :20ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、500ηΜ、1微摩尔、2微摩尔、4微摩尔和8微摩尔。亚克隆表达Ε2蛋白的细胞系，并选择了称为PTalpha-E2-M的克隆。此克隆的组成在图2中描述。其它COS-类型的真核表达系统可用于表达此E2蛋白。一旦已经扩增了 E2克隆，通过组氨酸标签开发出了纯化方案。该组氨酸标签使得可以用金属螯合物树脂(例如来自Qiagen公司的Ni-NTA)来直接从培养物上清中纯化HCV E2蛋白。洗脱后回收的HCV E2的量表明达到了柱的最大理论结合能力。应注意的是在洗涤缓冲液穿过柱后其中未检测到信号。或者，用Blue-PAGE试剂O^rmentas)来将电泳凝胶染色以评估所纯化的蛋白的纯度。在经纯化和浓缩的最终样品中，染色后仅检测到HCVE2 蛋白。因此纯度据估计为彡95%。最后，用micro-BCA试剂盒(Pierce)来测定所获得的样品。生产和纯化方法使得可以重复地在每升上清获得5mg的蛋白。当在CHO系统中表达PTalpha-E2-M克隆时，所表达的E2序列为如下的SEQ ID No. 1 MRGSHHHT HVTGGRVASSTQSLVSffLSQGPSQKIQLVNTNGSffHINRTALNCNDSLQTGFIA ALFYAHRFNASGCPERMASCRPIDKFAQGWGPITHWPNISDQRPYCWHYAPQPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVV GTTDRSGVPTYSWGENETDVLLLNNTRPPQGNWFGCTWMNSTGFTKTCGGPPCNIGGVGNNTLICPTDCFRKHPEAT YTKCGSGPWLTPRCLVDYPYRLWHYPCTINFTIFKVRMYVGGVEHRLNAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTT EffQHHHHHHo粗体部分表示由质粒所引入到序列内的氨基酸。没有这些来自质粒的氨基酸的序列由SEQ ID No. 2表示。
1.3NS3 蛋白将编码NS3解旋酶结构域蛋白(根据Choo QL et al (1991)，氨基酸1192-1458) 的基因，基因型lb，克隆至pMR80表达载体(Cheynet et al,1993)中作为与位于NS3解旋酶结构域基因的5’位置的6个组氨酸的融合物，如之前所描述的(Arribillaga et al., 2002)。简言之，将大肠杆菌(Escherichia coli)菌株JM109接种至补加了 100microg/ml 的氨苄青霉素的50ml LB培养基中(细菌用胰蛋白胨10g/l ；酵母提取物5g/l，NaCl IOg/ 1)，并在37°C培养过夜。随后的那天，将重组细菌菌株的培养物稀释至1/50并在37°C培养直至光密度(OD600)达到0. 6。加入ImM异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG) (Gibco/BRL) 后，在30°C伴随250rpm(旋转单位)的搅拌诱导NS3解旋酶结构域蛋白表达3至4小时。在这个时间之后，将细菌沉淀取至溶菌缓冲液中并进行超声破碎，继而在25000g离心30min。 将可溶部分用于在Ni-NTA琼脂糖柱Oiiagen)上根据厂商的指导来进行纯化。用300mM的咪唑纯化重组NS3解旋酶结构域蛋白并过夜透析至PBS中。在12% SDS凝胶电泳之后于考马斯蓝凝胶中分析该蛋白，并使用Voyager DE-PRO仪器通过MALDI-T0F分析进行质谱分析。所表达的NS3基因型Ib蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 3 MRGSHHHHHHGSVDESMDEF AVDFIPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQV AHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVRVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIEPNIRTGVRTITTGGPITYSTYGKFLAD GGCSGGAYDIIICDECHSTDWTTILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSITVPHPNIEEVALSNTGEIPFYGKA IPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLTGLGLNAVAYYRGLDVSVIPTSGDVWVATDALMTGFTCDFDSVIDCNT CV。粗体的部分表示由质粒引入该序列的氨基酸。没有这些来自质粒的氨基酸的NS3 的序列由SEQ ID No. 4表示。以相同的方式，根据同样的过程制备了 NS3解旋酶结构域蛋白(但是对应于基因型 la)。