专利名称：一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法
技术领域：
本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，尤其涉及己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇等9种兽药残留量的气相色谱/质谱法检测方法。
背景技术：
把激素类活性物质应用于养殖业已有近50年的历史。它在特定的饲养条件下，动物饲喂期间可引起动物蛋白质的沉积，从而提高饲料转化率，增加瘦肉率，促进畜禽和水生动物的生长，促进生长幅度10-40%，可以很快产生显著和直接的经济效益。但经过近30年的治疗性和非治疗性应用、实验室研究和流行病学调查，人们已经认识到滥用同化激素对 人及动物健康、社会和生态环境造成的直接及潜在危害。其中以目前使用最多的性激素和 促生长激素对人类健康危害最大。儿童食用含有促生长激素和己烯雌酚的食品可导致性早熟。另外，激素通过食物链进入人体会产生一系列的内分泌相关肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷和生育缺陷等方面的健康效应，给人体健康带来深远影响。而且多数激素类物质具有潜在的致癌性。因此就残留的危害而言，激素与抗生素并列为最重要的兽药残留。目前，激素类兽药残留量的检测方法主要有免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱法(GC/MS)等。近年来液相色谱-质谱/质谱法方法报道较多，GB/T 21981-2008《动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》、SN/T1752-2006《进出口动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检验方法液相色谱串联质谱法》、SN/T1980-2007《进出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法》、SN/T2677-2010《进出口动物源性食品中雄性激素类药物残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》等国家标准和行业标准公布了动物源食品中激素类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法，SN/T1955-2007《动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检测方法酶联免疫法》行业标准公布了动物源食品中激素类药物残留量的酶联免疫法检测方法。气相色谱-质谱法报道较少，而已知的气相色谱-质谱法方法大多操作烦琐，尚缺少成熟的针对动物源性食品中激素残留量的气相色谱-质谱法检测方法。本发明明旨在利用利用微波辅助柱前衍生、固相萃取和气相色谱/质谱联用技术，建立一种可同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的气相色谱-质谱法检测方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的气相色谱-质谱法检测方法，可同时检测动物源食品中己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇等9种兽药残留量。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，包括以下步骤I、样品提取称取5g动物组织(猪肉、猪肝、猪肾)样品于50ml塑料离心管中，加入25ml提取剂，匀质，以4000 r/min离心3min，上清液移入125ml分液漏斗中，在剩下的残留样中再加入15ml提取剂，超声提取5min，离心后上清液移入上述125ml分液漏斗中。2、提取液脱脂向分液漏斗提取液中加入25 mL脱脂溶剂，震荡I分钟，静置分层后，将下层层放入另一 125ml分液漏斗中，向下层再加入25 mL脱脂溶剂萃取一次，静置分层后将下层转移到100 ml鸡心瓶中，40°C水浴下用氮吹仪吹干，用0. 2mL甲醇溶解。3、C18小柱净化将以上提取液移入经过预淋洗的C18小柱，控制流量为3 ml/min,弃去流出液，用I ml水淋冼鸡心瓶2次，并将淋冼液移入C18小柱过柱，弃去流出液。依次用3 ml水，3 ml甲醇-水溶液淋洗C18小柱 ，待最后一次淋洗液完全流出C18小柱后，离心抽干小柱，至少抽干3分钟。最后用6 ml甲醇(两次个3 ml)将C18小柱中的激素冼脱。