专利名称：通过使用半抗体生物传感器形成稳态环用于检测和调节血管内皮生长因子(vegf)的方法 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学生物传感器，或者更具体地涉及固定并联板化学生物传感器和电容阵列，以及使用固定的单克隆半抗体制造它们的方法。
背景技术：
在正常生理发育中，VEGF是胚胎发生(血管生成(vasculogenesis))和成体血管形成(血管发生(angiogenesis))中血管发育的关键调节物。VEGF和VEGF-受体蛋白家族的成员具有不同、但重叠的配体-受体特异性、细胞类型表达和功能。VEGF-受体活化反过来又可调节身体中促进内皮细胞生长、迁移和存活的信号传递过程网络。VEGF还在发生于多种疾病(包括癌症)的病理性血管发生中起关键作用。VEGF和Flk-l/KDR RTK已被认为是病理性血管发生(包括肿瘤新血管形成)所需的关键的内皮细胞-特异性因子信号传递通路。在肿瘤发展中，激活VEGF通路可促进肿瘤血管形成、加速肿瘤生长和转移。异常VEGF功能还与包括动脉粥样硬化、银屑病、年龄相关性黄斑变性、糖尿病失明、类风湿性关节炎和甲状腺功能亢进的其他疾病相关。对血管发生的生物学理解的进展已经导致开发了数种治疗形式，用于抑制VEGF酪氨酸激酶信号传递通路。在正在生长的肿瘤中，抑制VEGF酪氨酸激酶信号传递通路可阻断新血管形成，导致肿瘤生长停滞或消退。人肿瘤的生长和转移的发生依赖于血管的从新形成，以实现低氧肿瘤微环境并向其提供养分。新血管形成受到靶向受体酪氨酸激酶(RTK)的特异性生长因子的严格调控。通过使用人源化单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)
(Avastin , Genentech/Roche)以及靶向VEGF受体(VEGF-R)酪氨酸激酶的两种激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib, Nexavar; Bayer)和舒尼替尼(sunitinib, Sutent, Pfizer)阻断VEGF的初步努力开始在人癌症患者中显示出希望，这凸显了优化VEGF阻断对神经系统癌症的重要性。许多的这些形式正在临床研究中被调查以评价它们治疗多种形式的人癌症的可能性，但这类研究的能力受限于这样的事实，即不容易进行VEGF水平和VEGF转导趋向的局部实时体内测量。已知可连续监测其周围环境以提供背景统计并对不健康状态提出警示的生物传感器被用于医学技术中。在本申请中，寻求微量溶液以使所述生物传感器的成本和影响最小，并使其使用寿命最大。在治疗持续期间由于监控肿瘤生长和消除过程的内在需求，使用一次性使用的生物传感器具有局限性。现有技术对“生物传感器”主题的讨论是广泛和深远的。有许多生物传感器的实例(例如重量分析生物传感器(gravimetric biosensor))。检测基础是当各种分析物连接至共振元件时发生的共振器共振频率降低。生物分析物的分析物特异性是通过用配体功能化(处理)所述共振器的暴露表面而被赋予的，所述配体可识别并结合所述靶分析物。靶生物分析物的合适结合实体的实例包括抗体、受体、凝集素、适体和寡核苷酸。现有技术中存在的一种类型的生物传感器是重量分析生物传感器，其中固定的结合基团位于膜表面上的一个或多个区域。所述固定的结合基团的位置、大小、区域和固定密度被设计为，使观察到的由所述靶分析物结合引起的所述膜频率和/或幅度的改变最大化。这继而使通过随后基于特异性和非特异性结合的所有组合的所述膜频率和/或幅度改变而可观察到的区别最大化。该区别可以采取三种形式Ca)所述膜共振频率的变化，(b)较高阶谐振的出现或消失，或者(c )振幅衰变率的变化。在这类生物传感器中，单个的膜可以由多个用于驱动和用于传感目的的可单独寻址元件组成。这使得可特异性激活所选择的较高阶振动模式并且能够同时振动驱动警报电路或类似装置。声波分析——其可用于重量分析传感器——的原理是公知的，其在文献中已经出现十年以上。分子相互作用可以通过生物大分子的极化率而用电子方法检测，通过使用荧光标签而用光学方法检测，通过使用放射性标记的标签而用放射测量法检测，或者用声学方法检测。最近，基于MEMS的传感器已被纳入生物技术和生物医学领域。声学生物传感器的应用包括细胞检测、葡萄糖生物传感、抗体-抗原识别和蛋白质吸附检测。20世纪50年代后期以来，压电石英晶体微天平(QCM)已经被用于检测气相和液相分析物。QCM技术在最近被应用于生物分析物。QCM已被用于跟踪蛋白质对未修饰的和修饰的石英晶体表面电极的非特异性吸附。将抗体固定于所述晶体表面可赋予分析物以特异性。需要一种装置，其具有的结构可用于构建用于无标记检测VEGF杂交的固态生物传感器。
发明内容
提供如下本发明所列举的实施方案概要以帮助理解本发明特有的一些创新特征，但不是意欲进行全面描述。可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为一个整体而获得对本发明各个方面的全面了解。对本领域普通技术人员来说，一旦阅读本说明书，本发明的其他目标和优点就会明显。本发明列举的实施方案的内容涉及通过使用固态制造技术的集成平台连同与被称为人源化单克隆抗体的蛋白元件(被选择用于以高亲和性力结合特定特异性靶蛋白靶标)的集成平台构建的生物传感器。具体地，从转移区域取得的肿瘤流体中发现的VEGF分子和固定的a-VEGF mhAb之间的杂交改变了传感器电极的电化学性质,这种改变可通过所述装置的电路来检测。本发明列举的实施方案的目标是通过测量VEGF分子与所述电容器极板的结合率而将肿瘤发生的生长速率与所述肿瘤流体中的VEGF水平相关联，并用所述VEGF传感的向量/趋势计划所述化学疗法的过程。所述电容器极板以互相交叉模式(interdigitated pattern)排列以使给定传感器体积的检测表面积最大化。可精确提供对VEGF水平的实时反馈的植入体内装置对于任何精细调节的抗血管发生治疗是至关重要的，使得系统可被逻辑地调节，并减少或改变抗血管发生试剂的摄入。