专利名称：一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂。
背景技术：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，每年大约有30%以上的患者死于乳腺癌复发和转移，乳腺癌转移是导致乳腺癌治疗失败的主要原因之一，乳腺癌一旦发生转移，即便手术治疗，也将严重影响患者的生存质量，且1/3的乳腺癌患者有复发和转移的危险，导致不良的预后以及高的病死率。乳腺癌的转移是与其本身生物学特性以及宿主环境和基因变化等相关的，是一个多基因参与、多步骤完成的复杂过程，涉及肿瘤细胞自身生长优势的获得，细胞间黏附能力的降低，癌细胞对细胞外间质和基底膜的降解与破坏，细胞骨架重构引起细胞运动与迁移， 细胞因子诱导的癌细胞器官特异性定向归巢，以及肿瘤血管和淋巴管生成，癌细胞逃逸凋亡和免疫杀伤等诸多因素，因此，在分子生物学水平，寻找和分析乳腺癌转移的机制非常重要，了解乳腺癌转移的自然规律，有助于选择治疗乳腺癌的最好方案。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人UHRFl基因。上述技术方案中，所述乳腺癌状态包括乳腺癌细胞的转移性能与迁移性能。上述技术方案中，当乳腺癌细胞的转移性能或迁移性能增强时，即当乳腺癌细胞的转移能力或迁移能力提高时，所述生物标记物试剂人UHRFl基因的表达量也增加。因此，本发明同时要求保护人UHRFl基因作为表征乳腺癌细胞的转移性能或迁移性能的生物标记物试剂的应用。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.本发明所述生物标记物试剂UHRFl基因与乳腺癌的远处转移能力密切相关，利用 UHRFl基因作为预测乳腺癌远处转移能力的生物标志物，与目前常规的病理分型判断乳腺癌的转移和预后相比，可以更加个体化、准确的预测乳腺癌的恶性程度。
图1.实施例中UHRFl转染后MDA-MB-231细胞UHRFl mRNA (A)和蛋白(B)表达情况；
图2.实施例中UHRFl基因促进MDA-MB-231细胞迁移情况图； 图3.实施例中UHRFl基因促进MDA-MB-231细胞浸润情况图； 图4.实施例中UHRFl与PTEN和maspin的相互作用情况图； 图5.实施例中细胞接种后的脏器转移图片。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一
1. 1 材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MDA-MB-453购于美国细胞收藏中心 (ATCC)，并由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30%Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMS0)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗UHRFl、cyclin BUcyclin Dl等抗体购自美国Santa Cruzs生物技术公司。RNase A 禾Π 10 μ g/mL proteinase K 购自美国 Sigma Aldrich 公司。1.2 细胞培养MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞培养于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5%C02，37°C培养箱内培养，每 2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.3细胞的转染和克隆筛选
转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度接种6孔板，置于(X)2培养箱中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70% 90%。在铺板和转染期间避免使用抗生素。转染溶液配制质粒Lipofectamine2000用量比为1μ g/孔2. 5μ 1/孔。2 μ g/ 孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室温静置5min，备用；5 μ 1/孔Lipofectamine2000加入 100 μ 1/孔基础DMEM混勻，室温静置5min，备用；
