信号放大微球、其在一步和多步分析放大方法中的用途和用于其生产的方法

专利名称：信号放大微球、其在一步和多步分析放大方法中的用途和用于其生产的方法
信号放大微球、其在一步和多步分析放大方法中的用途和用于其生产的方法本发明涉及包含蛋白质载体分子和信号前体分子的蛋白质微球及其生产方法，且还涉及这样的蛋白质微球在用于检测样品中靶物类的体外生物测定中的用途。本发明也涉及使用包括但不限于光学、磁学、电化学或化学方法的检测技术提高体外生物测定灵敏度水平的方法。还提供检测方法(直接方法和有效的序贯信号放大方法)和各种测试试剂盒。在将本发明的蛋白质微球应用于生物测定领域时，蛋白质微球在表面携带用于特异性识别和结合样品中的靶分子的亲和分子。生物测定例如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(F IA)、免疫凝集测定或者DNA、RNA或基因组测定是熟知的，并在检测研究中的分析物、人和兽医诊断领域、法医诊断、环境分析、食品分析和生物防御筛选空气或水中的危险物质方面起重要作用。生物测定基于至少一种标记生物分子与待检测分析物(靶标)的相互作用。标记为用于将相互作用“可视化”的工具。已知不同种类的标记，并且对上文所提及各种技术给出其名称=ELISA中的酶、RIA中的放射性同位素、FIA中的荧光团或用于蛋白质印迹、DNA印迹或RNA印迹的特异性标记。其它标记类型包括脂质体、免疫凝集测定中的胶乳颗粒以及染料、介体、金颗粒。生物测定的最重要要求是分析特异性和分析灵敏度。例如在将抗体的结合位点与其抗原(分析物)匹配或者使两条互补核酸链杂交的情况中，分析灵敏度由亲和分子或生物识别分子确定。生物测定的分析灵敏度也受到生物识别分子的影响，这是由于其与靶物类生物相互作用的亲和常数。标记作为表明反应已经在靶标与亲和分子之间发生的标记物起作用，并可用以下不同技术测量(i)光学测量染料的吸收或者荧光团发出的荧光或发光化合物或化学发光化合物发出的光，或者测量由凝集胶乳颗粒的光散射引起的浊度；( )放射性测量放射性同位素；(iii)电化学测量介体或电活性物质；或者(iv)磁学测量磁力。(V)压电测量质量变化。使用放射性同位素作为标记的放射免疫测定仍然被许多人认为是最灵敏的方法。该项非常有效的技术于1959年由Yalow和Berson提出，并代表分析化学、诊断学和医学的新时代。然而，该项技术具有的缺点是，有害污染人类和环境的风险由于所使用的放射性同位素而不能完全排除。与此同时，已开发和改进非放射性方法，以便达到类似的分析灵敏度。基于荧光、发光和吸收波谱的光学方法的重要性随着时间推移而增强并仍在增加。ELISA技术使用酶作为标记物以放大信号。在进行生物测定后，通过一种酶标记分子产生大量染料分子来放大分析物与探针之间的生物相互作用。可使用酶例如葡萄糖氧化酶(GOD, EC I. I. 3. 4.)、碱性磷酸酶(AP，EC 3. I. 3. I)或过氧化物酶(POD, EC I. 11. I. 7)，其中转换数分别为2000底物分子每秒(s’jOOOs—1和lOOOOs' ELISA技术的缺点是在方法中包括大量步骤和底物温育所需要的时间长度。荧光方法也已用于生物测定许多年并且持续高度令人关注。所有基于荧光的技术确保良好的灵敏度和10_8-10_18m的低检测限。特殊技术例如“时间分辨荧光”、化学和生物发光或基于供体与受体分子之间能量转移的技术可达到检测限为10-15-10_18M。现有技术已知的荧光免疫测定使用具有反应性功能连接基团的低分子量荧光标记(S0UTHWICK, P. L.等，Cytometry, 11,第 418-430 页，1990，MUJUMDAR, R. B.等，Bioconjugate Chemistry,4,第 105-111 页，1993, MUJUMDAR, R. B.等，Cytometry,10,第11-19页，1989)、荧光和染料着色颗粒(美 国专利号US 4837168和US 6013531及国际专利申请号WO 95/08772)或荧光团刺状(spiked)树枝状大分子(DE 197 03 718)。也已知采用负载有标记物的脂质体用于免疫测定中的信号放大(美国专利号US5756362、US 4874710和US 4703017)。实际上，这些方法的灵敏度受到可以溶解形式掺入到脂质体中的标记物质的量的限制。使用标记脂质体的另一个缺点是有限的脂质体稳定性。如以上所提及的那样，在生物测定开发中重要的是达到很高的分析灵敏度，其定义为对分析物浓度某些变化的信号响应程度(校准曲线的斜率)。在免疫化学测定中，无论是夹心测定还是竞争测定类型，分析灵敏度取决于浓度范围。影响分析灵敏度的另外两个因素为测定所必需的样品量和结果的总体反应时间。样品体积越高，并且所应用的总体反应时间越长，可检测和测量的分析物浓度越低。然而，在许多实际情况中，没有足够体积的样品可用(例如在药学研究中)或者组分分布在很大体积的样品中(例如牛奶中的抗生素残余物或空气中的生化防御性物质)。因此，关键性挑战是检测和/或测定在可得到的小样品体积中的很小量物质，或者检测和/或测定在大样品体积中以很低浓度分布的物质。因此，所应用的技术必须具有高的分析灵敏度，尤其是在很低的浓度范围内。为了可客观地在很低的浓度范围内比较各种已知技术的分析灵敏度，CLSI (美国的临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)和/或NCCLS)已经使用3个术语定义分析灵敏度空白限(Limit of Blank，LoB)、检测限(Limitof Detection, LoD)和定量限(Limit of Quantitation, LoQ)。对这些参数的数据进行评价并用于各项技术之间的比较。为了达到高的分析灵敏度，已经开发不同的生物标记系统以影响信号放大，例如酶生物标记、有机微晶生物标记和胶体金标记等。在酶生物标记系统中，酶分子将底物转化为具有光学或电化学性质的产物。由于高的转换率(例如使用辣根过氧化物酶)，或者由于很大的线性酶促反应(例如使用碱性磷酸酶)，可产生大量的产物(信号)以实现放大。另一种方法是放大检测信号的所谓“酶循环”技术，其提高检测灵敏度。一种使用信号产生物质的固体颗粒的新标记类别已经揭示于欧洲公开的专利申请号EP 1309867中。在曝露于释放剂时，存在于各固体颗粒中的数十亿信号产生分子可被立即释放以产生“超新星效果”。酶系统的信号放大原理基于转化酶底物以产生被释放到体相中的信号。固体颗粒系统的信号放大原理基于产生并释放大量的信号分子到反应室的体相中。然而，释放信号分子到体相中导致信号分子浓度的部分稀释并影响分析灵敏度。也已知使用胶体金标记的信号放大生物测定。Taton等(T. Andrew Taton, ChadA. Mirkin, Robert L. LetsingerZiScanometric DNA Array Detection with NanoparticleProbes”，Science, 289 (8) 1757-1760，2000)报道基于胶体金然后银增强的信号放大方法，其中胶体金促进银(I)还原到金颗粒表面上，导致大量银金属在胶体金标记上积累。银增强方法可检测低至5纳摩尔/升的寡核苷酸浓度。使用胶体金标记用于放大生物测定的另 一种方法基于生物亲和力诱导的胶体金聚集，其导致可用肉眼观察到的颜色从红色变为蓝色。生物亲和力诱导的聚集方法可检测10飞摩尔/升浓度水平的寡核苷酸。胶体金标记的信号放大原理基于信号分子积累或聚集到浓缩的小体积中。通过比较以上所提及标记系统的信号放大能力，具有信号分子积累(通过另一种亲和分子固定)在固体载体(例如在侧流装置中)上的集中区域的胶体金放大系统可达到高分析灵敏度。本发明的一个实施方案提供一种用于检测样品中靶分子的方法，所述方法确保优良的分析灵敏度、低检测限和任选通过序贯应用步骤的重复循环放大进一步增强检测信号。该方法完全不同于已知方法。本发明的另一个实施方案提供用于在研究和诊断领域中光学、电化学或化学检测靶分子的各种测试试剂盒。本发明的又一个实施方案提供标记的生物分子，其可被可靠地制备并可广泛用于生物测定，优选用于人和兽医诊断领域、法医诊断、环境分析、食品分析、生物防御筛选、DNA、RNA或基因组研究和诊断。定义亲和分子/生物识别分子亲和分子为通过其结构或通过其孔径或通过其电荷以一定亲和力(亲和力(affinity/avidity)常数)特异性地识别并与另一种物质结合的物质。存在许多不同的亲和分子，其通常可与某类物质一起使用(例如用于IgG-抗体的蛋白质A/G)或者可仅对一种物质非常特异(例如用于抗原的抗体、用于另一种序列的DNA序列或用于生物素的抗生物素蛋白、用于其底物的某些酶)。载体蛋白载体蛋白主要通过打开胞内S-S键并然后使其自组装形成分子间和分子内S-S键两者来参与形成海绵状微胶囊；分子间S-S键负责蛋白质微球的结构完整性。可使用的载体蛋白的实例包括-纤维状蛋白(例如细胞骨架蛋白、胞外基质蛋白等)-球状蛋白-可自血清和血浆分离的血蛋白(例如血红素蛋白、转运蛋白、DNA结合蛋白等)-脂蛋白-糖蛋白-免疫系统蛋白(例如单克隆抗体和多克隆抗体、抗原等)-重组蛋白-遗传修饰蛋白