本发明列举的实施方案通过在已知时间范围内模拟VEGF结合到VEGF单克隆抗体的过程来测量VEGF水平，并提供适合的VEGF水平反馈，用于受调节的药物和化学疗法反馈回路。呈现了所提出的VEGF检测器的制造，使用了技术和设备中所取得的显著改进用于制造微型装置，并因此概述了微机械设备的使用。硅制造和高精机械的改进开辟了用于研究和开发应用的现称为微电子机械系统(MEMS)的领域。随后开发的微型阀、泵、槽和热交换器使得可操作极其小的流体体积。与集成电路(IC)和MEMS领域中改善的大规模制造技术相结合，微流体和微化学系统被应用于实现本发明列举的实施方案。本发明列举的实施方案包括具有可在单个流体样品上操作的多个装置的协同且可变通的传感器系统。所述装置可以借助板载处理逻辑块进行全自动化学分析。所述列举的实施方案包括一种具有如下结构的装置，所述结构可用于构建用于无标记检测VEGF杂交的固态生物传感器。这个装置是通过以下方式实现形成以互相交叉模式排列的并联电容器的矩阵阵列，以达到对于最小电化学变化的高比值信号，并伴随电等值，从而可实现低成本、便携、完全集成的装置。用于检测兴趣分子存在的生物传感器可应用于多个领域，包括医学诊断、生物医学研究以及生物和化学战争中所用试剂的检测。存在对具有高敏感性的廉价、袖珍传感器的需求，所述传感器用于实时地在体内、无标记环境中检测VEGF分子，目的是报告状态例如浓度水平的趋势，并进一步使得可以形成闭合反馈回路以使用药物有效地调节(减弱、改变)所述生物活性。一般而言，生物靶复合体由可通过催化表面增强底物(例如单克隆抗体)形成的种子物质加上标签。然后，所述靶复合体可以结合至包括有VEGF标记物的捕获剂。然后，通过还原固定的捕获分子例如VEGF单克隆半抗体(a-VEGF mhAb)而在所述种子物质上生成所述底物。因此，在一个实施方案中，提供了一种生物靶复合体，其包括与第一特异性结合成员缔合的靶分析物。所述靶复合体进一步包括与所述第一特异性结合成员结合形成靶复合体的第二特异性结合成员。所述第二特异性结合成员包括适用于催化表面增强的a-VEGFmhAb底物形成的种子颗粒(seed particle)。在另一个实施方案中，适于结合任何已知的癌症标志物的任何种子颗粒都可使用本公开的方法被附着到所述靶复合体上。随后，所述复合体底物可以借助所述电子电路而活化，以提供所必需的阻抗效应变化。这些重要目标和其他重要目标根据如下对本发明的描述将变得明显。本发明的一个实施方案的目的是提供流体电池，所述流体电池被配置以使VEGF样品可在芯片的活性表面流动。流体流过所述传感器的速率是受控制的，使得可以实现VEGF分子在所述流体中与所述固定的a-VEGF mhAb的杂交和去杂交。详细计算所述杂交能量是去杂交并洗去所述VEGF分子以使所述传感器可重复用于进一步检测的计划的一部分。所述装置还需要通过使用基于适于结合VEGF单克隆抗体的电化学结合机制来检测所述VEGF分子的存在。当血液或肿瘤流体流过所述生物传感器时，漂浮的VEGF抗原将被所述表面固定的VEGF半抗体捕获，其中所述半抗体的抗原结合位点(称为Fab)特异性结合到所述抗原的表位位点。所述结合是由下述力的组合驱动和决定的静电键、氢键、范德华力、疏水力和芳香η键。在具体的进一步开发中，本发明中至少一个实施方案的方法有利地利用电化学检测的方法，特别是将氧化还原循环与单克隆抗体标记物结合以产生半抗体。连接a-VEGFmAb的两条重链的二硫键可被选择性地切割以产生两个a-VEGF mhAb,所述a-VEGF mhAb具有完整的结合位点和反应性巯基并可以以位点特异的方式共轭结合到VEGF。由单个VEGF mAb产生两个半抗体的目的是降低所述固定的a-VEGF mhAb的Fab和VEGF之间的结合亲和力水平。该结合亲和力水平小于报道的VEGF与a-VEGF mAb键之间的结合亲和力水平(Kd=3. 4±0· 9ηΜ)。本发明进一步的目的是利用a-VEGF mhAb半抗体分子，因为a_VEGF mhAb和VEGF结合亲和力低于所述生物传感器表面形成中所产生的所有其他键的结合亲和力。因为aVEGF mhAb和VEGF之间的键的亲和力具有高特异性但是其亲和力弱于本发明中呈现的其他键，所以所述VEGF分子可从它们与aVEGF mhAb分子的键“释放”以使得所述生物传感器表面可被重复使用多次。该“释放”是通过在所述生物传感器板上引入小的电流以提供能源，并通过本发明公开的压电微流体泵产生的流体流而产生的。另一项开发是制备具有马来酰亚胺封端的自组装单层(SAM)的硅表面，使得所述a-VEGF mhAb可直接结合到该表面并且以方向特异的方式固定到所述Si02表面。该化学反应将保持所述a-VEGF mhAb的抗原结合位点朝向外部。所述a-VEGF mhAb在所述底物上的涂敷密度将通过制备过程中hAb的浓度确定。本发明的一个实施方案的目的是产生具有电极性的传感器，目的是自然地吸引VEGF分子本身带的负电荷，同时进一步调整所述电路的阈电压。所述新的传感器应该用优选涂敷有P-Si底物的绝缘电极构建，以帮助将所述VEGF分子带到所述电极的表面并增强所述VEGF分子和抗体之间的亲和力。本发明的另一个目的是能够反转所述电极性，目的是从所述固定的a-VEGF mhAb排斥并释放VEGF。所述电极性产生的力使得它可以克服VEGF与a-VEGF mhAb之间由于静电键、氢键、范德华力、疏水作用力和芳香π键的结合，但小于多种连接分子之间的共价键。本发明实施方案之一的另一个目的是一种具有并联电极阵列的装置，所述并联电极阵列以互相交叉模式排列，以最大化VEGF杂交的表面面积并提高检测敏感度。本发明的多个实施方案涉及用于多重生物测定的信号放大方法，所述方法使用至少一个装置来监测所述芯片的矩阵阵列位置上的VEGF分子杂交。所述装置应装配有计算装置，目的是在所述时间范围内提供传感输出，从而检测、报告并形成稳态环以指导医药剂的治疗性介入。所述装置周期性地`测量、储存并报告传感输出电值，所述电值与VEGF分子和固定的a-VEGF mhAb的杂交有关。本发明的一个实施方案是体内检测VEGF分子，这不仅提供了肿瘤负荷的当前状态信息，而且VEGF分子随时间的趋势可用于反映化学治疗剂和生物学反应调节剂(BRM)的效力，用于肿瘤负荷降低和消除的目的。本发明一个实施方案的一个目标是通过无线电设备实时监测与肿瘤负荷的当前状态信息相关的VEGF检测传感输出。所述装置应装配有被批准用于经皮无线电频率(RF)通信的医学植入式通信服务(MICS)无线电设备。本发明的另一个实施方案是用泵控制所述VEGF分子在所述芯片的矩阵阵列位置上的杂交。在本发明至少一个实施方案的排列上存在至少一个用于控制液体流速的装置及相关控制装置。为此具体目的，在至少一个实施方案中，所述传感器芯片被连接到包括精密泵的微流体系统。所述液体流控制的一个具体能力是允许在检测完成后将所述去杂交的VEGF分子从所述电极冲掉，这使得所述传感器可重复使用。
