专利名称：贝伐单抗组合疗法用于治疗乳腺癌的血浆生物标志物的制作方法
贝伐单抗组合疗法用于治疗乳腺癌的血浆生物标志物本发明提供通过将贝伐单抗(bevacizumab) (Avasl ι_ι_.Κ_ )添加至化疗方案,用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。特别是，本发明提供改进治疗效果的方法，其中治疗效果为患者的无进展存活。本发明进一步提供用于评估患者对与化疗方案组合的贝伐单抗(Avastk )的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。因而，本发明涉及鉴定和选择乳腺癌，或局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌中与对与化疗方案，诸如多西他赛(docetaxel)疗法组合的血管发生抑制剂，例如贝伐单抗(AvasiiivH )的敏感性或响应性有关的生物标志物。在这方面,本发明涉及相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中建立的对照，VEGFA, VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达概况用于鉴定对将血管发生抑制齐U，例如贝伐单抗(Avastin )添加至标准化疗敏感或响应的患者的用途。本发明进一步涉及通过将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗(Avastin )添加至标准化疗,例如多西他赛疗法，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的治疗效果，特别是无进展存活的方法，其通过相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中的对照，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达水平来进行。本发明进一步提供用于鉴定依照本发明的方法确定和定义的对血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(AvasUiVK.:)敏感或响应的患者的试剂盒和组合物。血管发生是癌症形成所必需的，不仅调节原发性肿瘤尺寸和生长，而且影响侵入性和转移性潜力。因而，作为定向抗癌疗法的潜在靶，已经调查了介导血管发生过程的机制。在血管发生调控剂研究的早期，发现血管内皮生长因子(VEGF)信号传导途径优先调节多种癌症类型中的血管发生活性。这种因子经由VEGF受体2 (VEGFR-2)，即介导发芽式血管发生的主要VEGF信号传导受体发信号。已经开发了多种治疗剂在多个点调控这种途径。这些疗法包括例如贝伐单抗、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)和瓦他拉尼(vatalanib)。虽然血管发生抑制剂在临床中的使用已经显示出成功，但是并非所有患者都响应或未能完全响应血管发生抑制剂疗法。不知道此类不完全响应背后的机制。因此，越来越需要鉴定对抗血管发生癌症疗法敏感或响应的患者亚组。虽然知道多种血管发生抑制剂，但是最突出的血管发生抑制剂是贝伐单抗(Avaslm起)。贝伐单抗是一种特异性结合并阻断VEGF (血管内皮生长因子)的生物学效应的重组人源化单克隆IgGl抗体。 VEGF是肿瘤血管发生(肿瘤生长和转移(即肿瘤扩散至身体其它部分)所需要的一个必要过程)的一种关键驱动物。Avastin 在欧洲批准用于治疗晚期阶段的四类常见癌症:结肠直肠癌，腺乳癌，非小细胞肺癌(NSCLC)和肾癌，它们每年总共引起超过250万例死亡。在美国，Avastir^是第一种得到FDA批准的抗血管发生疗法，而且它现在批准用于治疗五类肿瘤:结肠直肠癌，非小细胞肺癌，腺乳癌，脑(成胶质细胞瘤)和肾(肾细胞癌)。至今已经用Avastin治疗超过50万患者,而且有超过450项临床试验的一个综合临床程序项目正在调查Avastin在不同情况(例如晚期或早期疾病)中治疗多种癌症类型(包括结肠直肠、乳腺、非小细胞肺、脑、胃、卵巢和前列腺)中的更多用途。重要的是,Avastin 已经显示出作为共同治疗剂有希望,在与广泛的化疗和其它抗癌疗法组合时展现功效。已经发表了 III期研究，证明将贝伐单抗与标准化疗方案组合的有益效果(参见例如 Saltz 等，2008，J.Clin.0ncol.,26:2013-2019 ；Yang 等，2008，Clin.CancerRes.，14:5893-5899 ；Hurwitz 等，2004，N.Engl.J.Med.，350:2335_2342)。然而，正如在血管发生抑制剂的先前研究中，这些III期研究中的一些已经显示了一部分患者对将贝伐单抗(Avastin +)添加至他们的化疗方案经历不完全响应。因而，需要确定那些对包括血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(Avastin⑩)的组合疗法响应或有可能响应的患者的方法。如此，本发明下面的技术问题是提供用于鉴定患有或倾向于患上乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌，可能受益于将血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(AvastiniKi)添加至化疗疗法，例如多西他赛疗法的患者的方法和手段。该技术问题通过提供权利要求书中表征的实施方案得到解决。因此，本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至所述化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA、 VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA或VEGFR2的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA或VEGFR2中一项或多项的表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案治疗效果的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案治疗效果的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。本发明，因此，涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的蛋白质表达水平；并