-化学修饰蛋白-合成蛋白-各种蛋白的混合物-营养蛋白(例如贮藏蛋白、转运蛋白等)-酶-核酶通常，可使用人、动物和植物来源的任何含硫蛋白质或含硫肽(包括合成肽)。信号放大导致物理化学可测量信号的在两种以上的物质/反应伙伴之间的任何反应。在大多数情况中，免疫化学和杂交反应中的信号如此弱，以致于在得到可解释的结果的测量之前必须进行该信号的放大。放大可通过各种方法和技术进行。本发明提供使用信号放大微球的一步和多步放大方法两者。在多步放大方法的变体中，至少一个放大循环可使用EP 1309867(其公开内容通过引用结合到本文中)所公开类型的胶囊，该胶囊包封信号产生有机物质的固体颗粒并在其表面携带用于特异性识别和结合靶分子的亲和分子。微球本发明的微球不具有固体边界并可比作具有延伸到其内部中的孔隙的海绵球。它们为共价连接在一起的蛋白质分子网络。它们通过在新沉淀的模板(template)处吸附结合或共沉淀并通过打开分子内
S-S键形成。然后使所得的游离巯基能够形成新的分子间和分子内S-S键，分子间S-S键有助于微球形成。微球具有均匀结构并且不是通过逐层技术(例如在EP 1309867中公开的那些)形成的分层状胶囊。微球的直径为IOnm-Imm,优选地为400nm_10 μ m。尽管这些界限至少部分地落在微米范围之外，但是本文为方便起见使用术语“微球”，指由本发明的由蛋白分子网络形成的离散颗粒。信号放大微球信号放大微球为由载体蛋白+信号前体分子+亲和分子组成的微球。它们在其表面上具有对于待测定物质(靶标或分析物)的特异性结合特性。基质形成剂基质形成剂为与载体蛋白和/或信号前体分子混合以通过共沉淀形成微球模板的材料，例如碳酸钙、藻酸钙、多孔二氧化硅、寡糖或多糖(例如葡聚糖)。还原剂还原剂为引起微球模板中蛋白分子内的分子内二硫键打开的材料。还原剂的实例为二硫苏糖醇(DTT)。基质除去剂基质除去剂为用于从微球模板除去基质形成剂留下蛋白微球的材料，例如螯合剂(EDTA)、酸或碱。信号前体分子
信号前体分子为当与一种或多种其它试剂反应时得到可测量信号的分子。信号前体分子可为直接或间接类型。在直接信号前体的情况中，信号前体分子本身在活化时变化以产生待检测的信号。在间接信号前体的情况中，信号前体分子在活化时与另一物类反应并且该其它物类可负责产生待检测信号。信号前体分子可为低分子量信号前体分子或高分子量信号前体分子。低分子量信号前体分子信号前体分子可为低分子量物质，选自荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质。高分子量信号前体分子高分子量蛋白信号前体分子包括但不限于选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白及核酶的高分子量物质；选自抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、重组蛋
白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和适配体。存在许多来自不同化学类别的不同物质，其借助开始的反应得到可测量的信号。可测量的信号可基于-荧光测定法-发光测定法-在紫外、可见和近红外范围内的颜色变化-氧化还原电势的变化-在复合物形成或沉淀期间的质量变化靶分子该术语与“分析物”同义，其意指在分析方法(例如免疫测定)中测定的物质或化
学组分。发明详述在第一方面，本发明提供包含与信号前体分子结合的载体蛋白的微球，其中信号前体分子可活化以产生可检测信号同时保持与载体蛋白结合。在一个实施方案中，微球为杂合颗粒或异型颗粒，其意指载体蛋白与信号前体分子不同。在一个备选实施方案中，微球为同型颗粒，其意指载体蛋白与信号前体相同。如上所示，信号前体分子可为直接或间接类型。在直接信号前体的情况中，信号前体分子本身在活化时变化以产生待检测信号。在间接信号前体的情况中，信号前体分子在活化时与另一物类反应并且该其它物类可产生待检测信号。优选地，载体蛋白选自纤维状蛋白，包括但不限于细胞骨架蛋白或胞外基质蛋白；或球状蛋白，包括但不限于血蛋白、血红素蛋白、细胞粘附蛋白；或转运蛋白、生长因子、受体蛋白、DNA结合蛋白、免疫系统蛋白(包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体)、营养贮藏/转运蛋白、伴侣蛋白或酶；或者遗传修饰蛋白；或者重组蛋白或化学修饰蛋白和合成蛋白。更优选地，载体蛋白为在血液中循环的蛋白，例如牛血清白蛋白。该蛋白广泛用于生化应用，包括ELISA和免疫印迹。其具有良好稳定性并且可以低成本得到，因为大量的该蛋白可易于自牛血纯化,牛血为养牛业的副产物。信号前体分子可为低分子量物质，选自荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质。
优选地，低分子量信号前体分子为荧光团，例如荧光素、花青、碳花青、若丹明、咕吨、基于重氮染料的荧光物质以及小的荧光芳香和杂芳香分子。备选地，低分子量信号前体分子可为发色团，例如吡唑啉酮、蒽醌、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。最优选地，低分子量信号前体分子为荧光素衍生物，例如荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。
高分子量蛋白信号前体分子包括但不限于选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白及核酶的高分子量物质；选自抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、重组蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和适配体。优选地，高分子量信号前体分子为亲和分子，例如肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。备选地，高分子量信号前体分子可为酶，例如过氧化物酶、氧化还原酶、连接酶、聚合酶和转移酶。最优选地,高分子量信号前体分子为抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商标)。以上所描述的微球具有在lOnm-lmm，优选地在400nm-10iim范围内的尺寸。微球的结构优选地基本均匀；也就是说，形成微球的材料基本均一地分散并且它们遍及颗粒主体具有基本均一的密度和孔隙率。微球类似微型海绵或棉花球，并且尽管它们具有可识别的边界，但是它们不是具有限定边界的固体外壳的胶囊。当将微球与用于结合溶液中的靶标的亲和分子混合时，那些亲和分子将变为附着于微球。微球包含亲和分子，或者亲和分子可与微球表面缀合或者直接或通过连接分子与微球表面结合，或者通过吸附结合/附着。连接分子包括但不限于生物分子例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、NeutrAvidin (商标)、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交联剂。然而在特殊情况中，一些亲和分子将扩散进入微球内部并也将附着于那里。当然，这种扩散的程度将取决于亲和分子的相对尺寸和微球的孔径。附着于微球的亲和分子可为生物识别分子，例如特异性肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可为抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分。核酸可为DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、适配体及其部分。碳水化合物的实例包括单糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配体可为生物素或生物素衍生物、类固醇或激素、辅因子或辅酶、活化剂、抑制剂、酶的假底物或辅基、药物、变应原或半抗原。在第二方面，本发明提供一种产生本文定义的微球的方法，微球包含与信号前体分子结合的载体蛋白，其中信号前体分子可活化以产生可检测信号同时保持与载体蛋白结合。该方法包括通过搅拌在溶液中(优选在水溶液中)将载体蛋白和信号前体分子与基质形成剂混合；伴随搅拌加入小分子还原剂；洗涤除去小分子还原剂；伴随搅拌加入基质除去剂；和洗涤除去基质形成剂并留下与信号前体分子结合的载体蛋白微球。优选地，该方法在含有含水试剂的水溶液中，优选在室温下进行。优选的混合方法为用磁力搅拌器搅拌。
