专利名称：用于神经毒性检测的标志物和测定方法
技术领域：
本发明涉及神经毒性的标志物的鉴定和使用。发明的标志物包括蛋白；或蛋白片 段；自身抗体；DNA ；RNA ;SmiRNA。发明的生物标志物可以在中枢神经系统功能和治疗中起作用。
背景技术：
神经退行性变和神经毒性是与在中枢神经系统(CNS)中药理活性的一些化合物相关联的安全风险。但是，监测神经退行性变在临床前和临床药物开发中都是困难的。与在患者中在临床前模型中脑病理的依赖性组织学评估相比，神经退行性变和神经毒性的基于定量的脑脊髓液(cerebral spinal fluid,CSF)和血液的蛋白生物标志物能改善非临床安全性评估和我们在临床研究中监测病人安全的能力。创伤的、缺血性的和神经毒性的化学损伤，和遗传疾病一起，都呈现脑或其它神经系统损害的前景。虽然通过临床反应检测和电脑断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)检测，这些病因的每一个的严重形式的诊断是明确的，但是这些诊断有其局限性，因为光谱成像是既昂贵又耗时的，而无行为能力的个人的临床反应检测是有限值的，并往往排除了细致入微的诊断。此外，由于现有的诊断的局限性，对象经受对他们的神经系统状况的应力以致对象常常没有意识到损害已经发生或寻求作为细微症状的治疗的情形往往很快解决。这些对对象的神经系统状况的轻度至中度的攻击的治疗的缺乏可以具有累积效应，或随后导致在任何情况下具有差临床预后的严重的脑损伤事件。为了克服与神经系统疾病的成像和主观的临床反应诊断相关的局限性，对使用生物标志物作为对象的分子或细胞水平健康状况变化的内部指示剂给予越来越多的关注。由于生物标志物的检测使用从对象获得的样品并检测在该样品典型地脑脊髓液、血液或血浆中的生物标志物，生物标志物检测具有廉价、快速和客观地测量神经系统疾病的前景。随着神经系统疾病的迅速和客观指示剂的获得允许人们规模化和带有一定程度的客观性确定非正常的脑部疾病的严重程度，从而预测预后，指导疾病的治疗，以及监视对象的反应和恢复。此外，从众多的对象获得的这种信息使人们获得了对脑损伤机制的一定程度的了解。同样重要的是与化学损伤和候选治疗物相关联的毒性的测量或鉴定。由于不可预见的毒性，显著比例的药物候选物从临床试验中脱离。由于毒性问题在临床前阶段没有存活的化合物的数量就更大了。在人类中目前所采用的毒性筛选和毒性预测之间的脱节仍然保留。关于神经毒性，这是特别正确的。神经毒性既是难以测量的而且往往与药物候选物的已知机制是无关的。需要神经毒性的更好的测量，以便允许进入临床试验之前早期检测潜在的不期望的副作用。暴露于化学或生物试剂例如在药物或其它治疗候选物筛选过程中仍然难以研究。这些研究一般分析神经细胞死亡。然而，存在需要对于检测来自攻击的神经细胞功能、结构、组织或其它比较不严重的结果的改变有用的组合物和方法。中枢神经系统(centralnervoussystem, CNS)神经毒性损伤的生物标志物例如由本发明提供的那些能够给予科学家们可定量的神经化学标志物以帮助不仅确定神经毒性的严重程度和细胞病理学，而且也提供治疗性干预的替代标志物。因此，存在需要一种神经毒性的敏感和特异的生化标志物，其也可以提高诊断能力和病人管理，并促进疗效评价。作为触发导致神经元损伤的轴突和树突状退变的主要促成因素之一，谷氨酸诱导的兴奋性毒性已经建立为用于神经退行性疾病以及许多其他神经系统疾病的一个模型系统。TBI的神经病理后果是通过在导致蛋白酶例如某些蛋白的钙蛋白酶和半胱天冬酶片段·激活的胞浆Ca2+上的持续的谷氨酸诱导增加以及大脑蛋白/片段至体液(例如CSF、血液、血浆、血清)的选择释放进行介导的，这些被认为是脑损伤的生物标志物。红藻氨酸(Kainicacid, KA)是一种已知的激活离子型谷氨酸受体的子类的兴奋性毒素，且它是神经毒性的，即使当皮下注射时(sq.)。 因此，还存在需要一种大鼠KA兴奋性毒性模型来研究TBI的几种生物标志物的分布、关系和定位泛素 C-末端水解酶 I (ubiquitin C-terminal hydrolase I, UCHL I)、月交质纤维酸性蛋白(glialbrillary acidic protein, GFAP )、all-血影蛋白降解产物(SBDP150, SBDP145和SBDP120)。特别在已知为海马的大脑区域的神经元退变导致激动和抑制的不平衡，其自身表现为癫痫。从而生物标志物对于在动物模型和病人中癫痫的检测和预测也是重要的。此外，癫痫已经被描述为在TBI中的长期并发症之一。此外，例如在乳腺癌中化疗诱导的认知下降已经被认为该治疗方案的严重的副作用之一。癌症是在世界各地特别是美国的妇女中癌症相关的死亡的首要原因。