按照现有技术构建真核表达质粒PCDNA3-UHRF1，应用脂质体转染的方法，将真核表达质粒pcDNA3-UHRFl分别转染到人类乳腺癌MDA-MB-231细胞，同时转染“空”的pcDNA3质粒作为阳性对照，RT-PCR电泳图见图1A。从图中可以看出，UHRFl基因转染可明显增加 MDA-MB-231/UHRF1细胞中UHRFl mRNA的表达水平，而相应的母细胞和空质粒细胞中未见表达。Western blot电泳图(图1B)的结果显示MDA-MB-231/UHRFl细胞中的UHRFl蛋白表达水平明显高于相应的母细胞和转染“空”质粒的细胞，同时，母细胞和转染“空”质粒的细胞UHRFl蛋白表达水平未见明显差异，上述结果表明，UHRFl基因已经成功转染乳腺癌 MDA-MB-231 细胞。上述脂质体转染的方法具体为将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，在室温保温30min后，加入800 μ 1/孔基础DMEM，备用。用PBS及无抗生素的基础DMEM洗涤细胞， 每孔加入Iml转染混合液，5% CO2, 37° C培养5 h。证后，弃去含转染试剂的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72小时内完成实验即为瞬时转染；如果细胞继续培养4 后，更换含G418的培养基，大约两周后，筛选阳性稳定克隆，即为稳定转染。1. 4细胞感染和克隆筛选293细胞在10%新生牛血清的完全D-MEM中培养。待细胞长至培养到大约70% 80%时，培养基更换为含体积分数为2. 5%新生牛血清的DMEM， 加入重组腺病毒粗提液，继续培养观察48 72小时，收集呈病态反应的293细胞，反复冻融5次，每次冻融后振摇30秒，1 500 rpm离心20分钟，弃细胞碎片，收集上清，经氯化铯密度梯度两次离心浓缩腺病毒颗粒，经Hanks液透析后，加入体积分数为20%甘油，分装后于-70°C冻存备用。
病毒滴度采用噬斑分析法结合细胞病变测定法来完成。接种293细胞。取待测病毒液作10倍比稀释，取每一稀释度的病毒液按0. 3ml/平皿(孔)量感染细胞，细胞上铺0. 6% 的琼脂糖凝胶。正常换液直至蚀斑出现。病毒滴度=蚀斑个数X稀释度/0.3%X100%。 Ad5-LacZ 以 MOI 为 5，50，100，200 分别感染 MDA-MB-231 和 MDA-MB-453 细胞，4 小时后用培养液洗涤去除游离病毒，于37°C、0. 05 CO2培养M小时，体积分数为2. 5%戊二醛固定15分钟，再以含10 mmoi r1 MgCl2的生理盐水洗2遍，X_gal染色48小时后计数蓝染细胞。计算蓝色细胞百分率。按将近百分之百(或以上的)肿瘤细胞被感染的强度感染乳腺癌细胞。1.5体外划痕实验采用体外划痕方法测定细胞迁移能力，该方法具体为取对数生长期细胞，按1 X 106/ml接种于6孔培养板，培养至细胞完全饱和，经无血清DMEM同步化24h后，用无菌的Tip头在各培养板细胞生长单层的相同位置，划垂直或平行直线，人为造成几条“伤口”，PBS洗3次，细致地去除被移液管尖破坏而脱落的细胞，拍照(此时作为划痕后0时刻)，每板接种三种细胞，每种细胞设2个复孔，然后用含10%小牛血清的DMEM培养液刺激划痕后的细胞，划痕后24h或48h，PBS冲洗细胞3次，在显微镜下观察划痕宽度， 拍照记录。应用上述体外细胞划痕实验方法检测UHRFl基因对乳腺癌细胞体外迁移能力的影响，UHRFl转染MDA-MB-231细胞后的划痕实验结果参见图2，可见在划痕后48小时， MDA-MB-231/UHRF1细胞已经浸润扩散覆盖了划痕间隙，而MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo 细胞仍可看到明显的划痕间隙，以上实验结果说明UHRFl基因的高表达可以促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移，同时，“空”质粒pcDNA 3转染并不影响乳腺癌细胞的迁移能力；也就是说，乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力提高时，UHRFl基因的表达量也增高。