附图——其中同样的参考数字在所有各个视图中是指相同或功能相似的元件并且其被纳入说明书中并形成说明书的一部分——进一步举例说明本发明，并且与具体实施方式
一起用于解释本发明的原理。图1是所述装置的正投影截面图，含所述电子检测模块的示意图。图1A是本发明一个实施方案的电学示意图，描绘来自所述电容器阵列的等效电极-电解质节点的一个单元。图2是VEGF检测器的电容排列的横截面等轴视图。图2A是电容VEGF传感器的正投影俯视图。图3描绘了带有组成型杂交元件的VEGF传感器。图3A描绘了被VEGF单克隆半抗体(a-VEGF mhAb)功能化之前的马来酰亚胺封端的 SAM。图3B示出了将VEGF单克隆抗体(a_VEGF mAb)分裂成两个半抗体的选择性还原过程。图3C示出了包括马来酰亚胺-巯基共轭以产生a-VEGF mhAb功能化的SiO2底物的自发反应。图4是所述生物传感器电容器阵列的横截面图，其矩阵阵列设计包括包围腔(chamber containment)。图4A为所述电容器矩阵阵列的示意图，其描绘了所述等效电路。图5示出了配置在送递装置框图内的VEGF检测器的设计。图5A是优选实施方案的示意性框图——生物传感器被纳入作为检测、分析和报告系统的一部分。图5B是使用所述生物传感器的优选实施方案时形成的稳态环的示意性框图。定义本文使用的所有技术术语、科学术语或其他术语具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。提供下述定义意在阐明或解释所定义术语的普通含义，而不应解释为限制或缩小这些术语含义的范围。虽然与本文描述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但将还是描述所述方法、装置和材料。本文提及的所有出版物通过引用的方式纳入本文，目的是为了描述并公开所述出版物中报告的可能用于本发明的材料和方法。本文中任何内容都不能被解释为承认本发明由于在先发明而没有资格早于这些公开物。本文使用的“人源化VEGF单克隆半抗体”是指通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)将连接两条重链的二硫键切割后所产生的两个单克隆抗体片段。所产生的半抗体(hAb)具有完整的结合位点和反应性巯基。这些hAb保留了它们的靶向能力，但其尺寸较小，可以以位点特异的方式共轭以及与所述马来酰亚胺封端的Si02表面反应。本文使用的“ VEGF-A和VEGF单克隆抗体杂交”是指VEGFl与VEGF单克隆抗体11杂交的过程，是通过VEGF-A和VEGF单克隆半抗体之间的分子识别来实现的。所述人源化VEGF单克隆抗体(rhuMab VEGF;贝伐单抗；Avastin神)与VEGF结合的亲和力与原始抗体与VEGF结合的亲和力(Kd约O. 5nM)非常相似。与其小鼠对应物相同，贝伐单抗结合并中和所有的人VEGF-A同种型和生物活性的蛋白水解片段。贝伐单抗的结合表位已通过Fab-配体复合体的晶体结构分析被确定。该分析预测人VEGF中的Gly88对于结合贝伐单抗是必需的，并且该残基还构成贝伐单抗结合的种特异性的基础，因为在小鼠和大鼠中VEGF的相应位点发现的是丝氨酸残基。贝伐单抗不中和VEGF基因家族的其他成员例如VEGF-B或VEGF-C。贝伐单抗在几个物种中的药物代谢动力学性质此前已有记载，并且其与典型的人源化单克隆抗体一致。贝伐单抗在人体内的终末半衰期是17-21天。重要地，迄今为止进行的任何临床试验中都没有发现对贝伐单抗的抗体反应证据，这验证了其人源化的成功。本文使用的“VEGF单克隆半抗体固定”是指所述半抗体结合到所述表面的过程，其中马来酰亚胺-巯基偶联快速并自发地发生。所述马来酰亚胺封端的Si02底物会与抗VEGF hAb溶液以需要的浓度孵育2小时。所述hAb会以方向特异的方式自发地偶联到所述底物表面。如图3所示，抗原结合位点将保持向外。所述VEGF hAb的浓度将被用于控制所述底物上的Mb涂敷密度。孵育后，用PBS缓冲液冲洗所述底物以除去所有未共轭的化合物。本文使用的“表征VEGF半抗体固定”是指通过使用荧光测量来确认并定量所述偶联反应的过程。在TCEP还原之前，用Alex-488荧光团共价标记CEA mAb。为确认所保留的荧光是由于马来酰亚胺-巯基共轭而不是VEGF hAb或未切割的mAb的非特异性吸收，使用完整的mAb作为阴性对照以确保用PBS缓冲液冲洗之后mAB不会吸收并粘附到所述底物。然后，VEGF蛋白将被用 于进一步评估所述固定的VEGF hAb的结合敏感度和特异性。本文使用的“表面修饰”是指制备Si02表面14的过程，其为，首先用piranha溶液(H2S04:H202=3:1 (v/v))处理20min，然后用蒸馏水冲洗以完全清洁所述表面。然后，将所述底物浸入50%乙醇溶液(Et0H:H20=50:50(V/V) )2小时以完全水合所述表面。然后，再用piranha溶液处理所述水合表面20min,并用蒸懼水洗漆。所述整个过程将导致Si02表面的完全羟基化以形成氢氧化硅(SiOH)表面。用氮气干燥所得的SiOH底物并将其保存在-20°C用于后续使用。然后，在SiOH底物上合成马来酰亚胺封端的SAM。简单地通过浸溃过程，用1M3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液处理所述SiOH底物lhr。