专利名称：一种酶解-hplc法检测依诺肝素的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过HPLC法检测完全酶解的依诺肝素的二、四糖单元指纹图谱， 并由此判断产品是否合格的方法。
背景技术：
依诺肝素(enoxaparin)是低分子肝素的一种，由肝素苯丙化碱降解而来。是一种由许多链长不一的肝素小分子组成的混合物，结构非常复杂。临床上用于预防深静脉血栓形成及肺栓塞；治疗已形成的静脉血栓；预防血液透析时体外循环中血栓的形成；治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗。依诺肝素由法国赛诺菲安万特公司(Sanofi Aventis)原创，其在美国市售品商品名为“Lovenox”，在中国大陆市售品商品名为“克赛”。近几年国内外涌现出一批该药的仿制药，比如杭州九源基因工程公司的商标名为“亿喏佳”的针剂药品、深圳天道医药公司商品名为“普洛宁”的针剂产品等。美国药典、欧洲药典、中国药典等对于依诺肝素的质量控制有许多项，包括效价、 1,6-酐环含量、分子量分布、重金属含量、试剂残留含量等理化检测项目，这些检测项目基本反映了依诺肝素的特性，可判断产品是否合格。然而，基于对病人健康负责的态度，为避免2008年肝素事件类似悲剧的发生，提高依诺肝素检测水平是有必要的。鉴于依诺肝素结构的高度复杂性，而目前的常规尚难以涉及其分子细节结构，本发明提出一种通过将依诺肝素分子用肝素酶特异性降解然后用HPLC分析其主要组成双糖含量，并由此判断药物是否合格的方法。本方法严谨、科学，具有极高的实际使用价值和长远深刻的社会意义。
发明内容
本发明公开了一种通过HPLC法检测完全酶解的依诺肝素API和注射剂的二、四糖单元指纹图谱，并由此判断产品是否合格。为此，本发明提供一种用HPLC法检测依诺肝素酶解后的二糖和四糖含量的方法，所述方法包括下述步骤a、依诺肝素的完全酶解向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I 酶
II酶III = 8 1 2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；b、HPLC法分析取降解产物做SAX-HPLC分析；C、二、四糖单元种类和含量的计算根据双糖和四糖的洗脱时间，确定依诺肝素二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量；d、质量是否合格的判断计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合正常范围，并由此判断试品依诺肝素质量是否合格。其中，步骤a中所述对应于Img降解底物的混合酶溶液用量为酶I 酶II 酶
III= OJmIU 0. 75mIU 1. 5mIU。酶I，酶II，酶III分别代表肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，为现有技术产品，可以从市场上购买得到。
步骤a中所述的酶解，是将依诺肝素溶液，缓冲液B，肝素酶I溶液、肝素酶II溶液、肝素酶III溶液混合，放置48小时进行酶解，所述的依诺肝素为依诺肝素或依诺肝素钠
Τττ . ο步骤b中所述的HPLC法，其色谱条件如下
权利要求
1.一种用HPLC法检测依诺肝素酶解后的二糖和四糖含量的方法，所述方法包括下述步骤a、依诺肝素的完全酶解向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I酶 II 酶III = 8 1 2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；b、HPLC法分析取降解产物做SAX-HPLC分析；c、二、四糖单元种类和含量的计算根据现有的标准双糖和四糖的洗脱时间，确定供试品二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量；d、质量是否合格的判断计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合正常范围，并由此判断试品依诺肝素质量是否合格。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述对应于Img降解底物的混合酶溶液用量为酶 I 酶 II 酶 111 = 0. 3mIU 0. 75mIU 1. 5mIU。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述酶I，酶II，酶III分别代表 肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述的酶解，是将依诺肝素溶液， 缓冲液B，肝素酶I溶液、肝素酶II溶液、肝素酶III溶液混合，放置48小时进行酶解。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中所述的HPLC法，其色谱条件如下
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中所述8种双糖为IV-S、II-A,III-A,II-S、III-S、I-A、I_S、IV-A ；1 个四糖为3-o-sulf。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中所述8种双糖含量范围分别是IV-S(1.67% 士0. 09% )、ΙΙ-Α(2· 77% 士0. 15% )、ΙΙΙ_Α(1· 06% 士0. 10% ) ,II-S(9. 92% 士0. 30% )、III-S(5. 44% 士0. 14% )、I-A(1. 56% 士0. 07% )、I-S(60. 66% 士0. 67% )、 IV-A(1. 67% 士0. 22% )，四糖 3-o-sulf 含量范围是(5. 04% 士0. 32% )。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于双糖和四糖的洗脱顺序如下表
全文摘要
本发明公开了一种酶解-HPLC法检测依诺肝素的方法，所述方法包括下述步骤a、依诺肝素的完全酶解向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；b、HPLC法分析取降解产物做SAX-HPLC分析；c、二、四糖单元种类和含量的计算根据现有的标准双糖和四糖的洗脱时间，确定供试品二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量。
文档编号G01N30/02GK102323355SQ20111024161
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者李建科 申请人:深圳市天道医药有限公司