收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用3 mL正己烷-二氯甲烷溶液溶解，待过硅胶柱。4、硅胶柱净化将上述经C18小柱净化的样液过硅胶柱，用3mL淋洗液淋洗，最后用15mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用2mL乙酸乙酯-甲醇溶液溶解，待过氨基柱。5、氨基拄净化将上述经硅胶柱净化的样液过氨基拄，用6mL乙酸乙酯-甲醇溶液洗脱，收集上样液和洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，待衍生。6、衍生反应蒸干的残渣中，加入衍生剂，盖紧螺盖，迅速涡旋lmin，放入微波炉中，700 W输出功率下，衍生30s，从微波炉里取出后冷却至室温，用正己烷定容至0. 5 mL，过0. 22 Mm微孔滤膜，48h内进行GC/MS测定。7、气相色谱-质谱仪测定
(I)定性测定按照气相色谱/质谱条件分别测定样品溶液和标准溶液，如果样品的GC-MS数据符合下列限定，则可定性判定为某种激素残留
A、样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5%以内；
B、监测离子的信噪比应彡3；
C、扣除本底后该峰的质谱图存在所有选定的监测离子；
D、样品中待测物的全部监测离子的相对强度应与标准溶液中相应化合物的的离子相对强度比值一致，偏差在土 20%以内。(2)定量测定以各激素的监测离子中信号响应最高且无干扰的单离子对为定量离子，进行外标法定量分析。以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线。为减少基质对定量测定的影响，需用空白样提取液来配制标准工作溶液，并保证所测样品中各激素类物质的响应值均在线性范围内。作为优选，在步骤I中所述提取剂为乙腈。作为优选，在步骤2中所述脱脂溶剂为正己烷。作为优选，在步骤3中所述预淋洗的C18小柱为C18固相萃取柱，500mg/3mL，Waters Co,使用前依次用2 ml甲醇、2 ml 二氯甲烧、2 ml甲醇、2 ml水活化。作为优选，在步骤3中所述甲醇-水溶液为甲醇冰=4 6 (体积比)。作为优选，在步骤3中所述正己烷-二氯甲烷溶液为正己烷二氯甲烷=60 :40(体积比)。
作为优选,在步骤4中所述娃胶柱为娃胶固相萃取柱,500mg/6mL, Waters Co.使用前用6mL正己烷活化。作为优选，在步骤4中所述淋洗液为正己烷-乙酸乙酯混合溶液，正己烷乙酸乙酯=75:25 (体积比)。作为优选，在步骤4中所述洗脱液为正己烷-乙酸乙酯混合溶液，正己烷乙酸乙酯=25: 75 (体积比)。作为优选，在步骤4中所述乙酸乙酯-甲醇溶液为乙酸乙酯甲醇=80:20 (体积比)。
氨基拄
作为优选，在步骤5中所述氨基拄为氨基固相萃取柱，500mg/6ml，waters Co.使用前用5mL乙酸乙酯-水(即用水饱和的乙酸乙酯)、5mL乙酸乙酯-甲醇(80:20)活化。作为优选，在步骤5中所述乙酸乙酯-甲醇溶液为乙酸乙酯甲醇=80:20 (体积比)。作为优选，在步骤6中所述衍生剂为50 U L BSTFA:TMCS(99:1)+ 50 ML吡啶。作为优选，在步骤7中所述气相色谱/质谱分析条件为
色谱条件
色谱柱毛细管柱 DB-5MS, 0. 25mmX 30mX0. 25 iim。载气以高纯He为载气(99. 999%以上)，流量I. OmL/min;压力:11. 6psi。进样模式不分流 进样量2iiL ;
进样口温度280°C ；
接口温度2800C ；
升温程序120°C (Imin) 15。。/min 250°C (6min) 5°C /min 280°C (6min)
质谱参数
溶剂延迟10 min ；
EM 电压1600V ；
离子源温度(EI) 2300C ；
四极杆温度150°C ;
电子倍增器、离子聚焦和入口透镜值均通过自动调谐计算。作为优选，在步骤7中所述标准溶液的配置方法为配置单个标准储备液和混合标准储备液时均选用甲醇为溶剂，储存于棕色瓶中于-18° C冰箱中保存。进一步地，所述动物组织选自猪肉、猪肝、猪肾。进一步地，所述激素类兽药包括己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇至少一种。由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于