基质形成剂的作用是在微球模板中捕获蛋白分子。基质形成剂可为碳酸钙、藻酸钙、多孔二氧化硅或者寡糖或多糖(例如葡聚糖)。优选地通过将碳酸钠溶液加入载体蛋白、信号前体分子和氯化钙在溶液中的混合物中形成碳酸钙。微球的尺寸可通过控制搅拌速度来控制。微球的密度可通过调节载体蛋白、信号前体分子、基质形成剂和还原剂的相对比例来控制。如前所述，微球可为杂合颗粒，其中载体蛋白与信号前体分子不同。备选地，载体蛋白与信号前体分子可相同。而且，信号前体可如以上所解释的那样为直接或间接的。优选地，载体蛋白选自纤维状蛋白，包括但不限于细胞骨架蛋白或胞外基质蛋白；或球状蛋白，包括但不限于血蛋白、血红素蛋白、细胞粘附蛋白；或转运蛋白、生长因子、受体蛋白、DNA结合蛋白、免疫系统蛋白(包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体、营养贮藏/转运蛋白、伴侣蛋白或酶；或者遗传修饰蛋白；或者重组蛋白或化学修饰蛋白和合成
蛋白。更优选地，载体蛋白为在血液中循环的蛋白，例如牛血清白蛋白。信号前体分子可为低分子量物质，选自荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质。优选地，低分子量信号前体分子为荧光团，例如荧光素、花青、碳花青、若丹明、咕吨、基于重氮染料的荧光物质以及小的荧光芳香和杂芳香分子。备选地，低分子量信号前体分子可为发色团，例如吡唑啉酮、蒽醌、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。最优选地，低分子量信号前体分子为荧光素衍生物，例如荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。高分子量蛋白信号前体分子包括但不限于选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白及核酶的高分子量物质；选自抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、重组蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和适配体。优选地，高分子量信号前体分子为亲和分子，例如肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。备选地，高分子量信号前体分子可为酶，例如过氧化物酶、氧化还原酶、连接酶、聚合酶和转移酶。最优选地,高分子量信号前体分子为抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商标)。产生微球的方法可进一步包括将亲和分子附着于微球的表面。亲和分子可例如通过范德华力、氢键或静电相互作用与微球的外表面缀合，或者它们可直接或经连接分子与微球的外表面共价结合。如果间接结合，连接分子包括但不限于生物分子例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、NeutrAvidin (商标)、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交联剂。可在加入基质除去剂步骤之前将亲和分子加入反应混合物中。典型的亲和分子可为生物识别分子，例如特异性肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体、受体分子和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可为抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分。核酸可为DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、适配体及其部分。碳水化合物的实例包括单糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配体可为生物素或生物素衍生物、类固醇或激素、辅因子或辅酶、活化剂、抑制剂、酶的假底物或辅基、药物、变应原或半抗原。在第三方面，本发明提供一种用于使用微球检测样品中的一种或多种靶分子的信号放大方法，微球包含与信号前体分子键合的载体蛋白，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号同时保持与载体蛋白结合，并且所述微球在其表面上具有用于特异性识别和结合所述靶分子的亲和分子，所述方法包括(a)温育靶分子与所述微球；(b)分离在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球与没有亲和分子-靶分子复合物的微球；
(C)用显示剂处理所分离的在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球以活化信号前体分子产生信号，和(d)检测或定量信号。因此产生的信号与样品中靶分子的量直接或间接相关。另外，信号为局部的，因为信号前体分子保持在微球内结合并且未被释放到溶液中。因此，不存在信号稀释。恰恰相反，信号放大，因为对于在温育步骤期间形成的每个亲和分子-靶分子复合物，存在许多在活化步骤期间活化的信号前体分子。优选地，载体蛋白选自纤维状蛋白，包括但不限于细胞骨架蛋白或胞外基质蛋白；或球状蛋白，包括但不限于血蛋白、血红素蛋白、细胞粘附蛋白；或转运蛋白、生长因子、受体蛋白、DNA结合蛋白、免疫系统蛋白(包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体)、营养贮藏/转运蛋白、伴侣蛋白或酶；或者遗传修饰蛋白；或者重组蛋白或化学修饰蛋白和合成蛋白。更优选地，载体蛋白为在血液中循环的蛋白，例如牛血清白蛋白。信号前体分子可为低分子量物质，选自荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质。优选地，低分子量信号前体分子为荧光团，例如荧光素、花青、碳花青、若丹明、咕吨、基于重氮染料的荧光物质以及小的荧光芳香和杂芳香分子。备选地，低分子量信号前体分子可为发色团，例如吡唑啉酮、蒽醌、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。最优选地，低分子量信号前体分子为荧光素衍生物，例如荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。高分子量蛋白信号前体分子包括但不限于选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白及核酶的高分子量物质；选自抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、重组蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和适配体。优选地，高分子量信号前体分子为亲和分子，例如肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。备选地，高分子量信号前体分子可为酶，例如过氧化物酶、氧化还原酶、连接酶、聚合酶和转移酶。最优选地，高分子量信号前体分子为抗生物素蛋白和NeutrAvidin (商标)。亲和分子可为生物识别分子，例如肽、蛋白、核酸、碳水化合物、具有低分子量的配体、受体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可为抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分。