专利名称：α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体及其应用和所用多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体及其应用。
背景技术：
α 1-抗胰蛋白酶(α Ι-antitrypsin，α 1-ΑΤ)是由肝脏产生的一种糖蛋白，是人类血浆中最重要的蛋白酶抑制剂，能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶、 凝血酶、血浆素、胰蛋白酶等，它占血浆总蛋白酶抑制能力的90%以上。α 1-抗胰蛋白酶的主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤并抑制感染和炎症，从而维持机体内环境的平衡。而α 1-抗胰蛋白酶缺乏则会导致一些疾病的发生，如肝脏硬化。因为部分变异型α -抗胰蛋白酶在合成过程中分泌到血液中，而大部分则在其糖基化过程中停止下来并在内质网上沉积，从而导致肝细胞损伤，引发肝脏硬化。原发性肝癌是严重威胁我国人民生命健康的恶性肿瘤，总体疗效差、死亡率高。 据世界卫生组织统计，全球每年新发肝癌病例100万至150万例。因为我国是肝炎大国， 居民卫生意识和健康意识薄弱，所以我国肝癌发病人数占全球的55%，死亡人数占全球的 45%。由于缺乏较好的早期诊断方法，临床上发现多为晚期，因此新的肝癌早期诊断方法的开发成已成为我国迫切的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于人类的α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体及其制备方法中所用的多肽，以及该α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于制备α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的多肽，其具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了一种α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体，其利用上述多肽制备而得。作为本发明的α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的改进多克隆抗体为α 1_抗胰蛋白酶的多克隆抗体。本发明还同时提供了上述α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体在制备肝癌早期诊断剂中的应用。本发明以SEQ ID NO :1所示的多肽为抗原免疫动物，获得了多克隆抗体，该多克隆抗体为抗α 1-抗胰蛋白酶的抗体。本发明所述人α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体为兔的血清免疫球蛋白IgG，该抗体能特异性识别并结合α 1-抗胰蛋白酶，可以有效应用于检测α 1-抗胰蛋白酶的多种方法， 如ELISAiesternblot、免疫组织化学等检测，通过免疫组织化学实验证明，α 1_抗胰蛋白酶在肝癌中表达较癌旁组织中明显减低。本发明为了解α -抗胰蛋白酶的功能和它对慢性乙型肝炎发病的影响提供了重要的研究工具和基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是本发明实施例1的人α 1-抗胰蛋白酶的亲水性、抗原性和表面暴露性分析图；图2是本发明实施例3的α 1-抗胰蛋白酶的编码序列电泳图谱；图3是本发明实施例3的α 1-抗胰蛋白酶-pcDNA 3. IA的酶切鉴定图；图4是本发明实施例3的western blot对纯化的抗体进行鉴定图；图5是本发明实施例4的肝癌和正常肝组织的免疫组化图。
具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。实施例1、利用DNA star分析软件对α 1-抗胰蛋白酶蛋白进行分析(图1)并筛选α 1-抗胰蛋白酶蛋白中一段多肽来制备多克隆抗体，基本原则如下1)、具有较高的亲水性，抗原性而且表面暴露性强；2)、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；3)、特异性较强的肽段；4)、不形成 α-helix ；5)、抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间。筛选出用于制备α 1-抗胰蛋白酶蛋白多克隆抗体的多肽序列为 CENEDRRSASLHLPK(SEQ ID NO. 1)。多肽合成后，经SDS-PAGE电泳纯化，纯度彡90%，并与 KLH(钥孔嘁血蓝蛋白)偶联。说明如下上述序列中的C是用来多肽交联KLH和BSA的，其余序列同α 1-抗胰蛋白酶蛋白中的一段序列。实施例2、制备α 1-抗胰蛋白酶蛋白的多克隆抗体1)、免疫计划与方案如下将实施例1所得的多肽抗原对2只2. 5kg左右的成年雄性新西兰大白兔分别注射进行免疫A.第 1 天，首免500ug 多肽-KLH(500ul)+CFA(弗氏完全佐剂)500ul ；B.第 21 天，二免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA(弗氏不完全佐剂)500ul ；C.第 35 天，三免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第45天，采血样5ml;D.第 49 天，四免:250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第59天，采兔血25ml，用于多抗制备；E.第 63 天，五免250ug 多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul ；第73天，采兔血25ml， 用于多抗制备；第77天，处死兔子，放全血，用于多抗制备。2)、多肽特异性亲和纯化亲和纯化如常规操作，相关试剂和详细参数如下多肽柱贮存4°C;
层析填料Sulfo-Linkcoupling Gel ；多肽交联IOmg多肽交联填料，L-Cysteine封闭；柱预处理20ml，50mMPBS PH7. 4，流速 60ml/h ；血清上样10ml血清，50mM PBS PH7. 4 稀释至 20ml，流速 30ml/h ；清洗20ml50mMPBS PH7. 4 ；抗体洗脱0.2M Glyciene-HCl，PH3. 0 ；洗涤50mMPBS PH7. 4+0. 02%硫柳汞钠；最终获得纯化后的血清，用于ELISA检测。3)、ELISA检测法对抗体进行鉴定A.抗原包被以BSA-多肽作为抗原，以lug/mL的浓度包被，4°C包被过夜。上述BSA-多肽是指将实施例1中合成的多肽和牛血清白蛋白(BSA)交联，用于 ELISA检测。B.纯化的兔多抗以 1 200，1 1000，1 5000，1 10000，1 20000， 1 60000，1 240000的稀释度稀释，加样量为50ul/孔。37°C温育1小时。C.洗涤用 TBST (Tris-Buffered NaCl Solution with Tween 20)以 200ul/孔洗涤2次。D.加酶标二抗羊抗兔HRP以1 5000稀释使用，37°C温育45分钟。E.洗涤用TBST以200ul/孔洗涤2次。F.显色以IOOul/孔加入TMB显色液5分钟。G.读数(OD)酶标仪测定0D450nm读数。结果0D450值为1. 177(稀释比例1 60000)，血清效价合格。(本抗体要求为 血清稀释比例大于1 10000，OD值高于1.0则合格)表1、抗血清效价(0D值)检测数据
权利要求
1.一种用于制备α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的多肽，其特征是具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一种α 1-抗胰蛋白酶多克隆抗体，其特征是利用权利要求1所述的多肽制备而得。
3.根据权利要求2所述的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体，其特征是所述多克隆抗体为 α 1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体。
4.如权利要求2或3所述的α -抗胰蛋白酶多克隆抗体在制备肝癌早期诊断剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的多肽，其具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了利用上述多肽制备而得的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体，该多克隆抗体为α1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体。本发明还同时公开了上述α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体在制备肝癌早期诊断剂中的应用。α1-抗胰蛋白酶蛋白只有在癌旁组织和正常组织中才有表达，癌变区域不表达。
文档编号G01N33/574GK102153628SQ20111000726
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者刘东成, 李淑萍, 郑敏, 陈 峰, 陈智 申请人:浙江大学