I、建立了动物组织(肌肉、肝脏、肾脏)中己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇等激素类兽药残留量的气相色谱/质谱检测方法，实现了对9种激素类兽药的同时检测。2、对动物组织、肝脏、肾脏等富含蛋白质的样品采用乙腈去除蛋白质，结合均质法提取、离心分离，提取效率高，提取液中杂质溶出少。3、应用C18柱、硅胶柱和氨基柱三个SPE柱净化方案，净化效果好，解决了激素类兽药检测内源性杂质干扰大、回收率低的难题。4、采用微波辅助技术加速激素类兽药的衍生化反应，在保证其灵敏度不变的前提下，使衍生化时间从传统水浴方法的45min缩短到30s，时间缩短了 98. 8%，极大地提高了样品前处理的效率。实验可以利用国产家用微波炉，设备简单，价格便宜，易于推广。5、与以往的方法比较，具有准确、高效等优点，九种激素类兽药己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇检测低限分别0. IU g/kg ; 0.3 u g/kg; 0. 15 u g/kg; I u g/kg; 0. 17 u g/kg; 0. 3 u g/kg; 0. 4 u g/kg; 0. 35 u g/kg; 0.3 U g/kg。9种激素类兽药在猪肉中的平均回收率为68. 8 87. 7%， 变异系数(CV%)为6. 3 21. 4 ;猪肝中的平均回收率为77. 7 93. 1%，变异系数(CV%)为6. 4 22. 3 ;猪肾中的平均回收率为73. 6 90. 9，变异系数(CV%)为4. I 22. O。方法的检测低限满足国内外相关法规的要求，精密度、回收率等技术指标符合相关标准的规定。6、本发明可应用于动物组织中激素类兽药残留的检验中，对促进我国动物源食品的进出口贸易，确保食品安全，保障人类身体健康都具有十分重要的意义。
图I九种激素混合标准溶液选择离子色谱图；图中保留时间12. 30min 己烧雌 (Hexestrol) ； 12. 42min :己烯雌酹(Diethylstilbesterol)与己二烯雌酌'(Dienestrol) ； 14. 99 min :还原尿睾酮(Etiocholan-3a-ol-17-one) ；16. 84 min :表睾酮(Epitestosterone) ； 16. 92 min :雌酮(Estrone) ； 17. 55 min :雌二醇(Estradiol) ；19. 53min :块雌醇(Ethinylestradiol) ；20. 92 min :雌三醇(Estriol)。图2猪肉添加九种激素混合标准溶液选择离子流图(添加水平为10倍定量限);其中1.己烷雌酚，2.己烯雌酚，3.己二烯雌酚，4.还原尿睾酮，5.表睾酮，6.雌酮，7.雌二醇,8.炔雌醇,9.雌三醇。图3猪肝添加九种激素混合标准溶液选择离子流图(添加水平为10倍定量限);其中1.己烷雌酚，2.己烯雌酚，3.己二烯雌酚，4.还原尿睾酮，5.表睾酮，6.雌酮，7.雌二醇,8.炔雌醇,9.雌三醇。图4猪肾添加九种激素混合标准溶液选择离子流图(添加水平为10倍定量限);其中1.己烷雌酚，2.己烯雌酚，3.己二烯雌酚，4.还原尿睾酮，5.表睾酮，6.雌酮，7.雌二醇,8.炔雌醇,9.雌三醇。图5己烷雌酚全扫描质谱 图6己烯雌酚全扫描质谱 图7己二烯雌酚全扫描质谱 图8还原尿睾酮全扫描质谱 图9表睾酮全扫描质谱 图10雌酮全扫描质谱 图11雌二醇全扫描质谱 图12炔雌醇全扫描质谱 图13雌三醇全扫描质谱图。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。实施例I同时检测猪肉中多种激素类兽药残留量的检测方法
I、样品提取称取5g猪肉样品于50ml塑料离心管中，加入25ml乙腈，匀质，以4000r/min离心3min,上清液移入125ml分液漏斗中,在剩下的残留样中再加入15ml乙腈,超声提取5min，离心后上清液移入上述125ml分液漏斗中。2、提取液脱脂向分液漏斗提取液中加入25 mL正己烷，震荡I分钟，静置分层后，将乙腈层放入另一 125ml分液漏斗中，再加入25 mL正己烷萃取一次，静置分层后将乙腈层转移到100 ml鸡心瓶中，40°C水浴下用氮吹仪吹干，用0. 2mL甲醇溶解。3、C18小柱净化将C18小柱(500mg/3ml)依次用2 ml甲醇、2 ml 二氯甲烷、2 ml 甲醇、2 ml水活化，弃去淋冼液，将以上提取液移入C18小柱，控制流量为3 ml/min,弃去流出液，用I ml水淋冼鸡心瓶2次，并将淋冼液移入C18小柱过柱，弃去流出液。依次用3 ml水，3 ml甲醇-水(4 :6，V/V)冼涤C18小柱，待最后一次冼涤液完全流出C18小柱后，离心抽干小柱，至少抽干3分钟。最后用6 ml甲醇(两次个3 ml)将C18小柱中的激素冼脱。