单链核酸可为DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、适配体及其部分。碳水化合物的实例包括单糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配体可为生物素或生物素衍生物、类固醇或激素、辅因子或辅酶、活化剂、抑制剂、酶的假底物或辅基、药物、变应原或半抗原。特别优选的微球形式为这样的微球形式其中载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)且信号前体分子选自荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素二乙酸酯马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。显示剂适合在活化步骤中“活化”这些荧光素衍生物，例如通过化学反应(例如碱性试剂)或生化反应(例如酯酶)将其转化为荧光素，藉此产生可检测信号。备选地，活化步骤可通过物理方法(例如微波加热)进行。在第四方面，本发明提供另一种使用微球检测样品中的一种或多种靶分子的信号放大方法，微球包含与第一种信号前体分子结合的载体蛋白，其中所述第一种信号前体分
子可活化以产生可检测信号同时保持与载体蛋白结合，并且所述微球在其表面上具有用于特异性识别和结合所述靶分子的亲和分子，所述方法包括(a)温育靶分子与所述微球；(b)分离在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球与没有亲和分子-靶分子复合物的微球；(C)用释放剂处理所分离的在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球以分解微球并释放第一种信号前体分子；(d)用另一批微球处理所释放的第一种信号前体分子，另一批微球用对所释放的第一种信号前体分子具有亲和力的第二种亲和分子功能化，所述微球包含与第二种信号前体分子结合的载体蛋白，其中所述第二种信号前体分子可活化以产生可检测信号同时保持与载体蛋白结合；(e)分离在其表面具有第二种亲和分子-第一种信号前体分子复合物的微球与没有第二种亲和分子-第一种信号前体分子复合物的微球；(f)用显示剂处理所分离的在其表面具有第二种亲和分子-第一种信号前体分子复合物的微球以活化第二种信号前体分子产生信号，和(g)检测或定量信号。因此产生的信号与样品中靶分子的量有关。信号在两个不同阶段被放大许多倍，因为对于在温育步骤(a)期间形成的每个亲和分子-靶分子复合物，存在许多在步骤(C)中被释放的第一种信号前体分子，然后将第一种信号前体分子与一批被功能化以对第一种信号前体分子具有亲和力的不同微球一起温育。加入从与不同微球一起的复合物释放的许多第一种信号前体分子，并在除去没有与所释放的第一种信号前体分子形成复合物的那些微球之后，加入活化剂以活化在每个复合微球中的许多第二种信号前体分子以产生信号。应当理解，信号前体分子的这种释放和再复合的循环可重复许多次以达到非常显著的放大倍数。也就是说，在进行步骤(f)和(g)之前，步骤(c)-(e)可重复l_n次，其中n为正整数，其中至少在最后重复循环中的信号前体分子可活化以产生可检测信号。靶分子代表第一级分析物；第一种信号前体分子代表第二级分析物，并且第二种信号前体分子代表第三级分析物等。在一个变体中，仅在最后重复循环中的信号前体分子需要是可活化的以产生可检测信号。在早期循环中释放的信号前体分子不需要为可活化的以产生可检测信号，它们可为结合分子例如抗生物素蛋白，但是被看作是信号前体分子，因为它们是最终导致信号的级联反应的重要部分。可在该放大方法中掺入高置信度和可靠性，即通过使用充分理解和广泛使用的对(例如抗生物素蛋白和生物素)作为前体分子-亲和分子对，特别是在所述方法的后期，即在已经选择第一种靶分子-亲和分子对适合于待检测或测定的具体靶标之后。注意，如果最终信号前体分子保持在最终微球内结合并且不被释放到溶液中，那么在最后放大步骤中信号可为局部的。这使信号的稀释最小。另一方面，以其未释放状态检测最终信号前体 分子是不必要的；如果释放，那么它们也可在溶液中被测定或者也可激发另一个放大步骤。例如，如果具有高转换率的酶为最终信号前体分子，那么可使得酶能够对荧光或发光的底物起作用。另一个实例可使用包封FDA作为最终信号前体分子。在加入显示剂例如氢氧化钠水溶液时，FDA溶解、水解和释放大量荧光素分子，并因此提供放大的荧光信号。优选地，至少对于在温育步骤(a)中使用的微球，载体蛋白选自纤维状蛋白，包括但不限于细胞骨架蛋白或胞外基质蛋白；或球状蛋白或血蛋白，包括但不限于血红素蛋白、细胞粘附蛋白；或转运蛋白、生长因子、受体蛋白、DNA结合蛋白、免疫系统蛋白(包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体)、营养贮藏/转运蛋白、伴侣蛋白或酶；或者遗传修饰蛋白；或者重组蛋白和合成蛋白。更优选地，载体蛋白为在血液中循环的蛋白，例如牛血清白蛋白。同样地，至少对于在温育步骤(a)中使用的微球，信号前体分子可为低分子量物质，选自荧光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质。优选地，低分子量信号前体分子为荧光团，例如荧光素、花青、碳花青、若丹明、咕吨、基于重氮染料的荧光物质以及小的荧光芳香和杂芳香分子。备选地，低分子量信号前体分子可为发色团，例如吡唑啉酮、蒽醌、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。最优选地，低分子量信号前体分子为荧光素衍生物，例如荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。高分子量蛋白信号前体分子包括但不限于选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白及核酶的高分子量物质；选自抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、重组蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白和糖蛋白的肽或蛋白、核酸、核酶和适配体。优选地，高分子量信号前体分子为亲和分子，例如肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。备选地，高分子量信号前体分子可为酶，例如过氧化物酶、氧化还原酶、连接酶、聚合酶和转移酶。最优选地，高分子量信号前体分子为抗生物素蛋白和NeutrAvidin(商标)。至少对于在温育步骤(a)中使用的微球，亲和分子可为生物识别分子，例如特异性肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。肽或蛋白可为抗体(包括单克隆和多克隆抗体)、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分。核酸可为DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、适配体及其部分。碳水化合物的实例包括单糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。低分子量配体可为生物素或生物素衍生物、类固醇或激素、辅因子或辅酶、活化剂、抑制剂、酶的假底物或辅基、药物、变应原或半抗原。特别优选的最终微球形式为这样的微球形式其中载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)且信号前体分子选自荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)和荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。显示剂适合在活化步骤中“活化”这些荧光素衍生物，通过化学反应(例如使用碱性试剂)，或通过生化反应(例如酯酶)将其转化为荧光素，使得产生可检测信号。用于分解微球并释放信号前体分子的化学释放剂可为小分子还原剂，其有效断裂微球中的硫-硫键(分子间和分子内)。二硫苏糖醇(DTT)为特别优选的释放剂。微球的分解也可通过声处理、高温、光辐射或PH变化实现。下面参照附图仅通过实施例描述本发明，其中图I为图解说明用于制造本发明微球的技术的示意图；图2为本发明第一方面的蛋白微球的相差显微图；图3显示具有不同孔隙率的蛋白微球扫描电子显微镜图像；上面一行图像显示22000放大率和下面一行图像显示150000放大率；图4为显示夹心生物测定中信号积累和定位工作原理的示意图；图5为用山羊抗小鼠IgG (Gt-a -MIgG)功能化的BSA-FDA微球的固相夹心荧光免疫测定的示意图；图6为图解说明放大循环原理的示意图。首先参照