1. 6 Boyden小室实验采用带有一个聚碳酸酯膜05 X 80毫米，8微米孔径)的 48孔Boyden小室测定细胞浸润能力。Boyden小室下室为含20%胎牛血清的培养液，中间隔以预铺了人工基底膜胶的硝化纤维膜，将细胞常规消化、计数、用不含血清的DMEM培养基稀释细胞后，调整细胞浓度为5 X 106/ml，将2 X IO5个细胞加入Boyden小室的上室，细胞置于37°C、5%0)2饱和湿度培养8小时后，小心除去未穿过膜的在膜上层的细胞，将穿过膜的附着在膜下层的细胞用甲醇固定，PBS冲洗，Gimsa染色。染色深的为穿过膜并附着在膜下层的细胞。在显微镜下观察并拍照。应用上述体外Boyden小室方法，观察UHRFl基因对乳腺癌细胞MDA_MB_231转移能力的影响。结果如图3A所示，使用Sum人工基底膜，8小时之后，计数穿过膜并附着在膜下层的细胞数量，在MDA-MB-231/UHRF1细胞组比MDA-MB-231/Neo组高出7 9倍(p<0. 01)， 这表明，UHRFl的高表达，可以增强乳腺癌细胞MDA-MB-231的浸润能力；也就说是，乳腺癌细胞MDA-MB-231的浸润能力时，UHRFl的表达量增加。我们按照步骤1.4采用腺病毒表达系统Ad5-UHRF1感染两种乳腺癌细胞 MDA-MB-231和MDA-MB-453，感染后他(A)或24h (B)，采用Boyden小室法完成细胞转移能力的测定，并在IOOX目镜下计数穿透纤维膜并附着在膜下层的细胞数量，正像总结在图:3B 中的数据，Ad5-UHRF1感染的细胞，其转移能力明显提高(p<0. 05)，在感染后的他或Mh， 观察到的结果都是如此，并且，感染时间越长，穿过膜的细胞数越多；而对照Ad5感染并未影响细胞的转移能力，这也进一步证实了提高细胞的 /^表达水平，确实可以增加细胞的转移。
具体地，采用Ad5-UHRF1分别感染乳腺癌细胞MDA_MB_231和MDA-MB-435后，在 Boyden小室接种相同数量的细胞，8小时后，穿过小室的细胞数分别为72和69个，而Ad5感染组细胞穿过膜的数量分别为12个和17个。作用M小时后，Ad5-UHRF1感染的MDA-MB-231 细胞和MDA-MB-435细胞，穿过膜的数量增加到362个和388个，而Ad5感染组细胞穿过膜的数量虽然也增加到了 69和78个，但仍然少于Ad5-UHRF1感染组细胞。1. 7 Western-blot法收集细胞并转至于1. 5 ml的Eppendorf管中离心(2500 转/分)5分钟，弃上清，并加入100 μ 1 IP裂解液，置于冰上2小时。4°C离心5分钟0，500 转/分钟)，转移上清液至新的Eppendorf管，并采用分光光度计检测样品蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液(5X)混勻，置于恒温混勻器上，100°C 5分钟，蛋白电泳后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5%脱脂奶粉，1 X T-BST缓冲液)封闭1 h。洗涤，并分别加入一抗α-Actin，UHRFl，Cyclin BLCyclin Dl,经封闭液处理的醋酸纤维膜室温抚育1小时。 T-BST缓冲液洗膜3次，加入二抗(1:1000稀释)抚育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、定影，胶片洗涤和干燥后，扫描分析。采用上述Wfestern Blot法测定Ad5_UHRFl (50或100 Μ. 0. I两浓度)感染后， 对细胞转移密切相关的PTEN和maspin蛋白的表达水平影响。结果如图4A所示，50或100 Μ. 0. I浓度的Ad5-UHRF1感染MDA-MB-231细胞后，均可明显提高 /^的表达水平，但并不影响细胞中内源性PTEN和maspin的蛋白表达。