收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用3 mL正己烷-二氯甲烷(60:40，V/V )溶液溶解，待过硅胶柱。4、硅胶柱净化将硅胶柱(500mg/6ml)用6mL正己烷活化，将上述经C18小柱净化的样液过柱，用3mL正己烷-乙酸乙酯(75:25，V/V)淋洗，最后用15mL正己烷-乙酸乙酯(25:75, V/V)洗脱，收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用2mL乙酸乙酯-甲醇(80:20，V/V)溶液溶解，待过氨基柱。5、氨基拄净化将氨基拄(500mg/6ml)用5mL乙酸乙酯-水(即用水饱和的乙酸乙酯)、5mL乙酸乙酯-甲醇(80:20，V/V)活化，将上述经硅胶柱净化的样液过柱，用6mL乙酸乙酯-甲醇(80:20，V/V)溶液洗脱，收集上样液和洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，待衍生。6、衍生反应蒸干的残渣中，加入50 ii L BSTFA:TMCS(99:1)+ 50 ML吡啶，盖紧螺盖，迅速涡旋lmin，放入微波炉中，700 W输出功率下，衍生30s，从微波炉里取出后冷却至室温，用正己烷定容至0.5 mL，48h内进行GC/MS测定。7.气相色谱-质谱仪测定 色谱条件
色谱柱毛细管柱 DB-5MS, 0. 25mmX 30mX0. 25 iim。载气以高纯He为载气(99. 999%以上)，流量I. OmL/min;压力:11. 6psi。进样模式不分流进样2 y L ;
进样口温度280°C ；
接口温度2800C ；
升温程序120°C (Imin) 15。。/min 250°C (6min) 5°C /min 280。。(6min)
质谱参数
溶剂延迟10 min ；
EM 电压1600V ；
离子源温度(EI) 2300C ；
权利要求
1.一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤 (1)样品提取称取5g动物组织(猪肉、猪肝、猪肾)样品于50ml塑料离心管中，加入25ml提取剂,勻质，以4000 r/min离心3min,上清液移入125ml分液漏斗中，在剩下的残留样中再加入15ml提取剂，超声提取5min，离心后上清液移入上述125ml分液漏斗中； (2)提取液脱脂向分液漏斗提取液中加入25mL脱脂溶剂，震荡I分钟，静置分层后，将下层层放入另一 125ml分液漏斗中，向下层再加入25 mL脱脂溶剂萃取一次，静置分层后将下层转移到100 ml鸡心瓶中，40°C水浴下用氮吹仪吹干，用0. 2mL甲醇溶解； (3)C18小柱净化将以上提取液移入经过预淋洗的C18小柱，控制流量为3ml/min,弃去流出液，用I ml水淋冼鸡心瓶2次，并将淋冼液移入C18小柱过柱，弃去流出液，依次用3 ml水，3 ml甲醇-水溶液淋洗C18小柱，待最后一次淋洗液完全流出C18小柱后，离心抽干小柱，至少抽干3分钟，最后用6 ml甲醇(两次个3 ml)将C18小柱中的激素冼脱，收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用3 mL正己烷-二氯甲烷溶液溶解，待过硅胶柱； (4)硅胶柱净化将上述经C18小柱净化的样液过硅胶柱，用3mL淋洗液淋洗，最后用15mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，用2mL乙酸乙酯-甲醇溶液溶解，待过氨基柱； (5)氨基拄净化将上述经硅胶柱净化的样液过氨基拄，用6mL乙酸乙酯-甲醇溶液洗脱，收集上样液和洗脱液于50 ml鸡心瓶，在40°C水浴下用氮吹仪吹干，待衍生； (6)衍生反应蒸干的残渣中，加入衍生剂，盖紧螺盖，迅速涡旋lmin，放入微波炉中，700 W输出功率下，衍生30s，从微波炉里取出后冷却至室温，用正己烷定容至0.5 mL，过0.22 Mm微孔滤膜，48h内进行GC/MS测定； (7)气相色谱-质谱仪测定 ①定性测定按照气相色谱/质谱条件分别测定样品溶液和标准溶液，如果样品的GC-MS数据符合下列限定，则可定性判定为某种激素残留 A、样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5%以内； B、监测离子的信噪比应彡3； C、扣除本底后该峰的质谱图存在所有选定的监测离子； D、样品中待测物的全部监测离子的相对强度应与标准溶液中相应化合物的的离子相对强度比值一致，偏差在±20%以内； ②定量测定以各激素的监测离子中信号响应最高且无干扰的单离子对为定量离子，进行外标法定量分析，以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线，为减少基质对定量测定的影响，需用空白样提取液来配制标准工作溶液，并保证所测样品中各激素类物质的响应值均在线性范围内。