图1，视图(a)显示含有氯化钙(CaCl2)、载体蛋白和信号前体分子的混合溶液的第一个容器100，和含有碳酸钠(Na2CO3)溶液的第二个容器200。将两个容器的内容物迅速混合，使得蛋白和信号前体分子Uf^BBSA-FDA)通过共沉淀而被捕获在支持碳酸钙(CaCO3)微球模板300中。视图(b)图解说明在下一步中所发生的。将具有所捕获的蛋白和信号前体分子的CaCO3微球模板300用还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理，其引起蛋白分子中的分子内二硫键打开。然后，在多个重复洗涤步骤中除去DTT。在蛋白分子之间形成新的分子间和分子内二硫键。新形成的分子间二硫键有助于蛋白分子装配成为也含有信号前体分子的微球20。除去CaCO3模板材料，剩下蛋白/信号前体分子微球20而不需要使用化学交联剂。现转到图2，这是根据以上方法生产的蛋白微球的相差显微图。它们显示良好的尺寸均一性，具有与平均值的少许偏差。也重要的是微球带有相同的表面电荷，使得它们不粘附在一起。在图中清楚显示不存在粘附在一起。而且，窄的尺寸分布对于定量分析是重要的。图3显示使用在0. Ol-ImM范围DTT浓度于15-60分钟时间内制备的BSA微球的SEM显微图。所得微球直径相似，微球的表面粗糙度和孔径随着DTT浓度降低而增加。较高的DTT浓度导致BSA分子内较高程度的分子内二硫键断裂，即蛋白分子内的游离巯基数目增加。在通过洗涤除去DTT之后(使用重复洗涤步骤)，BSA分子内的游离巯基自组装形成新的分子间和分子内二硫键，分子间二硫键有助于形成其在除去碳酸钙模板后仍然存在的蛋白微球。使用低DTT浓度制造的微球含有较少的分子间二硫键并因此为更加多孔的。
现转到图4，这是显示在使用本发明微球的夹心生物测定中信号积累和定位工作原理的示意图。在视图(a)中，显示在其表面具有亲和分子50的固相支持体10。微球20在这里表示为含有与信号前体分子40结合的载体蛋白30的稍扁平的圆。注意这是示意图并且已经给予微球仅用于图解说明目的的实线边界。而且，为清楚起见已经省略在载体蛋白分子之间的S-S结合线(以及在载体蛋白分子与信号前体分子之间的键)。实际上，微球不是具有实线边界的胶囊；恰恰相反，其象具有延伸到其内部中的孔并由均一分布的相互结合的载体蛋白分子和信号前体分子形成的微型海绵球。微球20具有在其表面附着的亲和分子50。在固相支持体10上的亲和分子50之一与微球上的亲和分子50之一之间的夹有
靶分子或分析物60。固相支持体可为膜、微量滴定板的孔、磁珠或者更通常为用于免疫或杂交分析的任何固相平台。在视图(b)中，显示通过靶分子60在两个亲和分子50之间的“夹心”仍然附着于固相支持体10的相同微球20。然而，在该视图中，显示在用显示剂处理之后的微球20，并且目前具有用微型太阳符号表示的信号分子40%其中先前其具有用菱形表示的信号前体分子40。简而言之，图4(a)显示关闭的微球，而图4(b)显示点亮的微球。仅为图解说明的目的，图4显示固相支持体10上和微球20表面上的相同类型的亲和分子50。然而，在大多数实际情况中，两种亲和分子不同，除了当使用单克隆抗体时或者如果靶分析物具有重复的表位之外。实际上，许多微球生物标记将在生物测定中特异性结合各自的靶分析物，这取决于分析物(靶标)分子尺寸和微球尺寸。在免疫学测定中，微球生物标记将特异性结合抗原靶分子的表位；在杂交测定中，微球生物标记将结合特异性DNA序列靶分析物。在加入显示剂时，在生物标记中的数百万信号产生前体分子将转化为高度荧光分子，并且生物标记将点亮并产生局部信号。图5图解显示用山羊抗小鼠IgG (Gt-a -MIgG)功能化的BSA-FDA微球的固相夹心荧光免疫测定。在视图(a)中，显示温育步骤，其中Gt-a-MIgG附着于固相支持体。在步骤(b)中，结合在固相支持体上的Gt- a -MIgG暴露于含有靶物类或分析物MIgG的溶液。靶物类被所结合的Gt-a-MIgG捕获。洗涤步骤(未显示)除去未被捕获的靶物类。在步骤(C)中，通过使用由用作为其表面上的亲和分子的Gt- a -MIgG功能化BSA-FDA形成的微球处理捕获的靶物类进行夹心测定。在另一个洗涤步骤(未显示)中，洗去未与捕获的靶物类结合的微球。在步骤(d)中，加入显示剂并且将FDA水解为荧光素产生可见的局部信号。图6图解说明放大循环原理。在视图(a)中，显示通过靶互补核酸30和与微球20’缀合的亲和分子50’之间的夹心杂交，单个捕获分子60在其一端附着于固相支持体10’，而在其另一端附着于微球20’。如图示地，显示捕获分子60作为与靶互补核酸30和与微球20’缀合的亲和分子50’杂交的靶核酸。视图(b)显示在用引起微球分解的释放剂处理之后的微球。在该视图中，微球刚刚开始破裂并释放多个(X)第二级分析物40’进入溶液中。第二级分析物可为例如抗生物
素蛋白。在视图(c)中，显示第二级分析物40’被亲和分子50”捕获在不同的固相支持体10”上。在其中第二级分析物40’为抗生物素蛋白的实例中，亲和分子50”可为与白蛋白12”结合的生物素。在该形式中，其将附着于固相支持体10”。捕获的第二级分析物40’被夹在与固相支持体10”间接结合的亲和分子50”和与不同微球20”结合的另一个亲和分子50”之间。视图(d)显示在用引起微球分解的释放剂处 理之后的微球20”。在该视图中，微球刚刚开始破裂并释放多个第二级分析物40”。因此，单个靶分子60可在放大两个循环之后产生千百万个第二级分析物。视需要，可进行进一步的放大循环。下面参照各实施例具体描述本发明，但是应理解这些实施例是非限定性的。实施例I BSA-FDA微球的制各步骤I :BSA框架的形成将BSA(10mg/mL)在氯化钙(0. 5mol/L)中的溶液与碳酸钠溶液(0. 5mol/L)迅速混合。碳酸钙形成并且仅微溶，在碳酸钙基质的核心/内部捕获BSA。碳酸钙起捕获BSA的模板的作用。下一步骤是打开BSA分子内S-S键并形成新的BSA分子间S-S键。每一步骤包括若干洗涤和离心循环。将所得的负载有BSA的碳酸钙微球与浓度在0. Ol-ImM范围内的二硫苏糖醇(DTT)溶液(pH 7.5)在室温下温育15-60分钟。随后，通过离心(2000rpm，2分钟)和再分散循环，用缓冲液(pH 7. 4)洗涤负载有BSA的碳酸钙微球5次。加入DTT引起BSA中分子内硫-硫键还原/断裂，同时在这些洗涤步骤中除去DTT导致在BSA分子之间形成新的分子内和分子间硫-硫键以将蛋白保持在一起并形成微球。步骤2 :信号分子与BSA框架-基质的结合向重悬的含有碳酸钙的微球中加入荧光素二乙酸-5-异硫氰酸酯(lmg/mL)，并于室温下温育反应混合物I小时，以在BSA氨基和荧光素二乙酸酯的硫氰酸酯之间形成共价键。St印3 :BSA-FDA微球的功能化使用EDC/NHS化学进行山羊抗小鼠抗体与带有信号分子的微球的结合。步骤3. I :亲和分子的溶液制备将含有山羊抗小鼠IgG的溶液(0. 2mg/mL)加入到含1_乙基_3_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别为2mM和5mM的pH 7. 4的MES缓冲液中。在振荡下使溶液于室温反应15分钟。步骤3. 2 :带有抗体的微球的功能化在温育15分钟后，将用于结合山羊抗小鼠IgG的活化亲和分子的溶液加入到预洗涤的BSA-FDA微球的悬浮液中，并在振荡下使混合物于室温反应2小时。将与BSA-FDA微球结合的亲和分子的溶液于1800rpm下离心2分钟。