这将形成胺(-NH2)封端的自组装单层(SAM)。该-NH2封端的SAM能够容易地与活化的羧酸反应，用于进一步修饰所述表面。在优选的实施方案中，将所述-NH2封端的SAM与IM琥珀酰亚胺基_4_(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)的二甲基亚砜(DMSO)溶液孵育2hr，然后用蒸馏水洗去未反应的化合物。该过程将导致形成具有马来酰亚胺封端的功能性表面基团的SAM。然后，这些马来酰亚胺封端的SAM可自发地与具有一个或多个游离的巯基官能团的任何类型的生物分子(例如蛋白质、肽、半抗体和其他抗体片段)反应，并因此将所述生物分子固定到所述底物表面上。为制备清洁且高质量的SAM，需要用蒸馏水洗涤所形成的SAM并将其在连续的氮气流下干燥，然后储存在_20°C用于后续使用。将所述表面在室温下以MeOH/HCl(1/1)清洁30分钟，以超纯水(Mill1-Q Gradient A1018. 2ΜΩ )冲洗，并以氩气干燥。在下一步骤中，在气相或液相中通过使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的硅烷化步骤将所述表面用NH2基团修饰。为了进行气相硅烷化，将所述芯片置于含有几滴甲硅烷的干燥器中。将所述干燥器密封并加热至超过100°C，使所述芯片在低压(约lmbar)下与甲硅烷蒸气反应1-2小时。本文使用的“表面表征”是指例如原子力显微镜(AFM)、扫描电镜(SEM)和X-射线光电子能谱(XPS)的方法。可通过使用傅里叶变换红外(FT-1R)光谱法监测形成SAM的每一步的证据，该方法将提供所述SAM中官能团的特征信号。本文使用的“靶分析物”是指测试样品中有待于使用本发明检测的物质。所述分析物可以是存在其天然捕获剂(例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等)或可制备其捕获剂的任何物质，并且在测定中所述靶分析物可结合一个或多个捕获剂。“靶分析物”还包括任何抗原性物质、抗体及其结合物。所述靶分析物可包括蛋白、肽、氨基酸、碳水化合物、激素、甾体、维生素、药物(包括出于治疗目的给予的药物以及出于非法目的给予的药物)、细菌、病毒和任意上述物质的代谢物或抗体。本文使用的“靶分析物类似物”是指可与分析物捕获剂交叉反应的物质，尽管其反应程度可能较所述靶分析物本身更强或更弱。所述靶分析物类似物可包括修饰的靶分析物以及所述靶分析物分子的片段部分或合成部分，只要所述靶分析物类似物具有至少一个与所述兴趣靶分析物相同的表位位点。本文使用的“捕获剂”是能够结合靶分析物或靶试剂的分子或化合物，其可直接或间接附着于基本上为固体的材料。所述捕获剂可以是存在其天然靶分析物(例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等)或可制备其靶分析物的任何物质，并且在测定中所述捕获剂可结合一个或多个祀分析物。本文使用的“测试样品”是指含有有待于使用本发明检测和测定的靶分析物的样品。除所述靶分析物以外，所述检测样品还可含有其他组分，可具有液体或固体的物理属性，并可为任意大小或体积，所述测试样品包括例如移动的液体流。所述测试样品可含有除所述靶分析物以外的任何物质，只要所述其他物质不干扰所述靶分析物与所述捕获剂的结合或第一结合成员与第二结合成员的特异性结合。测试样品的实例包括但不限于血清、血浆、痰、精液、尿、其他体液，以及环境样本例如地下水或废水、土壤浸出物、空气和杀虫剂残留物。本文使用的“方法和试剂”(出于分析和测试本发明装置的目的，发明人采用并使用了 HS Lee et al.，2008文章中提供的/[目息，目的是鉴定所述方法)是指试剂,例如3_氨基丙基二乙氧基硅烷(APDES)、琥珀酐(SA)、碳酸钠(SC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂、十二烷基硫酸钠(SDS)U-乙基-3-[3-( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(硫代 _NHS)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl) (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO)。人VEGF165 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA)作为检测蛋白。据报道，编码人VEGF165的cDNA被亚克隆至表达载体中并在酵母中表达。据报道，重组人VEGF165同型二聚体被进一步纯化并保存在含有O. 1%BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7. 4)中。本文使用的“合成VEGF单克隆抗体”是指通过化学过程将人源化的VEGF抗体切成两半。摩尔量超过所述VEGF单克隆抗体(mAb)摩尔浓度3倍的三(2-羧乙基)膦(TCEP)将被用作还原剂。在室温下，将所述TCEP还原剂与所述VEGF mAb在PBS缓冲液中混合2hr。所述TCEP将选择性地切割连接mAB的两条重链的二硫键，并产生两个VEGF半抗体(hAb)。所得的hAb具有完整的结合位点和反应性巯基。这些hAb保留了它们的靶向能力，但其大小较小且能够以位点特异的方式共轭。在本研究中，所得的hAb可直接(未经预先纯化)用于与所述马来酰亚胺封端的Si02表面反应。本文使用的“表征VEGF单克隆半抗体”是指确定所合成的半抗体。可使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)优化所述选择性还原过程。为确认hAb的产生并优化所述选择性还原过程，将VEGF mAb与不同摩尔量的过量TCEP混合2hr，然后分离并可视化。具体地，使用NovexSureLockXcell电泳系统(Invitrogen)在Tris-乙酸电泳缓冲液中在SDS-PAGE3-8%Tris-乙酸10孔迷你凝胶上分离所述切割的mAb。