我们采用pcDNA3-PTEN或pcDNA3_maspin转染细胞，提高细胞中/7TEV和aaspi/ 的表达水平，更进一步了解/T^V和fflaspi/ M UHRFl调节细胞转移能力的影响。Ad5-UHRF1 (50 或 100 Μ. 0. I 两浓度)感染细胞后 48h 收样，采用 Western Blot 法检测蛋白表达水平(每道加样200 μ g)。采用脂质体介导的方法，细胞转染pcDNA-PTEN或pCDNA3-mapSin表达质粒后Mh， 完成Ad5或Ad5-UHRF1感染，细胞感染后Mh，利用Boyden小室法测定细胞的转移能力，并在100X目镜下计数穿透纤维膜并附着在膜下层的细胞数量。正如图4B 所示，细胞转染 pcDNA3-PTEN 或 pcDNA3_maspin 后，PTENimaspin 的蛋白表达水平明显增加；与单纯的 /7/基因转染相比，pcDNA3-PTEN或pcDNA3-maspin转染本身可以降低细胞的转移能力；如果将UHRFl和pcDNA3-PTEN或pcDNA3-maspin联合转染，细胞的转移能力也较单纯UHRFl转染有所降低(p<0. 05)，即PTEN或maspin的高水平表达可以降低UHRFl对细胞转移的调节能力。1. 8乳腺癌转移模型建立取对数生长期MDA-MB-231/Neo细胞、MDA-MB-231/ UHRFl细胞，经0. 25%胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用基础培养液离心洗涤2次，计数细胞数，调整细胞浓度为IX IO6个/mL，将细胞重悬于无菌PBS溶液。取裸鼠12只，每种细胞种6只在严格无菌条件下，在裸鼠腋下接种细胞悬液0.18 ml。裸鼠肿瘤接种后，连续置恒温05° C 士 2° C)、恒湿05% 50%)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便。在肿瘤接种后大约25 观天，在麻醉条件下采用拉颈拖白法处死裸鼠，并仔细地检查移植瘤的大体形态，生长，肿瘤附近区域转移和远处转移情况。原位肿瘤周围淋巴结， 肝脏，肾上腺和两个肺将被切除和用甲醛加以固定。肺将被检查并记录肺表面肿瘤结形成情况。淋巴结，肝脏，肾上腺和肺(如果肺表面肿瘤结不可看见的话)将被埋置在石蜡里， 切开成4um截面，并且H&E染色以微观观察肿瘤转移。所有免疫组化染色抗体现在都从商业来源购买到。观天实验结束后，解剖动物，取出肿瘤组织，观察肿瘤大小和脏器转移情况， MDA-MB-231/Neo细胞组仅发现2只有转移，MDA-MB-231/UHRF1组6只均有转移。肉眼观典型的转移为两肺、肝脏分布多个大小不等的粟粒状结节。结果见表1和图5。表1 MDA-MB-231细胞转移模型结果
TTiViViViViViVi'mNNNNNNNNNWiViViViViViViVmwm^综上所述，本发明为临床预测乳腺癌的浸润和迁移能力提供了一种新的生物标记物，有助于临床肿瘤病人全身治疗前，对肿瘤的远处浸润和迁移能力进行评估，从而制定更具个性化的治疗方案，以提高患者的治疗疗效及生存质量。注本实施例中统计学处理均按照以下方法处理所有实验均重复3-5次，取平均值，结果用f 士 S表示。所有数据分析采用SAS 8.0统计软件，应用方差分析，卡方检验，/7 < 0.05认为差异有统计学意义。
权利要求
1.一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人UHRFl基因。
2.人UHRFl基因作为表征乳腺癌细胞的转移性能或迁移性能的生物标记物试剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人UHRF1基因。本发明所述生物标记物试剂UHRF1基因与乳腺癌的远处转移能力密切相关，利用UHRF1基因作为预测乳腺癌远处转移能力的生物标志物，与目前常规的病理分型判断乳腺癌的转移和预后相比，可以更加个体化、准确的预测乳腺癌的恶性程度。
文档编号G01N33/574GK102305747SQ201110140279
公开日2012年1月4日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者李新莉, 樊赛军 申请人:苏州大学