在20世纪50年代和20世纪60年代发现化疗剂以来，化疗仍然是用于乳腺癌的主要的和经常仅仅可得的有疗效的治疗。然而，使用这种有效的治疗往往由其不利的副作用所限制。对于最广泛使用的有效的乳腺癌治疗的各种全身剂，包括紫杉烷类化合物(taxanes) (S卩，紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(docetaxel))和钼化合物(即，顺钼(cisplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)、卡钼(carboplatin)),具有随之而来的神经病变的神经毒性是普遍公认的主要副作用。由紫杉醇和顺钼产生的神经毒性可以限制治疗剂量或导致其停止，从而削弱了其有用性和有效性。此外，神经病变可以显著损害病人的生活质量。虽然PNS神经毒性是一种普通的经过充分研究的副作用(Murillo等，2008)，几份报告显示这些试剂也能对中枢神经系统有神经毒性(Perry和Warner，1996)。因此，用于早期检测由于乳腺癌化疗导致的PNS和CNS神经病变的新的生物标志物的发现导致合适治疗策略的更明智的选择以尽量减少长期神经病变的严重或风险的不利后果。因此，存在需要一种使用生物标志物检测药物发现中的神经毒性或作为治疗给药的辅助物的方法。还存在需要一种监测由化疗药物诱导的CNS和PNS中的神经毒性和神经病变的方法用于早期检测神经毒性控制剂量以限制神经毒性，特别用于乳腺癌化疗药物，并允许早期治疗干预以尽量减少化疗的神经毒性副作用。
图I说明了对甲基安非他明或顺钼的神经毒性反应后在体液区中生物标志物升闻。图2描绘了红藻氨酸(KA) (9mg/kg)给药在大鼠CSF中GFAP和UCH-L1的水平上的时间依赖效果。图3描绘了红藻氨酸(KA) (9mg/kg)给药在大鼠CSF中血影蛋白降解产物上的时间依赖效果。图4A描绘了用于SBDP145和SBDP150的Western blot检测，图4B以及图4C是 来自SBDP145和SBDP150血影蛋白降解产物的Western blot检测的描绘KA (9mg/kg)给药在大鼠海马中血影蛋白降解产物上的时间依赖效果的条形图。图5是显示在KA处理的大鼠的海马中α II-血影蛋白降解产物的增加的水平的组织学图像。图6是显示在KA处理的大鼠的海马中GFAP表达的增加的水平的组织学图像。图7是显示在KA处理的大鼠的海马中激活的半胱天冬酶-3的增加的水平的组织学图像。图8描绘了显示α -微管连接蛋白(a -internexin)作为释放到人TBI CSF样品中的生物标志物(a -internexin BDP)的Western blot分析。图9描绘了用于α -微管连接蛋白的Western blot分析，其中α-微管连接蛋白(54kDa)的水平在成年与胚胎第18天大鼠脑中没有变化。图10描绘了用于在成年与胚胎第18天大鼠脑中巢蛋白(Nestin protein)的水平的Westernblot分析。图11描绘了用于α -微管连接蛋白(a-internexin)作为释放到人TBI CSF样本中的生物标志物(ct -internexin BDP)的Western blot分析的比较。
具体实施例方式历史上，由于缺少淋巴系统和血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的保护,大脑被认为是享有免疫特权的。但是，大脑损伤，无论是来自化学、撞击，或其它损伤，往往造成对脑组织或BBB的损害，导致释放抗原如肽、降解的蛋白片段、蛋白、DNA和RNA(包括miRNA)至脑脊髓液(CSF)或血液，对它们的自身抗体随后增加形成。本发明在通过检测释放的细胞材料检测由化学毒性、身体创伤、疾病、或感染在体内或体外导致的正常或不正常的神经系统状况中具有用处。具体而言，本发明具有用处用于由于化学或其它损伤导致的神经毒性的筛选分析或诊断。本发明还具有用处用作一种检测可预测或指示未来疾病或损伤的神经系统创伤或状况的方法。举例来说，本发明具有用处用作一种体内或体外用于药物开发的安全或有效筛选实验方案。药物开发并不局限于针对神经系统疾病的药物。在一个优选的具体实施例中，发明的生物标志物具有用处用于在体外动物研究中检测预期的或意外的神经系统的副作用，作为一种选择先导化合物用于分析的方法，或作为一种评估先前确定的药物候选物的安全性的方法。可以理解，在疾病发病之前，通过监测如在这里详细描述的至少一种生物标志物以检测神经系统疾病的诱导作为用于确定对象可以暴露的最大剂量水平的基础，一种药物，无论是批准的商业治疗物(如化疗物)还是药物候选物，很容易施用给对象。还可理解，不同的个人将具有特定的药物耐受性阈值，因此，本发明代表一种与具有潜在的神经毒性的化合物给药相关联的辅助监测方法。