所述样品将在150V电泳Ihr,将所产生的聚丙烯酰胺凝胶在SimplyBlueTM (Invitrogen)中过夜染色以可视化。为定量所述hAb的浓度，可将Alexa Fluor488荧光探针预共轭到所述mAb，然后进行还原。然后，可测量来自hAb的荧光强度，并与标准曲线化比较。本文使用的“合成的VEGF半抗体的结合亲和力”是指使用表面等离子共振(SPR)分析(Kang et al.，2008)来分析两个生物分子之间的相互作用。本文使用的“稳态控制机制”是指这样的概念，即所述生物传感器测量变量的至少三个相互依赖的组件是被调节的受体是传感组件，杂交的VEGF分子改变所述电容负荷，因此监测环境改变并对其作出反应。所述受体感受刺激，其发送信息到控制电路——设定变量维持范围的组件。所述控制电路决定对所述刺激的合适反应。然后，所述控制电路发送信号至接收来自所述控制电路的信号的效应器。在接收到所述信号后，发生变化，以通过用正反馈增强所述信号或者用负反馈削弱所需信号来校正偏差。本文使用的“血管发生”是指包括从已存在的血管生长新血管的生理过程。尽管有一些对术语的争论，但是血管发生是用于自发血管形成的术语，内填作用(intussusception)是用于通过分裂已存在的血管而形成新血管的术语。本文使用的“信号转导”是指将对细胞的机械/化学刺激转变为特异性细胞反应的机制。信号转导始于到达接收器的信号，终于细胞功能改变。本文使用的“酪氨酸激酶”是指可将ATP中的磷酸基团转移到蛋白的酪氨酸残基的酶。酪氨酸激酶是更大类的蛋白激酶的亚组。通过激酶来磷酸化蛋白质是信号转导中的重要机制，用于调节酶活性。本文使用的“微电子机械系统(MEMS)”是指非常小的技术，其在纳米尺度合并到纳米电子机械系统(NEMS)和纳米技术。MEMS由介于I微米到100微米(即0. 00lmm到0.1mm)大小的组件组成，并且MEMS装置的大小通常介于20微米(百万分之二十米)到I毫米。它们通常由处理数据的中枢单元、微处理器和数个与外部相互作用的组件(例如微传感器)组成。本文使用的“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物，通常具有20个或更少的碱基。虽然它们可由更长的片段通过键断裂而形成，但是现在更常见的是通过聚合单个的核苷酸前体来合成。自动化合成仪可合成具有多达160到200个碱基的寡核苷酸。本文使用的“凝集素”是指对自身糖基具有高度特异性的糖结合蛋白。它们在涉及细胞和蛋白质的生物识别现象中发挥作用。例如，一些病毒在感染期间使用凝集素将其自身附着到宿主生物的细胞。本文使用的“适体”是指结合到具体靶分子的寡核酸分子或肽分子。适体通常通过从大的随机序列库中选择它们而产生，但是天然适体也存在于核糖开关中。适体可用于基础研究和作为大分子药物用于临床目的。适体可在其靶分子的存在下与核酶结合以自切害I]。这些化合物分子具有其他的研究、工业和临床用途。本文使用的“肽”是指由α-氨基酸以确定的顺序连接而形成的短的聚合物。一个氨基酸残基和下一个氨基酸残基之间的连接称为酰胺键或肽键。
本文使用的“共振”是指系统在某些频率下比在其他频率下以更大的振幅振动的趋势。这些频率被称为该系统的共振频率。在这些频率下，甚至小的周期性驱动力可产生大振幅的振动。本文使用的“石英晶体微天平(QCM)”是指通过测量石英晶体共振器频率的改变来测量每单位面积的质量的装置。由于在共鸣器表面的氧化物增加/下降或膜沉积，加入或移除小的质量可干扰所述共振。本文使用的“酶”是指催化化学反应(即增加化学反应速率)的蛋白质。在酶促反应中，所述过程起始时的分子称为底物，所述酶将它们转变成不同的分子，称为产物。生物细胞中几乎所有过程都需要酶以在显著的速率进行。由于酶对其底物具有选择性且在许多可能的反应中只加速某些反应，细胞中制备的酶集合决定在该细胞中发生哪些代谢途径。本文使用的“表位”是指抗原中被免疫系统(具体是抗体、B细胞或T细胞)识别的部分。抗体中识别所述表位的部分称为互补位。虽然通常认为表位源自非自身蛋白，但是可被识别的源自宿主的序列也被分类为表位。本文使用的“自组装单层(SAM)”是指两亲性分子的有组织的层，其中所述两亲性分子的一个末端——“头部基团”——显示出对底物的特异性亲和力。SAM的终端还包含具有官能团的尾部。SAM是通过亲水的“头部基团”化学吸附到来自蒸汽或液相的底物，然后通过疏水“尾部基团”的缓慢二维组织而形成的。最初，被吸附的分子形成无序的分子团或者形成“下沉相(lying down phase)”,经数小时的时间，开始在所述底物表面形成晶质结构或半晶质结构。所述亲水性“头部基团”在所述底物上组装在一起，而疏水性的尾部基团组装成远离所述底物。密集的分子区域成核并生长直到所述底物的表面被单个的单层覆
至JHL ο本文使用的“生物学反应调节剂(BRM)”是指人体天然产生的物质，以及科学家可在实验室中制造的物质。这些物质激发身体对感染的反应。这些物质的一些被用于治疗关节炎、癌症和一些其他疾病。免疫治疗使用BRM来增强免疫系统活性以增加身体对癌症的天然防御机制，而用于类风湿性关节炎的BRM目的是减少炎症。本文使用的“医学植入物通信服务(MICS)”是指使用介于402MHz和405MHz之间的频带与医学植入物通信的技术规范的名称。其允许与起搏器或其他电子植入物的双向无线电通信。其最大发射功率非常低，EIRP=25微瓦，目的是减少与其他使用相同频带的用户相互干扰的风险。在任何一个时刻所使用的最大带宽是300kHz，这使其成为一个低比特率的系统(与WiFi或蓝牙相比)。与之前使用的需要外部收发器以接触患者皮肤的诱发技术相比，其主要优势为更具灵活性。MICS的有效范围为数米。本文使用的“电容器”是指由被电介质(绝缘体)分开的导体对组成的无源电子组件。当所述导体之间存在电势差(电压)时，在所述电介质中呈现电场。所述电场储存能量，并在所述导体之间产生机械力。当在大面积的导体之间有窄的间隔时，所述效应最大，因此电容器的导体通常被称为板。