除去上清液并用2mL的MES缓冲液(pH 7. 4)重悬沉淀。用MES缓冲液(pH 7. 4)将亲和分子功能化的BSA-FD微球洗涤3次，并重悬于2mL的MES缓冲液(pH 7.4)中。步骤4 :碳酸钙模板的除去然后将IOmL的0. 2M EDTA加入到BSA-FDA微球悬浮液中，并搅拌整个体系5分钟。EDTA处理从微球除去碳酸钙基质。然后使反应混合物于室温下在3000rpm下经历离心2分钟。除去上清液，并将抗体功能化的BSA-FDA-微球沉淀重悬于2mL的MES缓冲液(pH7. 4)中。实施例2 使用藻酸钙基质形成剂的BSA框架的形成将BSA(10mg/mL)在氯化I丐(0. 5mol/L)中的溶液与藻酸钠(0. 5mol/L)溶液迅速混合。藻酸钙形成并且仅微溶，在碳酸钙基质的核心/内部捕获BSA。藻酸钙起捕获BSA的模板的作用。下一步骤是打开BSA分子内S-S键并形成新的BSA分子间S-S键。每一步骤包括若干洗涤和离心循环。将所得的负载有BSA的藻酸钙微球与浓度在0. Ol-ImM范围内的二硫苏糖醇(DTT)溶液(pH 7.5)在室温下温育15-60分钟。随后，通过离心(2000rpm，2分钟)和再分散循环，用缓冲液(pH 7. 4)洗涤负载有BSA的藻酸钙微球5次。加入DTT引起BSA中分子内硫-硫键的还原/断裂，同时在这些洗涤步骤中除去DTT导致在BSA分子之间形成新的分子内和分子间硫-硫键以将蛋白保持在一起并形成微球。实施例3 测定小鼠-IgG的夹心型测定在夹心型测定中进行小鼠IgG的测定。在测定期间，小鼠IgG特异性结合在2种抗体之间。因为使用多克隆山羊抗体，所以抗体相同。用山羊抗小鼠IgG抗体吸附性包被固相(例如微量滴定板的孔)。第二种抗体为与BSA-FDA微球结合的山羊抗小鼠。该实施例概略性地示于图5。将100 ii L的Gt- a -MIgG (2ng/ U L的包被缓冲液)转移至微量滴定板并于4°C下温育过夜。然后用洗涤缓冲液(IOmM PBS, 0. 1% (w/v)BSA,0. 5% (w/v) Tween-20 (Tween %商标))洗漆微量滴定板3次。然后用300 ii L的后包被溶液(post coating solution, PCS)于37°C下将孔封闭30分钟。将不同浓度(1-100 u g/L)的100 y L的MIgG分别加至各孔中，并于37°C下温育I小时。在洗去未结合的MIgG后，将Gt-a-MIgG-{BSA-FDA微球}的悬浮液分配到孔(100 y L/孔)中，并将微量滴定板于37°C下再次温育I小时。在温育后，用洗涤缓冲液洗去过量的Gt- a -MIgG- {BSA-FDA微球}。然后将100 u L释放溶液的等分试样加至每孔中，并测量各孔的荧光强度。实施例4 抗生物素蛋白微球的制备实施例4为其中载体蛋白和亲和结合分子为一个和相同分子的实施例。步骤I :抗生物素蛋白框架的形成
将抗生物素蛋白(10mg/mL)在氯化钙(0. 5mol/L)中的溶液与碳酸钠溶液(0. 5mol/L)迅速混合。碳酸钙形成并且仅微溶，沉淀并在其所形成的结晶表面上吸引/吸附抗生物素蛋白。碳酸钙起用于沉淀抗生物素蛋白的模板的作用。下一步骤是通过打开其分子内S-S键并形成抗生物素蛋白分子间S-S键来交联抗生物素蛋白。每一步骤包括若干洗涤和离心循环。将所得的负载有抗生物素蛋白的碳酸钙微球与浓度在0. Ol-ImM范围内的二硫苏糖醇(DTT)溶液(pH 7. 5)在室温下温育15-60分钟。随后，通过离心(2000rpm，2分钟)和再分散循环，用缓冲液(PH 7.4)洗涤负载有抗生物素蛋白的碳酸钙微球5次。加入DTT引起抗生物素蛋白中分子内硫-硫键还原/断裂，同时在这些洗涤步骤中除去DTT导致在抗生物素蛋白分子之间形成分子内和分子间硫-硫键以将蛋白保持在一起并形成微球。蛋白质中被还原的SH键经历自组装形成新的分子内和分子间硫-硫键。步骤2:信号分子的功能化这通过仍不存在亲和结合分子的条件下使特异性检测分子(亲和分子)与含有游离氨基、SH和羧基的抗生物素蛋白结合来实现，抗生物素蛋白用于使亲和分子与微球共价
彡口口 对于含有抗生物素蛋白的微球的功能化步骤的详情参见上文实施例2。对于链霉亲和素或去糖基化抗生物素蛋白，例如NeutrAvidin (商标)，功能化步骤简单得多，因为它们直接结合靶标(分析物)_识别分子，即结合亲和分子。如果使用链霉亲和素或NeutrAvidin (商标)，那么正常生物素化的亲和分子(例如生物素化抗体)通过链霉亲和素对生物素的强结合力(K约为IO16)与链霉亲和素或NeutrAvidin (商标)直接结合。因此，使用例如EDC/NHS的化学缀合是不必要的。步骤3 :碳酸钙溶出微球这通过将EDTA(0. 2mol/L)加入到抗生物素蛋白微球的悬浮液中来进行。在该步骤之后，已制备抗生物素蛋白信号前体微球。值得注意的是，如同在上文实施例I中，可在功能化步骤之前进行除去碳酸钙模板的步骤。实施例5 固相直接测定(双重放大系统，DNA测定模型随后是生物素/抗生物素蛋白模型)这是一个其中载体蛋白和亲和结合分子为一个和相同分子的实施例，并证实其在新的信号放大循环技术中的效用。该实施例概略性地示于图6。在夹心型测定中进行人乳头瘤病毒(HPV)DNA的测定。在测定HPV期间，DNA-链与其生物素化互补核酸特异性杂交。然后使该杂交产物与由NeutrAvidin (商标)制成的微球反应。加入引起抗生物素蛋白微球分解的释放剂，以使抗生物素蛋白释放到溶液中。然后在随后的固相直接测定中将释放的抗生物素蛋白作为分析物处理。 步骤I :固相直接测定A (HPV DNA模型)将100 ii L的HPV探针(HPV 16)转移至微量滴定板孔中，并于4°C下温育过夜。然后用300 u L的洗涤缓冲液将微量滴定板洗涤5次。然后用300 u L的封闭溶液于37°C下将孔封闭30分钟。然后用300 u L洗涤缓冲液将微量滴定板洗涤5次。将30 ii L的IM NaOH和不同稀释度的50 ii L的PCR (生物素化HPV-病毒-DNA)产物分别加至各孔中，使其于室温下静置10分钟。然后加入50 L的中和缓冲液，并在水槽(wet box)中于65°C下温育30分钟。然后用300 u L的洗涤缓冲液将微量滴定板洗涤5次。将100 u L的抗生物素蛋白微球分别加入到各孔中，并于37°C下温育30分钟。在温育后取出板，并用DNA洗涤缓冲液洗涤5次。将120 u L的浓度在0. Ol-ImM范围内的二硫苏糖醇(DTT)溶液(pH 7. 5)加至各孔中，并于室温下静置15-60分钟。加入DTT引起抗生物素蛋白中分子间硫-硫键的还原/断裂，使得微球能够分解并将抗生物素蛋白释放到溶液中。释放的抗生物素蛋白分子变成分析物(“第二级分析物”)，用于随后的固相测定(生物素/抗生物素蛋白模型)。
步骤2 :固相直接测定B(生物素/抗生物素蛋白模型)在4°C下将IOOii L的BSA-生物素(2ng/ii L的包被缓冲液)直接涂布到在0. lmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9. 6)中的Nunc Maxisorp 96-孔微量滴定板(Nunc为NuncInternational, Rochester, NY 的商标)上过夜。在用洗漆缓冲液(IOmM PBS, 0. I % (w/v)BSA,0. 5% (w/v) Tween-20 (Tween 为商标))冲洗 3 次之后，用 300 u L 的 I. 0% BSA 溶液于37°C下将孔封闭半小时。然后将板洗涤4次，并将相应的“第二级分析物”(抗生物素蛋白)的溶液分配到各孔(100 y L/孔)中。于37°C下再次温育微量滴定板I小时。在洗去未结合的第二级分析物之后，将生物素-FDA微球悬浮液分配到各孔中(100 U L/孔)，并于37°C下将微量滴定板再次温育I小时。在温育之后，用洗涤缓冲液洗去过量的生物素-FDA微球。然后每孔加入100 UL显示剂的等分试样，用于荧光强度的测量。如根据上文显而易见的，本发明为通用和有用的。系统始终使用简单化学/生物化学和温和条件。制备时间不长并且在放大方案中，可实现许多多重放大而无高技术要求(例如需要使用PCR)。微球技术可用于广泛种类的检测形式，包括但不限于流通装置、微流装置和侧流装置。其也可与珠(磁珠和非磁珠两者)和微量滴定板孔一起使用。另一种应用为在免疫化学、组织学领域中以及在用于检测细胞结构或者其另外条带的蛋白质印迹、DNA印迹和RNA印迹中使用这些信号分子，所述细胞结构或者其另外条带迄今无法检测，因为例如FITC-标记的亲和分子在其分析灵敏度限度内起作用。本发明信号微球的使用在免疫化学、组织学及所有各种形式的检测技术中开启了新的可能性。经典的检测原理可非常容易地改进数个数量级。因此，本发明也可提供用于检测和/或测定样品中的靶分子的各种测试试剂盒，所述试剂盒包含含有与信号前体分子键合的载体蛋白的微球，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持与载体蛋白键合，所述微球适于在表面携带用于特异性识别和结合靶分子的亲和分子。另一种试剂盒形式可进一步包含用于修饰亲和分子以使其适于与微球表面结合的试剂和用于在微球与亲和分子之间进行结合反应的试剂。另一种测试试剂盒形式可包含这种类型的测试装置，例如侧流装置、流通装置或者测杆装置其中将待分析的流体样品加到测试装置的吸附材料一端。流体通过毛细作用力迁移至另一端，毛细作用力任选通过位于所述另一端的吸垫增强。用微球(含有信号产生物质)标记的检测抗体在测试装置的起始点松散地过量结合。
