专利名称：一种全程定量检测c-反应蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒。
背景技术：
C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是由肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，由5个完全相同的非糖基化的亚单位非共价联结，每个亚单位相对分子质量23017，由 206个氨基酸残基组成。它具有多种生物活性，被认为最敏感的炎症指标之一。CRP不仅对感染性疾病、妊娠期糖尿病的病程检测及预后判断评估、抗生素疗效等具有重要的临床应用前景，同时亦是心血管疾病最有力的预测因子之一。CRP在健康的人体中只含有微量，在新的刺激出现前，其浓度可保持长期稳定，半衰期长(约18 20小时)，且不受性别、食物或昼夜的影响。当出现感染性疾病，血清中CRP在感染发生后5 8小时即开始升高，48小时达到峰值，且高峰值可达正常的数百倍。随着感染控制它可在M 48小时迅速下降，1周内恢复正常。CRP的水平和持续时间与感染程度呈正相关，当CRP持续升高或再度升高时，提示临床应重视病情的变化。近年来，许多前瞻性的流行病学研究发现，CRP在健康者未来发生心血管疾病风险评估上，是个独立且强而有力的预测指标。目前，已有约20多篇的相关文献指出，在患有心血管疾病的风险方面(如冠状动脉疾病、心肌梗塞、脑中风、周边血管疾病及突发性心猝死等)，CRP值最高的族群相对于较低的族群，其相对危险性高出2 4倍。在心血管疾病的诊断中，低水平的CRP (0. 1 10mg/L)被认为与其密切相关，是心血管炎症病变的生物标志物。这个水平的C-反应蛋白又被称为超敏C-反应蛋白(hs-CRP)，通常认为hs-CRP < lmg/ L时为低危险性；1 :3mg/L间为中度危险性；> 3mg/L时为高危险性。此夕卜，CRP亦可作为侦测糖尿病的风险。当其浓度大于:3mg/L时，得糖尿病的几率是CRP小于lmg/L族群的 4 6倍。临床上常规测定CRP的方法主要包括放射免疫法、免疫比浊法、酶联免疫吸附法及胶体金免疫层析等。这些方法具有各自的特点和不足放射免疫法结果较准确，线性范围较宽，但是操作繁琐，耗时，此外放射性标记物会对操作者产生危害，对环境造成污染，已逐渐被其它方法所代替。免疫比浊法已被广泛应用，但是其检测灵敏度较低，且通常需要自动生化分析仪等大型仪器配合，操作耗时长，所需样本量大。酶联免疫吸附法具有方法间结果差异大，线性范围窄的缺点，并且不适合单人份或者小批量的检测，对基层医院、诊所中的推广应用具有较大限制。胶体金免疫层析具有快速、便捷、价廉及适合单人份操作等优点， 但是只能定性或半定量检测，当样品中含有目标分析物的浓度较低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度低。中国专利号ZL 200720140930. 2公开了一种C-反应蛋白颜色颗粒诊断试纸，通过颜色颗粒检测临床样本(全血/血清/血浆)中的C-反应蛋白，但该专利仅能进行定性检测，而不能定量分析，灵敏度低，当遇到异常样本，还需使用其它方法进行复核，不仅费时而且会增加患者的就医负担，很难获得广泛的市场推广。中国专利申请号201010236071. 3披露了一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸，依据胶体金的光学性能对样品中的C-反应蛋白进行定量检测，该试纸的检测范围为5 200mg/L。然而，对于心血管疾病而言，当C-反应蛋白含量低于3mg/L时即具有危险性，此试纸的灵敏度却并不能满足条件。中国专利申请号201010550610. 0公开了一种全程定量检测C反应蛋白的免疫层析试纸条及其制备方法，该专利采用荧光胶乳微粒标记CRP，并进行免疫层析，实现对CRP 的全程定量检测。该专利所用荧光胶乳微粒是将荧光素与0. 01 1 μ m的胶乳微球共价结合而得。所用荧光素属于有机荧光染料。量子点(quantum dots,QDs)也称半导体纳米晶体，可以理解为粒径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒，存在着特殊的物理性质。与有机荧光染料相比，它具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等众多优点。 在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力，已成为新一代生物荧光标记物。因此，基于量子点的诸多优势，需要研制一种利用量子点来全程定量检测C-反应蛋白的方法，弥补现有技术中检测C-反应蛋白灵敏度低、检测范围窄、操作繁琐及定量不准确等不足，进而实现既可用于感染性疾病的检测或疗效观察，又可监测评估心脑血管疾病。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对现有技术中检测C-反应蛋白灵敏度低、检测范围窄的缺点，提供了一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应C-反应蛋白的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现C-反应蛋白的定量检测。本发明提供的一种全程定量检测CRP的荧光免疫层析的方法，是一种以量子点为荧光信号，采用双色标记技术，在免疫层析试纸条上实现CRP快速灵敏检测的方法。本发明全程定量检测CRP的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术
5中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样品的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10 1000倍。本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将CRP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中所述特异性抗体为抗CRP的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明中的化学交联为当量子点表面存在活性基团时，可与特异性抗体直接反应，不需用化学交联剂；反之，则需采用化学交联剂将抗体与量子点相偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及戊