2.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(I)中所述提取剂为乙腈。
3.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述脱脂溶剂为正己烷。
4.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述固相萃取柱为C18固相萃取柱,500mg/3mL, Waters Co,使用前依次用2 ml甲醇、2 ml 二氯甲烧、2 ml甲醇、2 ml水活化；所述甲醇-水溶液为甲醇水=46 (体积比)；所述正己烷-二氯甲烷溶液为正己烷二氯甲烷=60:40 (体积比)。
5.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(4)中所述娃胶柱为娃胶固相萃取柱,500mg/6mL, Waters Co.使用前用6mL正己烷活化；所述淋洗液为正己烷-乙酸乙酯混合溶液，正己烷乙酸乙酯=75:25 (体积比)；所述洗脱液为正己烷-乙酸乙酯混合溶液，正己烷乙酸乙酯=25: 75 (体积比)；所述乙酸乙酯-甲醇溶液为乙酸乙酯甲醇=80:20 (体积比)。
6.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(5)中所述氨基拄为氨基固相萃取柱，500mg/6ml，waters Co.使用前用5mL乙酸乙酯-水(即用水饱和的乙酸乙酯)、5mL乙酸乙酯-甲醇(80:20)活化；所述乙酸乙酯-甲醇溶液为乙酸乙酯甲醇=80:20 (体积比)。
7.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(6)中所述衍生剂为50 u L BSTFA:TMCS(99:1)+ 50 ML吡啶。
8.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(7)中所述在步骤7中所述气相色谱/质谱分析条件为 色谱条件 色谱柱毛细管柱 DB-5MS, 0. 25mmX30mX0. 25 u m ； 载气以高纯He为载气(99. 999%以上)，流量I. OmL/min;压力:11. 6psi ； 进样模式不分流 进样量2iiL ; 进样口温度280°C ； 接口温度2800C ； 升温程序120°C (Imin) 15。。/min 250°C (6min) 5°C /min 280°C (6min) 质谱参数 溶剂延迟10 min ； EM 电压1600V ； 离子源温度(EI) 2300C ； 四极杆温度150°C ; 电子倍增器、离子聚焦和入口透镜值均通过自动调谐计算。
9.根据权利要求I所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(7)中所述标准溶液的配置方法为配置单个标准储备液和混合标准储备液时均选用甲醇为溶剂，储存于棕色瓶中于-18° C冰箱中保存。
10.根据权利要求I至9中任一项所述的同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述动物组织选自猪肉、猪肝、猪肾；所述所述激素类兽药包括己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇至少一种。
全文摘要
本发明涉及分析化学、食品安全领域。一种同时检测动物组织中多种激素类兽药残留量的检测方法，样品经乙腈提取，再经C18柱、硅胶柱和氨基柱三个SPE柱净化，微波辅助衍生反应后，采用DB-5MS毛细管柱(0.25mm×30m×0.25μm)分离与检测九种激素类兽药残留量。本发明九种激素类兽药己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚、还原尿睾酮、表睾酮、雌酮、雌二醇、炔雌醇、雌三醇的检出限分别为0.1μg/kg;0.3μg/kg;0.15μg/kg;1μg/kg;0.17μg/kg;0.3μg/kg;0.4μg/kg;0.35μg/kg;0.3μg/kg。本发明方法的检测低限满足国内外相关法规的要求，精密度、回收率等技术指标符合相关标准的规定。
文档编号G01N30/08GK102749406SQ20111009674
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者林维宣, 董伟峰, 赵景红, 陈溪 申请人:林维宣