所表达的NS3基因型Ia蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 8 MRGSHHHHHHGSVDESMDEF AVDFIPVENLETTMRSPVFSDNSSPPAVPQSYQV AHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGSPITYSTYGKFLAD GGCSGGAYDIIICDECHSTDATSILGIGTVLDQAETAGARLTVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSTTGEIPFYGKA IPLEAIKGGRHLIFCHSKKKCNELAAKLVALGVNAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTCDFDSVIDCNT CV。粗体的部分表示由质粒引入该序列的氨基酸。没有这些来自质粒的氨基酸的NS3 基因型Ia的序列由SEQ ID No. 9表示。1.4NS4B 蛋白根据通常的固相方法制备的且衍生自NS4B基因型Ib的合成肽包含相对于HCV-I 株的从位置1909至1939的31个氨基酸(Choo et al (1991))。该序列是SEQ ID No. 5 =G EGAVQWMNRLIAFASRGNHVSPTHYVPESD。1.5NS5A 蛋白将编码NS5A蛋白(根据Choo Q. L. et al (1991)，氨基酸2212至2311)的基因， 基因型lb，克隆至pET21b质粒中并在大肠杆菌BL21中表达为与位于NS5基因的3’位置的6个组氨酸的融合物。简言之，将大肠杆菌(Escherichia coli)菌株JM109接种至补加了 100微克/ml的氨苄青霉素的50ml LB培养基中(细菌用胰蛋白胨10g/l ；酵母提取物 5g/l,NaCl 10g/l)，并在37°C培养过夜。随后的那天，将重组菌株的培养物稀释至1/50并在37°C培养直至光密度(OD6J达到0.6。加入0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) (Gibco/BRL)后，在30°C伴随250rpm的搅拌诱导NS5蛋白表达3至4小时。在这个时间之后，将细菌沉淀取至溶菌缓冲液中并进行超声破碎，继而在25000g离心30min。将稳定部分用于在Ni-NTA琼脂糖柱^jiagen)上根据厂商提出的指导来进行纯化。用300mM的咪唑纯化重组NS5蛋白并过夜透析至PBS中。通过用考马斯蓝染色的12% SDS凝胶上的电泳以及通过MALDI-T0F质谱(voyager DE-PRO)来分析该蛋白。所表达的NS5A蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 6 MAS KATCTTHHSPDADLIEANLLWRQEMGGNITRVESENKVVILDSFDPLRAEEDEREVSVAAEIL
rkskkfppalpiwarpdynpplleswkspdyvppavMRGSHHHHHH.粗体的部分表示由质粒引入该序列的氨基酸。没有这些由质粒引入的氨基酸的NS5A的序列由SEQ ID No. 7表示。实施例2 测试形式测定可以在96-孔平板中进行，其中抗体分别在单独的孔中，或者作为混合物在单个孔中。2. 1用抗原分离物的测定法的形式1.孔的包被a.抗-核心蛋白抗体在37°C于96-孔MaxiSorb微平板(Nunc)上，用在TBS缓冲液(用盐溶液缓冲的 Tris)中稀释至4微克/ml的抗-核心蛋白小鼠单克隆抗体19D9D6的200微升溶液来将孔包被2小时。用300微升的TBS-0. 05% Tween 20 (洗涤缓冲液)将该平板洗涤3次并继而于环境温度在含有 20g/l BSA(Sigma)和 0. lg/Ι 小鼠 IgG (Scantibodies laboratory)的 TBS-0. 05% Tween 20缓冲液(钝化缓冲液)中钝化过夜。用300微升的洗涤缓冲液将该平板洗涤3次。b. E2 蛋白在37°C于96-孔MaxiSorb微平板(Nunc)上，用在TBS缓冲液中稀释至1微克 /ml的抗原的200微升溶液来将孔包被2小时。用300微升的TBS-0. 05% Tween 20 (洗涤缓冲液)将该平板洗涤3次并继而于环境温度在含有20g/lBSA (Sigma)和0. lg/1小鼠 IgG (Scantibodies laboratory)的 TBS-0. 05% Tween 20 缓冲液(钝化缓冲液)中钝化过夜。用300微升的洗涤缓冲液将该平板洗涤3次。c. NS3、NS4B 和 NS5A用于每种蛋白的方案均与上述的E2蛋白的方案相同。2.样品的温育将孔与在钝化缓冲液中稀释至1/10的200微升样品在37°C温育1小时，继而用 300微升的洗涤缓冲液洗涤5次。3.缀合物的温育a.用于检测核心蛋白的缀合物。
将在钝化缓冲液中稀释至0. 1微克/ml的缀合了碱性磷酸酶的抗-核心蛋白小鼠单克隆抗体19D9D6的200微升溶液在37°C温育1小时。用300微升的洗涤缓冲液将孔洗涤5次。b.用于检测血清抗体的缀合物用在钝化缓冲液中稀释至0. 05微克/ml的缀合了碱性磷酸酶的抗-人IgGFab’ 的200微升溶液，将包被了 E2、NS3、NS4B或NS5A抗原的孔在37°C温育1小时。用300微升的洗涤缓冲液将孔洗涤5次。4.显影(develop)反应用200微升的pNPP底物(Sigma)在环境温度下显影30min，并通过加入50微升的IM NaOH而使其终止。在微平板读数器上于405nm读取信号。截断值从由3个阴性样品的平均值+3倍的此信号的标准偏差给出的信号进行计算。结果可以表示为信号/截断值(s/co)比率；大于1的s/co解读为阳性。2. 2使用抗原分离物的测定的结果用^^切！