信号产生物质可为荧光染料、染色渗透液、生物发光或化学发光物质、磁性物质或酶。来自样品的抗原与检测抗体相互作用并携带微球迁移至装置另一端。在吸垫附近的指示剂区域(点或带)中用捕获抗体形成夹心。在此，捕获抗体更紧密地与吸附材料结合，因而不能迁移。分析物在样品中存在越多，夹心结构形成越多，并且在指示剂区域中结合微球越多。取决于信号前体分子的结构，信号产生物质可通过各种方法活化。例如，对于用作信号前体的FDA，应可能将整个装置浸入碱性活化溶液中或者将碱性活化剂滴加到指示剂区域上。一部分检测抗体(用微球标记)不与指示剂区域结合，并进行迁移。置于指示剂区域后面的对照区域显示固相反应是否正常工作。使用竞争测定原理，可改变基于夹心样固相/膜的技术用于低分子量物质。可对本发明进行各种改进而不偏离随后权利要求的范围。
权利要求
1.微球，微球包含 (i)蛋白信号前体分子，或 (ii)与信号前体分子键合的载体蛋白， 其中所述微球在蛋白分子之间具有分子间键，所述微球通过包括以下步骤的方法形成 将蛋白分子与基质形成剂在溶液中混合； 将还原剂加入混合物中； 除去所述还原剂； 加入基质除去剂，和 除去基质以留下蛋白分子的微球。
2.权利要求I的微球，其中所述蛋白信号前体分子为用于与靶标结合的亲和分子。
3.权利要求I的微球，所述微球还在表面上包含用于与靶标结合的亲和分子。
4.权利要求I的微球，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持结合在所述微球中。
5.权利要求I的微球，其中所述载体蛋白选自纤维状蛋白，包括但不限于细胞骨架蛋白或胞外基质蛋白；或球状蛋白、血蛋白、血红素蛋白、细胞粘附蛋白、或转运蛋白、生长因子、受体蛋白、DNA结合蛋白、免疫系统蛋白、单克隆抗体或多克隆抗体、营养贮藏/转运蛋白、伴侣蛋白或酶；或者遗传修饰蛋白；或者重组蛋白或化学修饰蛋白和合成蛋白。
6.权利要求5的微球，其中所述载体蛋白为血蛋白。
7.权利要求5或6的微球，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
8.前述权利要求中任一项的微球，其中所述信号前体分子为低分子量物质，选自突光团及其衍生物、发光团及其衍生物、发色团及其衍生物、酶底物、辅基或选自氧化还原介体、电极活性物质的氧化还原活性物质；或者为高分子量物质，选自酶及其前体、生物发光蛋白和荧光蛋白、核酸、核酶和适配体。
9.权利要求8的微球，其中所述信号前体分子为荧光团。
10.权利要求8的微球，其中所述荧光团选自荧光素、花青、碳花青、若丹明、咕吨、基于重氮染料的突光物质以及小的突光芳香和杂芳香分子。
11.权利要求10的微球,其中所述突光团选自突光素二乙酸酯(FDA)、突光素二乙酸异硫氰酸酯(FDA-异硫氰酸酯)或荧光素马来酰亚胺(FDA-马来酰亚胺)。
12.权利要求8的微球，其中所述信号前体分子为发色团。
13.权利要求12的微球，其中所述发色团选自花青、吡唑啉酮、蒽醌、碳花青、若丹明、咕吨、类胡萝卜素和基于重氮及单偶氮、噁嗪、靛类或核黄素的染料物质。
14.权利要求2或3或从属于权利要求2或3的权利要求4-13中任一项的微球，其中所述亲和分子为生物识别分子。
15.权利要求14的微球，其中所述亲和分子选自肽和蛋白、核酸链、碳水化合物、具有低分子量的配体和分子印记聚合物(MIP)或其混合物。
16.权利要求15的微球，其中肽或蛋白选自包括单克隆和多克隆抗体在内的抗体、受体、抗原、重组蛋白、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分。
17.权利要求15的微球，其中所述核酸选自DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、适配体及其部分。
18.权利要求15的微球，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖和多糖、糖酯、蛋白多糖及其部分。
19.权利要求15的微球，其中所述低分子量配体为生物素或生物素衍生物、类固醇或激素、辅因子或辅酶、活化剂、抑制剂、酶的假底物或辅基、药物、变应原或半抗原。
20.权利要求15的微球，当从属于权利要求3时，其中所述亲和分子与所述微球缀合或者直接或通过连接分子与所述微球结合。
21.权利要求15的微球，当从属于权利要求3时，其中所述亲和分子通过物理吸附与所述微球缀合。
22.权利要求21的微球，其中所述连接体选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交联剂。
23.前述权利要求中任一项的微球，所述微球具有在IOnm-Imm范围内的尺寸。
24.权利要求23的微球，所述微球具有在400nm-10y m范围内的尺寸。
25.权利要求I的微球，其中所述蛋白为载体蛋白，所述微球通过使信号前体分子与所述载体蛋白键合而形成。
26.权利要求25的微球，其中所述载体蛋白和所述信号前体分子通过共价缀合、物理吸附或经连接分子结合。
27.权利要求25或26的微球，其中所述载体蛋白为权利要求5-7任一项中定义的载体蛋白。
28.权利要求25-27中任一项的微球,其中所述信号前体分子如权利要求8-13的任一项中所定义。
29.权利要求25-28中任一项的微球，所述微球通过使亲和分子附着于所述微球表面的另外步骤产生。
30.权利要求29的微球，其中所述亲和分子通过物理吸附或直接化学缀合与所述微球缀合或结合。
31.权利要求29的微球，其中所述亲和分子与所述微球缀合或者通过连接分子与所述微球结合。
32.权利要求31的微球，其中所述连接分子选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交联剂。
33.权利要求29-32中任一项的微球，其中所述亲和分子如权利要求14-19的任一项中所定义。
34.权利要求1-33中任一项的微球，其中所述基质形成剂选自碳酸钙、藻酸钙、多孔二氧化硅和寡糖或多糖。
35.权利要求34的微球，其中所述基质形成剂为碳酸钙。
36.权利要求35的微球，其中所述碳酸钙通过将碳酸钠溶液加入蛋白和氯化钙在溶液中的混合物中形成。
37.权利要求1-36中任一项的微球，其中所述基质除去剂选自螯合剂、EDTA、酸或碱。
38.权利要求1-36中任一项的微球，其中所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。
39.一种产生蛋白微球的方法，所述方法包括 将蛋白分子与基质形成剂在溶液中混合； 将还原剂加入混合物中； 除去所述还原剂；和 除去基质以留下蛋白分子的微球。
40.权利要求39的方法，其中所述基质通过选自高温处理或pH变化的物理方法除去。
41.权利要求39的方法，其中所述除去基质的步骤包括加入基质除去剂。
42.权利要求41的方法，其中所述基质除去剂选自螯合剂、EDTA、酸或碱。
43.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。
44.权利要求39-43中任一项的方法，其中所述基质形成剂选自碳酸钙、藻酸钙、多孔二氧化硅和寡糖或多糖。
45.权利要求44的方法，其中所述基质形成剂为碳酸钙。
46.权利要求45的方法，其中所述碳酸钙通过将碳酸钠溶液加入蛋白和氯化钙在溶液中的混合物中形成。
47.权利要求39-46中任一项的方法，其中所述蛋白分子为用于与溶液中的靶标结合的未和分子。
48.权利要求39-46中任一项的方法，其中所述蛋白为载体蛋白，且所述方法还包括使 信号前体分子与所述载体蛋白键合。
49.权利要求48的方法，其中所述载体蛋白和所述信号前体分子通过共价缀合、物理吸附或经连接分子结合。
50.权利要求48或49的方法,其中所述载体蛋白为权利要求5-7的任一项中定义的载体蛋白。
51.权利要求48-50中任一项的方法,其中所述信号前体分子如权利要求8-13的任一项中所定义。
52.权利要求48-51中任一项的方法,所述方法还包括使亲和分子附着于所述微球表面的步骤。
