专利名称：过滤染色计数细胞的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测量装置，具体地说，是关于细胞计数的装置。
背景技术：
细胞计数是在生命科学研究，尤其是在细胞培养相关实验和生产中经常使用的技术。现有细胞计数方法各有局限经典的血球计数板法及其系列衍生方法(如申请号为 01213605.0的中国专利所述细胞计数方法)虽然测量直观，但由于细胞分散不利或检测人员的熟练程度等原因会产生计数误差，且单个样本计数耗时较长，无法同时对大量样本进行操作，降低了实验结果的平行性；染色法虽然可以满足批量操作的要求，但是往往仅适用于贴壁生长的细胞(如日本专利W02006003696)，对于悬浮生长的细胞还需若干操作才能完成，从而影响了计数的批处理程度，降低了计数的准确性。
发明内容为了克服现有技术计数准确度不高、不易于实现自动化的缺点，本发明提供了一种操作简单，主观度数因素少，易于实现自动化批处理的细胞计数方法。本发明所采用的技术方案包括洗涤液容器、染色液容器、脱色液容器、废液容器、 过滤装置、泵系统、比色装置、三通阀和计算机。实验组及标准组细胞悬液通过三通阀分别与洗涤液容器、染色液容器相连通，之后通过三通阀与脱色液容器相连通至过滤装置，过滤装置的输出口通过泵系统与比色装置相连，比色装置将测量数据反馈于计算机。待检测完成后，由和比色装置相连的导管将废液排除到废液容器中。在上述各个环节中，由计算机控制各个三通阀、泵系统以及比色装置工作。所述的洗涤液采用细胞悬液2倍以上体积的磷酸盐缓冲液。所述的染色液采用细胞悬液1倍以上体积的浓度为0. 的结晶紫溶液，采用水、生理盐水或PBS缓冲液作为溶剂配制。所述的脱色液采用细胞悬液1倍以上体积的浓度为3% 30%的醋酸溶液。本发明工作时包括以下步骤1.准备好需要计数的未知数量的实验组细胞和至少4组已知数量的标准组细胞悬液，所述细胞悬液可由悬浮生长细胞直接使用，或贴壁细胞经过消化步骤形成，各组细胞悬液的体积相同；2.每个细胞悬液样品对应一个过滤装置，分别将各组细胞悬液通过过滤装置，使细胞截留在滤膜之上；3.分别使用细胞悬液2倍以上体积的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗截留在过滤装置上的细胞；4.分别加入细胞悬液1倍以上体积的浓度为0. 的结晶紫溶液于过滤装置中浸泡细胞10分钟 1小时；5.分别吸去结晶紫溶液，用细胞悬液5倍以上体积PBS清洗过滤装置中的细胞；[0014]6.分别排出过滤装置中残存液体；7.分别用细胞悬液1倍以上体积的浓度为3% 30%的醋酸溶液冲洗过滤装置， 收集滤液；8.分别将所得滤液经稀释3倍体积以上后，使用可见分光光度计，测量570nm波长处光密度；9.结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲
线计算得知；10.根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即(I
实验/a。本发明的有益效果是由于采用过滤装置对细胞悬液进行过滤，截留细胞，已过滤装置中的滤膜作为固相支持载体，对其上细胞进行染色、冲洗、脱色等处理，最终利用结晶紫洗脱液的光密度来计算细胞数量。与现有技术相比，本发明体现了减少主观度数因素对结果的影响，易于实现自动化批处理，以提高测定精度及结果平行性的有益效果。
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的方法流程图；图2是本发明的装置示意图；图中，1-实验组及标准组细胞悬液，2-洗涤液容器，3-染色液容器，4-脱色液容器，5-过滤装置，6-泵系统，7-比色装置，8-废液容器，9-计算机，10-三通阀b，11-三通阀
a,12-三通阀C。
具体实施方式
装置实施例本发明同时设计用于过滤染色计数细胞方法的装置。装置包括洗涤液容器、染色液容器、脱色液容器、废液容器、过滤装置、泵系统、比色装置、三通阀、计算机。具体说明如下实验组及标准组细胞悬液通过三通阀b分别与用于细胞洗涤、染色的容器相连通，此过程通过三通阀b与三通阀a(连接洗涤液与染色液的容器)的连接实现；同时，三通阀b与用于染色后细胞脱色的容器相连通，此过程通过三通阀b与三通阀c (连接脱色液的容器)的连接实现。此外，三通阀c连接过滤装置，过滤装置与泵系统相连通；同时泵系统与比色装置相连，比色装置将测量数据反馈于计算机。待检测完成后，由和比色装置相连的导管将废液排除到盛放废液的容器中。在上述各个环节中，由计算机控制三通阀a、三通阀
b、三通阀C、泵系统以及比色系统的启动与否。方法实施例1 使用本发明所述方法进行人白血病细胞系K562细胞计数1、准备人白血病细胞系K562以未知密度(实验组)及已知密度(标准组)每毫升 8X105、4X105、2X105、1X105、0. 5X105、0. 25X 105 个细胞；2、将0.2毫升的各组样品混勻后分别注入过滤装置5，使细胞截留于过滤装置5之
4上； 3、开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2，分别注入1毫升洗涤液容器2中的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗过滤装置5上的细胞；4、开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2加入0.5毫升染色液容器3中的浓度为0. 的结晶紫溶液于过滤装置中浸泡细胞1小时；5、使用泵系统6吸去结晶紫溶液，开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2并用 10毫升洗涤液容器2中的PBS清洗过滤装置5中的细胞；6、通过泵系统6排出过滤装置5中残存液体；7、开启三通阀cl2，用0. 5毫升脱色液装置4中的10%的醋酸溶液浸泡过滤装置 5上的细胞，使之脱色，收集脱色液；8、将所得滤液经3倍稀释后，使用比色装置7如可见分光光度计，测量570nm波长处光密度，并将数据传入计算机9 ；9、结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲
线计算得知；10、根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即Ni9s= (I实