本发明提供生物标志物如UCH-Ll、GFAP, MAP_2、SlOO β和血影蛋白降解产物如SBDP145、SBDP150、SBDP150i和SBDP120在对象的各种组织中的鉴定，以及它们的浓度和神经退行性疾病及tau蛋白病的相关性。本发明还包括在诊断神经系统疾病中使用生物标记的方法。这样一种方法是在它们通过色谱法(例如，电泳和Western blotting)分离之后在大脑提取物中和在大脑组织切片(免疫组织化学)中生物标志物的一种或多种生物标志物的检测。一个另外的应用是在病人的体液(例如CSF、血清、血浆和尿液)中一种或多种这些生物标志物的检测和定量，用于诊断目的和监测治疗干预。本发明还提供了一种用于安全评估药物发现、监测、药物神经毒性筛选和上市后安全评估和监测已知潜在神经毒性的药物的方法。例如监测对癌症药物的反应以防 止或尽量减少这些药物的副作用，例如化疗后认知损伤(post-chemotherapy cognitiveimpairment,PCCI,被称为化疗脑)和化疗诱导的周围神经病变(chemo-inducedperipheralneuropathy, CIPN)。由于红藻氨酸的性质是一种强有力的中枢神经系统兴奋剂，在实验动物中诱导癫痫，本发明还提供了癫痫、癫痫持续状态或单一癫痫发作包括刺激发作病人的健康评估，由于过量导致癫痫发作的药物如抗精神病药物的上市后评估，和由非法药物或酒精及其停止导致的损害评估。长期暴露于神经毒素，如红藻氨酸，已知有助于神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病，因此，本发明还提供了一个诊断长期暴露于神经毒素导致的神经退行性疾病的度量。如在这里所使用的，损伤是在细胞或分子完整性、活性、水平、鲁棒性、状态的改变，或其它可追溯至一个事件或损害的改变。损伤示例性地包括物理的、机械的、结构的、化学的、生物的、功能的、感染的或其它的细胞或分子特性的调节物。事件示例性地是化学或生物损害，如暴露于化学或生物剂。事件可选的是由感染源导致的感染。本领域技术人员知道由术语损伤或事件包含的许多相当的损伤。可以理解，这样一种试剂表示治疗疾病施用的药物，但在某些剂量或在某些对象中具有神经毒性。在这里使用的术语“生物标志物”表示抗体、DNA、RNA、miRNA、RNA片段、DNA片段、肽、蛋白、脂质、或其它其存在、不存在、水平或活性与神经毒性、损害或疾病相关或预测的生物材料。可选地，生物标志物是蛋白。可选地或另外，发明的生物标志物是编码或是α II-血影蛋白;血影蛋白降解产物(SBDP)示例性地SBDP150, SBDP150i, SBDP145和SBDP120 ；GFAP ;神经兀特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE);神经丝蛋白轻lj|(neurofilament protein light chain, NFP) ;a_ 微管连接蛋白(a—internexin);巢蛋白(nestin),泛素 C-末端水解酶 LI (ubiquitin C-terminal hydrolase LI, UCH-Ll)；神经兀核蛋白(NeuronalNuclei protein, NeuN) ;2’，3’ -环核苷酸3’ -憐酸二酯酶(2，，3, -cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase, CNPase);可溶性细胞间粘附分子-I (Soluble Intercellular AdhesionMolecule-1, sICAM-1);诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的寡核苷酸或肽的一部分或全长，或在表I中列出的其它标志物。可选的，发明的生物标志物识别、编码或是UCH-Ll或SBDP150或SBDP145。发现神经元特异性烯醇化酶(NSE)主要存在于神经元中。发现GFAP只存在于雪旺氏细胞中。发现CNPase存在于中枢神经系统的髓鞘质中。表I
权利要求