53.权利要求52的方法，其中所述亲和分子通过物理吸附或直接化学缀合与所述微球缀合或结合。
54.权利要求52的方法，所述方法包括将所述亲和分子与所述微球缀合或通过连接分子与所述微球结合。
55.权利要求54的方法，其中所述连接分子选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、去糖基化抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子量交联剂。
56.权利要求47或52-55中任一项的方法，其中所述亲和分子如权利要求14-19的任一项中所定义。
57.一种用于使用微球检测样品中的一种或多种靶分子的方法，所述微球包含与信号前体分子键合的载体蛋白，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持与所述载体蛋白键合，并且所述微球在其表面具有用于特异性识别和结合所述靶分子的亲和分子，所述方法包括 (a)温育所述靶分子与所述微球；(b)分离在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球与没有亲和分子-靶分子复合物的微球； (c)用显示剂处理所分离的在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球以活化信号前体分子产生信号，和 (d)检测或定量信号。
58.权利要求57的方法，其中当从属于权利要求3时，所述微球如权利要求3或4-24的任一项中所定义。
59.权利要求57或58的方法，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，且信号前体分子为荧光素二乙酸酯(FDA)。
60.权利要求59的方法，其中所述显示剂为碱或酯酶。
61.一种使用第一种微球检测样品中的一种或多种靶分子的信号放大方法，所述第一种微球包含与信号前体分子结合的载体蛋白，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持与所述载体蛋白结合，并且所述微球在其表面具有用于特异性识别和结合所述靶分子的亲和分子，所述方法包括 (a)温育所述靶分子与所述微球； (b)分离在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球与没有亲和分子-靶分子复合物的微球； (C)处理所分离的在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球以分解微球并释放信号前体分子； (d)用第二种微球处理所释放的信号前体分子，所述第二种微球用对所述释放的信号前体分子具有亲和力的另外的亲和分子功能化，所述第二种微球包含与另外的信号前体分子结合的载体蛋白，其中所述另外的信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持与所述载体蛋白结合； (e)分离在其表面具有另外的亲和分子-信号前体分子复合物的微球与没有另外的亲和分子-信号前体分子复合物的微球； (f)用显示剂处理所分离的在其表面具有另外的亲和分子-信号前体分子复合物的微球以活化另外的第二种信号前体分子产生信号，和 (g)检测或定量信号。
62.权利要求61的方法，所述方法还包括在进行步骤⑴和(g)之前，重复步骤(c)-(e) 1-n次，其中n为正整数。
63.一种使用第一种微球检测样品中的一种或多种靶分子的信号放大方法，所述第一种微球包含与所述信号前体分子结合的载体蛋白，其中所述微球在其表面具有用于特异性识别和结合所述靶分子的亲和分子，所述方法包括 (a)温育所述靶分子与所述微球； (b)分离在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球与没有亲和分子-靶分子复合物的微球； (C)处理所分离的在其表面具有亲和分子-靶分子复合物的微球以分解所述微球并释放所述信号前体分子； (d)用另外的微球处理所释放的信号前体分子，所述另外的微球用对所述信号前体分子具有亲和力的另外的亲和分子功能化，所述微球包含与另外的信号前体分子结合的载体蛋白； (e)分离在其表面具有另外的亲和分子-信号前体分子复合物的微球与没有另外的亲和分子-信号分子复合物的微球； (f)用显示剂处理所释放的在其表面具有另外的亲和分子-信号前体分子复合物的微球以活化另外的信号前体分子产生信号，和 (g)检测或定量信号。
64.权利要求63的方法，所述方法还包括在进行步骤⑴和(g)之前，重复步骤(c)-(e) 1-n次，其中n为正整数，其中至少最后重复循环中的所述信号前体分子可活化以产生可检测信号。
65.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述微球的分解通过化学、物理或热方法进行。
66.权利要求65的方法，其中所述微球的分解通过使用断裂所述微球中分子间键的释放剂的化学方法进行。
67.权利要求66的方法，其中所述释放剂断裂所述微球中蛋白分子之间的分子间硫-硫键。
68.权利要求66或67的方法，其中所述释放剂为小分子还原剂。
69.权利要求68的方法，其中所述释放剂为二硫苏糖醇(DTT)。
70.权利要求65的方法，其中所述微球的分解通过声处理、加热、光辐射或通过变化pH来进行。
71.权利要求61-70中任一项的方法,其中至少所述第一种微球如权利要求3或从属于权利要求3的权利要求4-24的任一项中所定义。
72.权利要求61-70中任一项的方法,其中至少一个放大循环使用包封信号产生有机物质的固体颗粒并在外表面携带用于特异性识别和结合靶分子的亲和分子的胶囊。
73.权利要求62和64-71中任一项的方法，其中至少在最终微球中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，且所述信号前体分子为荧光素二乙酸酯(FDA)。
74.权利要求73的方法，其中所述显示剂为碱或酯酶。
75.一种用于检测样品中靶分子的试剂盒，所述试剂盒包含在权利要求I或从属于权利要求I的权利要求4-13中任一项的微球，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，所述微球适于在表面携带用于特异性识别和结合靶分子的亲和分子。
76.权利要求75的试剂盒，所述试剂盒还包含用于修饰亲和分子使其能够与微球表面结合的试剂和用于在微球与亲和分子之间进行结合反应的试剂。
77.权利要求75或76的试剂盒，所述试剂盒包含选自膜、微量滴定板、珠、管和玻片的固体基底。
78.权利要求75-77中任一项的试剂盒，其中所述信号前体分子包括荧光染料、染色渗透液、生物发光或化学发光物质、磁性物质或酶。
79.权利要求1-24中任一项的微球在用于以下领域中检测和/或测定样品中的一种或多种靶分子的分析方法中的用途研究；人和兽医诊断领域、法医诊断；环境分析、食品分析；和生物防御筛选靶物质。
80.权利要求1-24中任一项的微球在异相和固相膜测定中的用途。
81.权利要求1-24中任一项的微球在免疫组织化学中的用途。
82.权利要求1-24中任一项的微球在用于使特异性蛋白带、DNA和RNA序列的存在可视化的蛋白质印迹、RNA印迹和DNA印迹及斑点技术中的用途。
83.权利要求1-24中任一项的微球用于放大分析灵敏度的序贯用途。
84.权利要求I的微球，所述微球基本上如本文参照附3所述。
85.权利要求39的产生微球的方法，所述方法基本上如本文参照实施例I所述。
86.权利要求57的用于检测样品中一种或多种靶分子的方法，所述方法基本上如本文参照附4或图5所述。
87.权利要求61或63的用于检测样品中一种或多种祀分子的信号放大方法,所述方法基本上如本文参照图6所述。
全文摘要
本发明涉及包含蛋白信号前体分子或与信号前体分子键合的载体蛋白的微球，其中所述信号前体分子可活化以产生可检测信号，同时保持与载体蛋白结合。也公开了制造这样微球的方法，所述方法包括以下步骤将蛋白分子与基质形成剂在溶液中混合；将还原剂加入混合物中；除去还原剂；和除去基质形成剂以留下蛋白分子微球。也公开了使用微球提供信号放大生物测定方法，所述方法包括放大循环步骤。
文档编号G01N33/68GK102803962SQ201080026352
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者麦永昌, 王礽慧, P·Y·C·陈, R·任能博 申请人:超新星诊断公司