具体实施例方式图1是所述装置的正投影截面视图，含所述电子检测模块的示意图。生物传感器有其绝缘罩100。绝缘罩100，配置有流体入口 101和流体出口 102。装置100包括形成电容性板103的涂有VEGF传感元件的电极阵列并形成VEGF电容检测器电路，电容性板103与电子模块200交界。所述VEGF电容检测器电路被连接到运算放大器(OpAmp)缓冲器201，并且连接到电流电压放大器202，然后连接到OpAmp集成电路203，包括偏置电阻器204、205和电容器206。输入电压Vin207、电流输出1209和V1209代表杂交后各自的电势和电路200中所得的电容变化的积分值。所述电极被设计成互相交叉模式，以在小体积中最大化所述传感器的表面积。图1A是图1的一个实施方案的示意图，描绘形成电容器阵列110的等效电极-电解质节点的一个单元。电路图110可表示为通过电阻105和其电容负载Cal06描绘电极a/溶液界面的电阻(Ra)。所述传感器本体100中的溶液的电阻由(Rs) 107表示，而电极B/溶液界面的电阻表示为(Rb) 108，其电容负载为(Cb) 109。形成生物传感器110的所述阵列电容器的一节点单元与电容检测器电路200交界。方波发生器产生的输入(Vin)信号207被0pAmp201缓冲，并产生电流208，电流208代表VEGF与a-VEGF mhAb结合杂交后所述电路中各自的衰减值札204。在等效电路节点110所示的由于VEGF分子与a-VEGF mhAb结合产生电容改变之后，电流208耦合到所述OpAmp (充当电流电压放大器202)，以指示电容单元110各自的积分值。所述信号被0pAmp203和与之相连的电阻器205、电容器206进一步整合，产生输出电压(Vtjut) 210。图2是VEGF检测器的电容排列的横截面等轴视图。该图描绘了图1和图1A标示的元件，其进一步解释并阐明了等效电子模块110和支配VEGF检测器性能的传感原理之间的关系。所述VEGF生物传感器基于电化学方法，据此使用具有几何形状Gx的电容器，目的是用以下述方程I中的电介质(ε r)作为变量，并且还利用无标记检测技术(基于生物修饰的电极/溶液界面的电容测量值)。传感器100的功能可由所述传感器将成股的a-VEGFmhAbll有效固定在传导电极表面16的能力来最好地定义。所述电解质溶液(电极之间的介质)是体液，例如脑脊液3。电极16用p-Si底物15涂敷，以增强VEGFl和a-VEGF mhAbll之间的亲和力。绝缘层(例如二氧化硅)14保护带有正电荷的底物15，带正电的底物15经杂交物质(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)13与连接体(琥珀酰亚胺基-4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)12键合。然后，所述a-VEGF mhAb通过与所述连接体键合而被固定。由于固定a-VEGF mhAb造成的总表面厚度增加是约10nm。当将VEGF蛋白I引入至体液3中时，它们结合到涂敷有a-VEGF mhAb的电极表面。所述VEGF分子和a-VEGF mhAb的结合可改变所述电极-溶液界面的阻抗(即主要是其电容)。当所述VEGF分子在其抗-VEGF片段(抗原结合(Fab)域界面10)与a-VEGF mhAb杂交时，总厚度是约200nm。所述电化学单元110的电容106和109可以如方程I中所示模拟。CceIi 一 Cgeometry + Ceiectrode/soIution W其中，Cceometry是由所述传感器的几何形状产生的电容，如方程2所示。 Cgeometry = εΓ ε0 A/d 2)其中，ε r是由VEGF分子、体液、a-VEGF mhAb、琥拍酸酐连接体(Succiniclinker)、氨基杂交物质、SiO2绝缘体和ρ-Si底物组成的介质的组合相对电容率(杂交之前所述组合介质的介电值的介电常数，〃 ε r="[( ε山，(ε r)2, ... ( ε r)n]，并考虑总电容值“ Ccell ”) ； ε。是自由空间的电容率(8. 854X10_12F/m) ;A是由宽52和长53的电极板103所得出的总面积；d是板103之间的间距51。选择A和d的值，使得所述电容变化可以用如下技术有效地测量，但通过传感器单元100的体液环流不受限制。由于VEGF结合时所述表面的厚度是约200nm的事实，所述间距可以小至5000nm，而没有VEGF杂交所导致的限制所述流的风险。电极板103以互相交叉的手指模式排列，以在小体积中最大化有效的表面积。体液3经入口 101流入所述传感器单元，并流过出口 102，可能连接到图5将进一步描述的栗和阀部件。Celectrode7solution是两个电极的每一个和所述溶液之间形成的双层电容。所述双层电容可以如下述方程3所示模拟。下面方程9和10中电极A和电极B的CeleetMde/s()luti()n分别由Ca和Cb表示。
权利要求
1.一种VEGF单克隆半抗体(a-VEGF mhAb)探针复合体，其在检测器中用于检测靶VEGF分子的存在，所述探针复合体包括 所述检测器中的电极；和 所述电极上的a-VEGF mhAb，其能够结合到指示物VEGF蛋白并且能够固定所述指示物VEGF蛋白，使得可通过所述检测器检测靶VEGF分子。
2.要求I的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述a-VEGF mhAb能够高度特异性地结合到VEGF蛋白，并且还包括偶联到所述电极的电路，以通过向所述电极施加电流来选择性地释放与所述VEGF蛋白的结合，从而使得所述探针复合体可重复使用。
3.权利要求1的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述a-VEGF mhAb可高度特异性地结合到VEGF蛋白，并且还包括流体性线路，以通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述结合。