^^^乂Corp (HCV 9044、6212、6213、6214、6215 和 6227 组)以及 kracare BBI Diagnostics (PHV908、PHV910(M)、PHV911 和 PHV917(M)组)所提供的 10 组 HCV 患者的阳转血清(seroconversion)，来评估使用抗原分离物测试形式的检测的早期检测性 (precocity) 0所述样品是得自感染了 HCV的个体的纵向样品的血浆。结果表示为信号/ 截断值；大于1的值被认为是阳性的。用NS3基因型Ia蛋白来测试PHV911、9044、6212、6213和6215组，而用NS3基因型 Ib 蛋白来测试卩!^908、卩!^910(]\0、卩!^917(]\0 ,6214 和 6227 组。第一栏表示具有其ID身份数字的所述组的血清。每种抗原(E2、NS3、NS4B、NS5A)被单独测量并在随后的栏中表示出来。最后一栏表示用19D9D6抗体检测抗原的结果。表1:
权利要求
1.用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，和b)由以下所组成的多肽⑴HCV的E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位， 和(ii)HCV的E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及， 在适当的情况下，(iii) NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。
2.权利要求1的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽(ii)选自 NS4B和NS5A蛋白及其一或多种表位。
3.权利要求2的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽(ii)包含序列SEQ ID No. 5和/或SEQ ID No. 7的至少10个连续的氨基酸。
4.权利要求1-3任一项的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽 (i)包含序列SEQ ID No. 2的至少10个连续的氨基酸。
5.权利要求1-4任一项的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述多肽b)不包含任何肽(iii)。
6.用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)HCV的E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和c)HCV的E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及， 在适当的情况下，d)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。
7.权利要求6的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽c)选自 NS4B和NS5A蛋白及其一或多种表位。
8.权利要求7的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽c)包含序列SEQ ID No. 5和/或SEQ ID No. 7的至少10个连续的氨基酸。
9.权利要求6-8任一项的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，特征在于所述肽 b)包含序列SEQ ID No. 2的至少10个连续的氨基酸。
10.权利要求6-9任一项的用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其不包含任何 N53蛋白的肽d)。
11.用于在体外检测生物学样品中的HCV感染的方法，其包括检测所述生物学样品中存在的至少一种HCV抗原以及针对HCV的抗体，并且其中提供权利要求1-10任一项的支持物，在使得抗原-抗体复合物形成的条件下将所述支持物与所述生物学样品进行温育，显现所形成的抗原-抗体复合物。
全文摘要
本发明涉及用于检测HCV的免疫学测试的固体支持物，其上附着有a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，和b)至少一种由以下所组成的多肽(i)HCV E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和(ii)HCV E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，(iii)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位；或者a)至少一种针对HCV核心蛋白的抗体，b)HCV E2蛋白的肽，选自E2蛋白本身及其一或多种表位，和c)HCV E1、NS4B和/或NS5A蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位，以及，在适当的情况下，d)NS3蛋白的肽，选自所述蛋白本身及其一或多种表位。
文档编号G01N33/576GK102378914SQ201080015043
公开日2012年3月14日 申请日期2010年3月25日 优先权日2009年3月30日
发明者G·帕拉尼奥斯-巴卡拉, J-L·贝兰 申请人:生物梅里埃公司