验 /aD11、结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量Nia的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；12、根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即Ni9s= (I实
验 /aD方法实施例2 使用本发明所述方法进行人骨样细胞系ML0-Y4细胞计数1.准备人骨样细胞系ML0-Y4以未知密度(实验组)及已知密度(标准组)每毫升 4Χ105、2Χ105、1Χ105、0. 5Χ105、0· 25X IO5 个细胞；2.将0. 3毫升的各组样品混勻后分别注入过滤装置5，使细胞截留于过滤装置5 之上；3.开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2，分别注入1. 5毫升洗涤液容器2中的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗过滤装置5上的细胞；4.开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2加入1毫升染色液容器3中的浓度为0. 的结晶紫溶液于过滤装置中浸泡细胞1小时；5.使用泵系统6吸去结晶紫溶液，开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2并用 12毫升洗涤液容器2中的PBS清洗过滤装置5中的细胞；6.通过泵系统6排出过滤装置5中残存液体；7.开启三通阀cl2，用1毫升脱色液装置4中的10%的醋酸溶液浸泡过滤装置5 上的细胞，使之脱色，收集脱色液；8.将所得滤液经5倍稀释后，使用比色装置7如可见分光光度计，测量570nm波长处光密度，并将数据传入计算机9 ；9.结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度Iia与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；10.根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即(I
实验/a。11.结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；12.根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即(I
实验/a。方法实施例3 使用本发明所述方法进行人成骨肉瘤细胞系MG-63细胞计数1、准备人成骨肉瘤细胞系MG-63以未知密度(实验组)及已知密度(标准组)每毫升 8X105、4X105、2X 105、1X 105、0. 5X IO5 个细胞；2、将0.5毫升的各组样品混勻后分别注入过滤装置5，使细胞截留于过滤装置5之上；3、开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2，分别注入2毫升洗涤液容器2中的磷酸盐缓冲液(PBQ清洗过滤装置5上的细胞；4、开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2加入1. 5毫升染色液容器3中的浓度为0. 的结晶紫溶液于过滤装置中浸泡细胞1小时；5、使用泵系统6吸去结晶紫溶液，开启三通阀all、三通阀blO和三通阀cl2并用 15毫升洗涤液容器2中的PBS清洗过滤装置5中的细胞；6、通过泵系统6排出过滤装置5中残存液体；7、开启三通阀cl2，用1. 5毫升脱色液装置4中的10%的醋酸溶液浸泡过滤装置 5上的细胞，使之脱色，收集脱色液；8、将所得滤液经2倍稀释后，使用比色装置7如可见分光光度计，测量570nm波长处光密度，并将数据传入计算机9 ；9、结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲
线计算得知；10、根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即Nf5s= (Ii
验 /aD11、结合标准组已知细胞数量与光密度绘制标准曲线，得到光密度与细胞数量的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；12、根据标准曲线和实验组细胞样品的光密度计算实验组细胞数量，即Nf5s= (Ii
验 /aD采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广(0. 25X IO5 8X IO5)，数据结果平行性好，根据所得一元方程及测量样本的570nm处光密度，可以快速、准确的计算出样本中的细胞数目。
权利要求1.一种过滤染色计数细胞的装置，包括洗涤液容器、染色液容器、脱色液容器、废液容器、过滤装置、泵系统、比色装置、三通阀和计算机，其特征在于实验组及标准组细胞悬液通过三通阀分别与洗涤液容器、染色液容器相连通，之后通过三通阀与脱色液容器相连通至过滤装置，过滤装置的输出口通过泵系统与比色装置相连，比色装置将测量数据反馈于计算机；待检测完成后，由和比色装置相连的导管将废液排除到废液容器中；在上述各个环节中，由计算机控制各个三通阀、泵系统以及比色装置工作。
2.根据权利要求1所述的过滤染色计数细胞的装置，其特征在于所述的洗涤液采用细胞悬液2倍以上体积的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的过滤染色计数细胞的装置，其特征在于所述的染色液采用细胞悬液1倍以上体积的浓度为0. 的结晶紫溶液，采用水、生理盐水或PBS缓冲液作为溶剂配制。
4.根据权利要求1所述的过滤染色计数细胞的装置，其特征在于所述的脱色液采用细胞悬液1倍以上体积的浓度为3% 30%的醋酸溶液。
专利摘要本实用新型公开了一种过滤染色计数细胞的装置，实验组及标准组细胞悬液通过三通阀分别与洗涤液容器、染色液容器相连通，之后通过三通阀与脱色液容器相连通至过滤装置，过滤装置的输出口通过泵系统与比色装置相连，比色装置将测量数据反馈于计算机；待检测完成后，由和比色装置相连的导管将废液排除到废液容器中；在上述各个环节中，由计算机控制各个三通阀、泵系统以及比色装置工作。本实用新型体现了减少主观度数因素对结果的影响，易于实现自动化批处理，以提高测定精度及结果平行性的有益效果。
文档编号G01N15/14GK202075202SQ201120119330
公开日2011年12月14日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者商澎, 李亚楠, 李京宝, 骞爱荣 申请人:西北工业大学