二醛等。作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行蛋白修饰。其一般步骤为将纯化后的量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质， 以缓冲液作为反应介质，培育4小时，加入甘氨酸封闭，并以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白修饰的量子点荧光纳米颗粒。生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选， 在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对标记物进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为将生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，将蛋白质分子偶联到链霉亲和素修饰量子点的表面。为了提高信号与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550 1300nm的量子点。因在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度CRP检测时产生一定的影响，故优选发射波长大于550nm的量子点。此外，层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750 1300nm)荧光强度极弱，结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750 1300nm)进一步提高灵敏度。本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。其中，质控分子修饰的量子点与CRP抗体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。但在本发明中，为了减弱质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和抗体。作为优选，在本发明的一个实施例中，标记垫中CRP抗体修饰的量子点发射波长为650nm，质控分子修饰的量子点发射波长为570nm。作为优选，在本发明的另一个实施例中，标记垫中CRP抗体修饰的量子点发射波长为900nm，质控分子修饰的量子点发射波长为600nm。作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化；使用水相方法合成900nm的hAs。为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光的层析膜、低荧光的底板以及低荧光的扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。作为优选，在本发明的实施例中，底板为黑色，表面附有不干胶，且扣卡、层析膜、 底板及不干胶均不含有荧光剂。本发明实施例中荧光免疫层析试纸条由样品垫、标记垫、过滤膜、层析膜、吸水垫和底板组成，如图1所示。在标记垫上固定有CRP特异性抗体修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中定量带固定有对应 CRP的与上述标记垫中特异性抗体不同抗原表位的特异性抗体，质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子。本发明定量带是判定样品中CRP含量的主要指标，并且受质控带荧光信号强度校正，以提高定量准确度。此外，通过增加定量带的条数，可扩大试纸条的检测范围，避免出现 HOOK效应。在本发明的一个实施例中，发明人所选用的样品为血清，且样品进一步包含全血和血浆。当样品为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在样品垫与层析膜之间设置的过滤膜，用于凝固、过滤细胞，该过滤膜可分别与标记垫和层析膜直接毛细作用接触，如图1所示，也可与样品垫和标记垫直接毛细作用接触，如图3所示。其中，过滤膜还可以与样品垫合并为同一结构，同时拥有样品收集、释放及过滤的作用。本发明实施例采用预润免疫层析方法对待测样品中的CRP进行定量检测。其中预润免疫层析为滴加一定体积的缓冲液到层析膜上，润湿一定时间后，将样品加入样品垫中，然后样品沿层析膜向吸水垫方向层析运动。预润的目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均勻通过层析膜，减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样品的层析速度，从而提高特异性结合效率。其中滴加缓冲液体积一般为20 80μ 1，润湿时间为30秒 2分钟，而样品层析时间通常为8 25分钟。本发明的预润免疫层析包括将缓冲液直接或间接滴加于层析膜。当将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。缓冲液通过润湿垫到达层析膜。本发明的缓冲液为ρΗ 7. 2 11的碱性缓冲液，且该碱性缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性剂。其中，表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮等。作为优选，在本发明的实施例中使用包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9. 0的磷酸缓冲液。本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发光源模块包含光源及聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，且波长位于300 400nm之间或500 600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包括图像传感器或者光电倍增管。层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号经滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，获得数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光信号强度具有一定的相关性，主要影响因素包括温度、湿度、基质等。本发明检测结果的判定方法如果质控带荧光信号强度超出荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，定量带与质控带荧光信号强度的比值越高，表示样品中目标检测物的浓度越高，反之越低。本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F = f (c)，校正荧光信号强度为F= α Fi^i/FIi^，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样品，依据标准曲线可获得样品中CRP的浓度。本发明提供了一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析试剂盒，包括扣卡