1.一种用于筛选神经毒性损伤的方法，包括 可选的，将细胞暴露于怀疑为神经毒素的化学或生物剂； 测定对象的生物样品中神经毒性的一个或多个生物标志物的存在；和 基于在所述样品中所述一个或多个所述生物标志物的存在检测神经毒性损伤。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述测定用于神经系统疾病的两个生物标志物的存在，其中所述检测基于在所述样品中所述两个生物标志物的比例。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物是选自包括泛素羧基末端水解酶-LI (UCH-L1);血影蛋白；血影蛋白降解产物(380 );獻 1，獻 2;6 4 ，泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；神经元定位细胞内蛋白；MAP_tau ；C-tau ;聚(么0 _核糖)聚合酶(PARP);脑衰蛋白响应调节蛋白；突触结合蛋白，β III-微管蛋白，SlOOii ;神经元特异性烯醇化酶，神经丝蛋白轻链，巢蛋白，ct -internexin ;其降解产物,其翻译后修饰形式,其衍生物，和其组合的组的蛋白。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物是泛素羧基末端水解酶、SBDP150、SBDP145、SBDP150 i、SBDP120、MAP I、MAP2、GFAP、突触结合蛋白、βΙΙΙ-微管蛋白、或SlOOP中的至少一个。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标志物比例大于2。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标志物比例小于O.5。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物是RNA生物标志物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述RNA生物标志物是miRNA。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物是针对选自包括泛素羧基末端水解酶-LI ;GFAP;血影蛋白；血影蛋白降解产物(SBDP);巢蛋白；a -internexin ；MAP1,MAP2 ;泛素羧基末端酯酶；神经元定位细胞内蛋白；MAP_tau ;C_tau ，聚CADP-核糖)聚合酶(PARP);脑衰蛋白响应调节蛋白(CRMP);其降解产物，其翻译后修饰形式，其衍生物，和其组合的组的蛋白的自身抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物标志物是针对泛素羧基末端水解酶-LI、SBDP150、SBDP145、SBDP150i、SBDP120、MAP1、MAP2、GFAP、突触结合蛋白、β III-微管蛋白、或SlOOP中的至少一个的自身抗体。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物样品是全血、血浆、血清、脑脊髓液、其他体液(包括尿液、唾液、汗、眼泪)、分离的细胞、细胞裂解产物，细胞释放物、组织、组织裂解产物、组织释放物。
12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其中将细胞暴露于所述化学或生物剂的步骤存在。
13.根据权利要求I所述的方法，其中将细胞暴露于所述化学或生物剂的步骤存在，所述生物剂是红藻氨酸、氯丙酸、溴杀灵、氨甲喋呤、抗癌化学治疗剂、或戊四唑(PTZ)中的至少一个。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物剂是红藻氨酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中神经毒性损伤具有红藻氨酸诱导的癫痫发作的临床表现。
16.根据权利要求13所述的方法，其中神经毒性损伤具有癫痫发作的临床表现。
17.根据权利要求13所述的方法，其中神经毒性损伤具有神经退行性疾病的临床表现。
18.根据权利要求17所述的方法，其中神经退行性疾病由阿尔茨海默氏病导致。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述化学治疗剂是紫杉醇或有机钼化合物。
20.根据权利要求13所述的方法，还包括减少所述化学或生物剂的量；测定来自对象的第二生物样品中所述化学或生物剂的存在以确定一个量，低于该量，神经毒性损伤观察不到。
全文摘要
本发明提供用于诊断对象中神经毒性的方法和测定方法。对对象的神经毒性损伤的程度通过测量体液如CSF或血清中一个或多个生物标志物进行评估。提供的其它用途和优点包括上市前的药物发现、监测、药物神经毒性筛选和已知潜在神经毒性的药物上市后的安全评估和监测。
文档编号G01N33/53GK102918397SQ201180026227
公开日2013年2月6日 申请日期2011年4月1日 优先权日2010年4月1日
发明者安德烈亚斯·赫罗米尼, 奥莱娜·格卢沙科瓦, 凯文·卡王·王, 张智群, 罗纳德·L·海斯 申请人:班扬生物标记公司