4.权利要求2的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述a-VEGF mhAb可高度特异性地结合到VEGF蛋白，并且还包括流体性线路，以通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述结合。
5.权利要求4的a-VEGFmhAb探针复合体，其与流体源组合，其中所述流体性线路通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述结合，所述流体性线路包括压电泵，所述压电泵具有流体性地偶联到所述流体源的输入和流体性地偶联到所述电极的输出，所述压电泵和电极被排列和配置以使得可通过所述压电泵提供的流体流来流体性冲洗所述电极。
6.权利要求1的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述a-VEGF mhAb由化学分裂的Ava stini)组成。
7.权利要求1的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述a-VEGF mhAb由化学分裂的人源化单克隆抗体VEGF (rhuMab VEGF;贝伐单抗)组成。
8.权利要求1的a-VEGFmhAb探针复合体，其中所述检测器包括硅底物，并且还包括由附着到马来酰亚胺封端的自组装单层(m-SAM)的a-VEGF mhAB组成的连接体,所述m_SAM通过以氨基硅烷化而键合到所述硅底物。
9.一种靶的传感器阵列，其包括 底物； 多个绝缘的微机械电容器，其至少一部分上放置所述底物，所述电容器以互相交叉模式排列； 附着到所述多个电容器的识别基团，所述识别基团特异性地结合到所述靶； 检测器电路，用于传感所述多个电容器；和 用于再配置所述识别基团以使得所述传感器阵列可重复使用的装置。
10.权利要求9的传感器阵列，其中所述多个电容器中的至少一个具有多个基面，所述多个基面的每一个具有附着到所述基面的识别基团，并且还包括偶联到所述多个基面的电路，以通过向所述多个电容器施加电流以选择性地释放与所述靶的结合并从而使得所述传感器阵列可重复使用。
11.权利要求9的传感器阵列，还包括流体性线路以通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述识别基团的结合。
12.权利要求11的传感器阵列，还包括流体性线路以通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述识别基团的结合。
13.权利要求12的传感器阵列，其与流体源组合，并且其中所述流体性线路通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述识别基团的结合，所述流体性线路包括压电泵，所述压电泵具有流体性地偶联到所述流体源的输入和流体性地偶联到所述多个电容器的输出，所述压电泵和所述多个电容器被排列和配置以使得可通过所述压电泵提供的流体流来流体性冲洗所述电极。
14.权利要求9的传感器阵列，其中所述识别基团由化学分裂的组成。
15.权利要求9的传感器阵列，其中所述识别基团由化学分裂的人源化单克隆抗体VEGF (rhuMab VEGF;贝伐单抗)组成。
16.权利要求9的传感器阵列，其中所述识别基团包括a-VEGFmhAb，所述a-VEGF mhAb能够结合到指示物VEGF蛋白并且能够将所述指示物VEGF蛋白固定到所述电容器以使得可通过所述检测器检测靶VEGF分子。
17.权利要求9的传感器阵列，还包括偶联到所述传感器阵列的微控制器，其中所述多个电容器的至少一个具有结合到所述靶的识别基团，并且所述检测器检测至少一个电容器上所述靶的存在并将对所述靶的检测与所述微控制器通信。
18.权利要求16的传感器阵列，还包括置于至少一个电容器的至少一部分上的连接体，以将a-VEGF mhAb固定在所述至少一个电容器上。
19.权利要求18的传感器阵列，其中所述连接体包括琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯和杂交物质(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)。
20.一个用于检测流体中a-VEGF mhAb的靶的系统，其包括 传感器，所述传感器包括 底物； 密封的微机械网孔电容器阵列，在所述阵列的至少一部分上放置所述底物； 附着到所述底物的识别基团，所述识别基团选择性地结合到所述a-VEGF mhAb的靶；和 检测器，用于通过所述识别基团检测所述a-VEGF mhAb的靶的结合； 送递系统，用于将用于分析的流体送递到所述传感器；和 用于再配置所述识别基团的装置，以使得选择性释放所述靶以使得所述传感器阵列可重复使用。
21.权利要求20的系统，其中所述送递系统包括输入端口、连接到所述输入端口用于所述流体的容器、以及连接到所述容器的输出端口，所述底物的至少一部分暴露于所述容器中的流体。
22.权利要求20的系统，其中所述电容器阵列具有预先确定的电容，所述电容被选择以使靶结合所述电容器阵列最大量的功能化表面面积，并且其中所述送递系统的尺寸和结构被排列和配置为所述预先确定的电容的函数以提供穿过所述传感器的无限制流体流动。
23.权利要求20的系统，其中所述用于再配置所述识别基团以选择性释放所述靶以使得所述传感器阵列可重复使用的装置，包括偶联到所述多个基面的电路，以通过施加到所述电容器阵列的电流来选择性地释放与所述靶的结合并从而使得所述传感器阵列可重复使用，或者包括流体性线路，以通过使用所述流体性线路提供的流体流来选择性地释放所述结合。
24.—种体内实时检测患者流体中VEGF的方法，包括 化学分裂人源化单克隆抗体VEGF (rhuMab VEGF;贝伐单抗)； 将所述分裂的人源化单克隆抗体VEGF附着到传感器中的电容器表面； 使所述传感器暴露于待分析的包含VEGF的流体，所述分析使用分裂的人源化单克隆抗体VEGF ； 通过使所述VEGF结合到所述分裂的人源化单克隆抗体VEGF，将所述VEGF结合到所述传感器内的测量表面，以形成作为分析物分子的配体杂交的靶VEGF ;和 检测所述分析物分子以测量所述杂交的靶VEGF ;和 从所述传感器产生可指示所测量的杂交靶VEGF的输出。