(13)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液，如图4所示。该试剂盒采用直接预润免疫层析方法。 扣卡(1 为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(11)、视窗(12)，且具低荧光特性或不含荧光剂。本发明实施例中的直接预润免疫层析试纸条，其结构包括样品垫(1)、标记垫 O)、层析膜G)、吸水垫( 和底板(6)。层析膜(4)包含质控带(8)和定量带(7)。当进行全血样品检测时，试纸条还包括过滤膜(3)，具体结构如图1所示，其中样品垫(1)、标记垫O)、过滤膜(3)、层析膜(4)和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫⑴位于上样孔 (11)的下方，且连接于标记垫0)，标记垫( 连接于过滤膜(3)，过滤膜C3)连接于层析膜 G)，层析膜(4)上固定有两条质控带(8)和两条定量带(7)，且质控带(8)位于定量带(7) 的两侧，层析膜(4)位于视窗(12)的下方，层析膜(4)连接于吸水垫(5)。在对试纸条预润时，可将缓冲液直接滴加于窗口(1 内的层析膜上，其中滴加位置为质控带(8)的两侧，可靠近样品垫一侧，亦可靠近吸水垫一侧。本发明还提供了一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析试剂盒，包括扣卡(13)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液，如图5所示。该试剂盒采用间接预润免疫层析方法。扣卡(1 为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(11)、视窗(1 和润湿孔
(14)，且具低荧光特性或不含荧光剂。本发明实施例中的荧光免疫层析试纸条结构如图2所示，其包含样品垫(1)、标记垫O)、层析膜、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫( 和底板(6)。层析膜(4)包含质控带(8)和定量带(7)。其中样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10) 和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫(1)位于上样孔(11)的下方，且连接于标记垫 O)，标记垫( 连接于层析膜，层析膜(4)上固定有两条质控带(8)和两条定量带(7)， 且质控带(8)位于定量带(7)的两侧，层析膜(4)位于视窗(1 的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(14)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(5)。进行全血样品层析时，试纸条还包括过滤膜(3)，具体结构如图3所示，其中试纸条包含样品垫(1)、标记垫O)、过滤膜(3)、层析膜、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫 (5)和底板(6)。过滤膜(3)连接于样品垫⑴与标记垫(2)之间。本发明构建的间接预润免疫层析试纸条，其特征是，增加了润湿垫(9)和连接垫 (10)，其中润湿垫分别与层析膜(4)和连接垫(10)毛细作用接触，用于缓冲液的滴加，以润湿层析膜G)，并减少非特异性吸附。
连接垫(10)分别与润湿垫(9)和吸水垫(5)毛细作用接触，具有缓慢的吸水速度，以减少润湿时的吸水量，促使缓冲液充分润湿层析膜；当加样品层析时，吸水垫(5) 可通过连接垫(10)吸水，促使样品层析。试纸条的层析膜(4)具有弱荧光特性或不含荧光剂，其荧光噪声在大于550nm时很弱，以减少对低浓度CRP检测的影响。本发明的主要优点如下1)临床上常规CRP检测试剂盒，其最低检测限一般为3 5mg/L，灵敏度较低，无法对:3mg/L以下水平的CRP含量进行准确测定，因此无法作为有效预测评估心脑血管疾病的危险指示。而对于临床上高敏CRP检测试剂盒而言，测定范围上限较低，仅为100mg/L，对高浓度水平下的CRP含量测定具有一定的局限性，以致无法用于感染性疾病、抗生素疗效方面的诊断或观测。本发明所述试剂盒结合两者优势，报告范围可达到0. 05 250mg/L，即可同时对感染性疾病、抗生素疗效及心脑血管疾病等诊断评估。2)本发明采用量子点作为特异性抗体的荧光标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。 本发明优选了 550 1300nm的量子点，且质控分子和特异性抗体修饰的量子点选用两种不同发射波长的量子点，以降低非特异性吸附，提高检测灵敏度。3)本发明试剂盒组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。4)本发明全程定量检测CRP的荧光免疫层析方法可利用润湿层析技术，减少非特异性吸附，增强特异性结合，进而提高检测灵敏度，有利于样品中CRP含量极低时的准确定量。5)本发明方法与常规胶体金免疫层析相比，具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。
图1为直接预润荧光免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为标记垫， 3为过滤膜，4为层析膜，5为吸水垫，6为底板，7为定量带，8为质控带；图2为间接预润荧光免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为标记垫， 4为层析膜，5为吸水垫，6为底板，7为定量带，8为质控带，9为润湿垫，10为连接垫；图3为间接预润荧光免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为标记垫， 3为过滤膜，4为层析膜，5为吸水垫，6为底板，7为定量带，8为质控带，9为润湿垫，10为连接垫；图4为直接预润荧光免疫层析试剂盒示意图，其中13为扣卡，11为上样孔，12为视窗，8为质控带，7为定量带。图5为间接预润荧光免疫层析试剂盒示意图，其中13为扣卡，11为上样孔，12为视窗，8为质控带，7为定量带，14为润湿孔。
具体实施方式