25.权利要求24的方法，其中化学分裂人源化单克隆抗体VEGF(rhuMabVEGF;贝伐单抗)包括化学分裂Avastin· 、
26.权利要求24的方法，其中检测所述分析物分子包括，通过传感器阻抗大小的变化或者传感器阻抗改变的时间速率检测所述传感器的电容值变化。
27.权利要求24的方法，其中化学分裂人源化单克隆抗体VEGF(rhuMabVEGF;贝伐单抗)包括通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂以选择性地切割连接mAB的两条重链的二硫键以产生两个VEGF半抗体(mhAb)而将VEGF单克隆抗体(a-VEGF mAb)分裂为两个半抗体。
28.权利要求24的方法，还包括依据患者体液中VEGF的实时体内检测来提供至少一种医疗剂的有指导的治疗介入。
29.—种对表面进行表面修饰方法,包括 使所述表面水合以形成氢氧化物表面； 使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液在所述表面上合成马来酰亚胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM ;和 将所述-NH2封端的SAM与琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)溶液孵育，并洗去未反应的化合物以形成具有马来酰亚胺封端的功能性表面基团的SAM。
30.权利要求29的方法，其中使所述表面水合以形成氢氧化物表面包括使所述表面水合以形成氢氧化娃(SiOH)表面。
31.权利要求30的方法，其中使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液在所述表面上合成马来酰亚胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM包括，使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在所述SiOH表面上合成马来酰亚胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM，所述-NH2封端的SAM能够容易地与活化的羧酸反应，用于进一步修饰所述表面。
32.权利要求30的方法，其中将-NH2封端的SAM与琥珀酰亚胺基_4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)溶液孵育，并洗去未反应的化合物以形成具有马来酰亚胺封端的功能性表面基团的SAM包括，将-NH2封端的SAM与琥珀酰亚胺基_4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)的二甲基亚砜(DMSO)溶液孵育，并用蒸馏水洗去未反应的化合物以形成具有马来酰亚胺封端的功能性表面基团的SAM，其中马来酰亚胺封端的SAM能够与具有一个或多个游离巯基官能团的生物分子——例如蛋白质、肽、半抗体和其他抗体片段一自发地反应，并因而将所述生物分子固定到所述表面上。
33.权利要求29的方法，还包括用蒸馏水洗涤所述水合的SAM，在持续的氮气流中干燥所述洗涤的SAM，并在约_20°C储存所述干燥的SAM。
34.权利要求33的方法，还包括用MeOH/HCl(1/1)在室温清洁所述储存的SAM，用超纯水冲洗所述清洁的SAM，以氩干燥所冲洗的SAM，通过以3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)在气相或液相中硅烷化来以NH2基团修饰所述SAM。
35.权利要求29的方法，其中使所述表面水合以形成氢氧化硅(SiOH)表面，包括 用piranha溶液(!12504:!1202=3:1 0八))处理所述表面； 用蒸馏水冲洗所述处理的表面以清洁所述表面； 将所述表面浸入50%乙醇溶液(Et0H:H20=50:50(V/V))以使所述表面水合； 再次用piranha溶液处理所述表面一段时间；和 用蒸馏水洗涤所述处理的表面。
36.权利要求29的方法，其中在所述SiOH表面上合成马来酰亚胺封端的SAM包括，通过浸溃过程以3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液处理所述SiOH表面。
37.一种方法，包括将半抗体固定到底物表面上，在所述底物表面上捕获抗原，和电化学地检测所述捕获的抗原。
38.一种方法，包括在底物上制造固定的半抗体的自组装单层，和电化学地检测置于所述底物上的流体中的抗原，所述底物具有固定的半抗体的自组装单层。
全文摘要
用于检测血管内皮生长因子(VEGF)杂交的生物传感器使用并联电容器的阵列来检测循环的VEGF与固定的VEGF单克隆半抗体(a-VEGF mhAb)的电化学结合。结合a-VEGF mhAb可调节电路的阈值电压，从而改变所述电路的阻抗。涂敷有p-Si底物的电极可增强所述VEGF分子之间的亲和力。流体单元送递VEGF样品到所述芯片的活性表面上。以互相交叉模式排列的并联电容器的阵列可检测所述流体中的VEGF。所述检测器提供精确测量的和可计量速率的体内VEGF分子的变化，提供用于测量所述肿瘤对送递的化学治疗剂和生物反应调节剂(BRM)的反应的实时反馈，目的是确定肿瘤负荷和化学治疗的效力，作为治疗的稳态环的一部分。
文档编号G01N27/327GK103069270SQ201180040585
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者叶赫沙·沙查尔, 托马斯·陈, 温斯顿·吴, 布雷特·乔丹, 海尔文·陈, 帕拉丁·卢波夫, 凯尔·齐默曼 申请人:药物代谢动力公司, 叶赫沙·沙查尔, 托马斯·陈, 温斯顿·吴, 布雷特·乔丹, 海尔文·陈, 帕拉丁·卢波夫, 凯尔·齐默曼