本发明公开了一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒， 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明的技术方案为步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应C-反应蛋白的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现C-反应蛋白的定量检测。本发明荧光免疫层析的原理和检测方法为采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理全程定量检测样品(全血、血清或血浆)中的C-反应蛋白(CRP)的含量。检测时，首先滴加缓冲液将层析膜润湿，然后将样品加入到上样孔中，样品流经标记垫时与量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带及质控带。 若样品中含有CRP，则与量子点表面的CRP抗体相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于该条带的抗体所捕获，从而构成双抗体夹心复合物。光源激发下，采用荧光定量仪可获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而可分析出样品中含有CRP的浓度。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 以化学交联方式将抗体修饰于量子点并采用直接预润免疫层析对CRP 的定量检测(一 )量子点与抗体的修饰将发射波长为650nm的量子点与lmg/mL的CRP单克隆抗体混合，并在新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，lmg/mL)和碳化二亚胺盐酸盐(EDC，lmg/mL)作用下室温反应 4 证，加入lmol/L甘氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到CRP单克隆抗体修饰的量子点。同理得到兔IgG修饰的量子点。其中CRP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为 650nm，兔IgG修饰的量子点的荧光发射波长为570nm。( 二)试剂盒的构建以1 1的比例混合两种量子点标记物，并加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗
10糖(1 15% )以及吐温20、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂的含量在0. 05 2%之间，随后均勻喷涂在标记垫上，37°C干燥后密封，4°C下保存。如图1所示，组装定量检测CRP的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫 O)、过滤垫(3)、层析膜0)、吸水垫( 组成，顺次粘贴于黑色底板(6)上。其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为样品收集区；标记垫中含有CRP抗体修饰的量子点以及兔 IgG修饰的量子点；层析膜上包含定量带(7)和质控带(8)，定量带和质控带的间隔R为 3mm彡R彡8mm，且定量带(7)固定有区别于标记垫中CRP抗体的另一抗原表位CRP抗体， 质控带(8)包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧。组装好后，按照要求切割为所需宽度， 并置于扣卡内，加入干燥剂封装，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。(三)样品的检测A)将CRP抗原标准品用正常人全血作为稀释液分别配制为Omg/L和200mg/L浓度；B)将步骤A)中两种浓度的CRP标准品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和05的比例进行混合；C)在层析膜上滴加20μ L的缓冲液，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的 PH 9. O的磷酸缓冲液，层析反应30s ；D)分别将步骤B)中配制的全血溶液(120yL)滴加于上样孔(11)中，层析反应 15min ；E)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；F)同步骤C)和步骤D)操作，对样品进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤E)中的标准曲线分析该样品中CRP的含量；G)输出检测报告。(四)结果分析结果表明，其最低检测限为0.05mg/L，最低定量限为0. 16mg/L，且批内与批间重复性均较好，相关系数R2 > 0. 99，对心血管疾病的诊断具有参考价值。实施例2 以生物素-亲和素系统将抗体修饰于量子点并采用间接预润免疫层析对CRP的定量检测(一 )量子点与抗体的修饰首先采用pH 9. O的碳酸氢钠缓冲液对ImL的CRP单克隆抗体(lmg/mL)进行充分透析，加入20 120 μ 1 二甲亚砜(DMSO)新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(NHSB， lmg/mL)，室温避光反应4h。加入lmol/L NH4Cl,室温下振荡反应lOmin，然后将溶液置于透析袋中，过夜透析纯化，并采用超滤离心管浓缩，配制为所需浓度，所得即为生物素化CRP 单克隆抗体。将链霉亲和素修饰的发射波长为900nm的量子点和生物素化的CRP单克隆抗体按照1 3 1 12的比例混合反应30 60min，所得即为CRP单克隆抗体修饰的量子点。 依据实施例1方式可制得兔IgG修饰的量子点。其中CRP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为900nm，兔IgG修饰的量子点的荧光发射波长为600nm。( 二)试剂盒的构建以1 1的比例混合两种量子点标记物，并加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15% )以及吐温20、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂的含量在0. 05 2%之间，随后均勻喷涂在标记垫上，37°C干燥后密封，4°C下保存。如图2所示，组装定量检测CRP的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫 (2)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(5)组成，顺次粘贴于黑色底板(6)上。 其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待检样品收集区；标记垫中含有CRP抗体修饰的量子点以及兔IgG修饰的量子点；层析膜上包含定量带(7)和质控带(8)，定量带和质控带的间隔R为3mm彡R彡8mm，且定量带(7)固定有区别于标记垫中CRP抗体的另一抗原表位CRP抗体，质控带(8)包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧；润湿垫与层析膜毛细搭接1 2mm ；连接垫分别与润湿垫和吸水垫毛细作用接触，起缓冲连接作用。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于扣卡(13)内，如图4所示，加入干燥剂封装，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。(三)样品的检测A)将CRP抗原标准品用正常人血清作为稀释液分别配制为Omg/L和250mg/L浓度；B)将步骤A)中两种浓度的CRP标准品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和05的比例进行混合；C)在层析膜上滴加40μ L的缓冲液，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的 PH 9. O的磷酸缓冲液，层析反应Imin ；D)分别将步骤B)中配制的血清溶液(IOOyL)滴加于上样孔(11)中，层析反应 13min ；E)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；F)同步骤C)和步骤D)操作，对样品进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤E)中的标准曲线分析该样品中CRP的含量；G)输出检测报告。(四)结果分析结果表明，其最低检测限为0. 0lmg/L,最低定量限为0. 03mg/L,且在0. 03 250mg/L的报告范围内，未出现HOOK效应，批内与批间重重复性、稳定性良好，相关系数可达R2 > 0. 99，对心血管疾病的诊断具有参考价值。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种全程定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550 1300nm ；步骤幻将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应 C-反应蛋白的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤；3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现C-反应蛋白的定量检测。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为900nm，步骤2、所述质控分子修饰的量子点的发射波长为600nm。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为650nm，步骤2)所述质控分子修饰的量子点的发射波长为570nm。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。
5.根据权利要求4所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述化合物为选自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一种或几种，且可掺杂Cu、Mn和Hg。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述层析膜在大于 550nm时荧光很弱或不含荧光剂。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述荧光免疫层析试纸条还包括能使样品中液体与细胞分离的过滤膜。
9.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤4)所述免疫层析为预润免疫层析，其中预润免疫层析为先以缓冲液预润层析膜，再于样品垫中加入样品，当样品流经定量带和质控带后，进行荧光定量检测。
10.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述预润层析膜是指将缓冲液直接滴加于层析膜。
11.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，当所述预润层析膜为将缓冲液间接滴加于层析膜时，步骤幻所述的荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。
12.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述缓冲液为pH7. 2 11的碱性缓冲液。
13.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液。
14.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9. 0的磷酸缓冲液。
15.一种定量检测C-反应蛋白的荧光免疫层析试剂盒，包括扣卡(13)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液，其特征在于，所述扣卡(1 为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(11)、视窗(1 和润湿孔(14)；所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫(1)、标记垫 (2)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(5)和底板(6)，其中样品垫(1)、标记垫 O)、层析膜、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫(1) 位于上样孔(11)的下方，且连接于标记垫0)，标记垫(2)连接于层析膜G)，层析膜(4) 上固定有两条质控带(8)和定量带(7)，且质控带(8)位于定量带(7)的两侧，层析膜(4) 位于视窗(12)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(14)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(5)。
16.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条还包括过滤膜(3)，其中所述过滤膜C3)连接于样品垫(1)和层析膜(4)之间，且通过毛细作用接触。
17.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述扣卡(1 具有低荧光特性或不含荧光剂。
全文摘要
本发明公开了一种全程定量检测C-反应蛋白(CRP)的荧光免疫层析方法及其试剂盒。本发明的全程定量检测CRP荧光免疫层析方法是利用量子点的优良荧光特性，结合双色标记技术及免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明试剂盒可对CRP进行全程定量，即可同时对感染性疾病、抗生素疗效，及心脑血管疾病进行预测评估，适用于各级医院，特别有助于在基层医院及诊所的广泛推广。
文档编号G01N33/68GK102539785SQ20111045163
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者王秀利 申请人:深圳康美生物科技股份有限公司