(c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低或高剂量贝伐单抗。如所附示例性实施例中显示的，VEGFA和VEGFR2的组合表达水平特别在施用低剂量贝伐单抗的患者中是预示性的。因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低或高剂量贝伐单抗。如所附示例性实施例中显示的，VEGFA和VEGFR2的组合表达水平特别在施用低剂量贝伐单抗的患者中是预示性的。因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低或高剂量贝伐单抗。如所附示例性实施例中显示的，VEGFA和VEGFR2的组合表达水平特别在施用低剂量贝伐单抗的患者中是预示性的。本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低或高剂量贝伐单抗。如所附示例性实施例中显示的，VEGFA和VEGFR2的组合表达水平特别在施用低剂量贝伐单抗的患者中是预示性的。本发明提供一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低剂量或高剂量贝伐单抗。因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低剂量或高剂量贝伐单抗。因此，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)测定患者样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并(b)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的组合对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低剂量或高剂量贝伐单抗。因而，本发明涉及一种通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括:(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平；并(c)对VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在诊断有所述乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗，其中该化疗方案包含多西他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低剂量或高剂量贝伐单抗。本发明提供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自患有、怀疑患有或倾向于患上乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平，由此VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于患有乳腺癌(特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)的患者中测定的对照表达水平，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中测定的对照水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。因而，本发明涉及一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括:(a)自患有、怀疑患有或倾向于患上乳腺癌，局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者获得样品；并(b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平；由此VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平相对于患有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中测定的对照水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。本发明提供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自患有、怀疑患有或倾向于患上局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的样品中VEGFA和VEGFR2的蛋白质表达水平，由此VEGFA和VEGFR2的组合表达水平相对于在患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中测定的对照组合表达水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。本发明提供一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自患有、怀疑患有或倾向于患上局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的样品中VEGFA和PLGF的蛋白质表达水平，由此VEGFA和PLGF的组合表达水平相对于在患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中测定的对照组合水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。该化疗方案可以包含紫杉烧疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。因而，本发明解决所鉴别的技术问题，其在于令人惊讶地显示了相对于在诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中测定的对照水平，给定患者中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的血浆特异性表达水平与那些施用与化疗方案组合的血管发生抑制剂的患者中的治疗效果有关的。具体而言，令人惊讶地将VEGFA、VEGFR2和/或PLGF的蛋白质表达水平中的变化鉴定为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌患者响应将贝伐单抗(Avastin )添加至多西他赛疗法化疗方案的无进展存活改善的标志物/预测物。对将贝伐单抗(Avastin )添加至化疗方案展现响应或敏感性的患者鉴定为VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的蛋白质表达水平相对于自诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者获得的样品中建立的对照表达水平升高。术语“标志物”和“预测物”可互换使用，而且指VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，如本文中描述的。本发明还涵盖“标志物”和“预测物”的用途，术语“标志物”和“预测物”指VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平，即本发明还涵盖VEGFA、VEGFR2和PLGF的血浆表达水平中任何两项或更多项的组合的用途。在本发明的语境中，“VEGFA”指血管内皮生长因子蛋白A，以SEQ ID N0:1例示，在图 8 中显示(Swiss Prot 登录号 P15692，Gene ID (NCBI):7422)。术语“VEGFA” 涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质及其同源物和同等型。术语“VEGFA”还涵盖VEGFA的已知的同等型，例如剪接同等型，例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF2tl6，及其变体、同源物和同等型，包括纤溶酶切割VEGF165生成的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如记载于 Ferrara,Mol.Biol.Cell 21:687 (2010);Leung 等，Science246:1306(1989);及Houck等Mol.Endocrin.5:1806 (1991)。在本发明的一个具体实施方案中，“VEGFAIgVEGF121和/或VEGF11(I。在本发明的一个具体实施方案中，“VEGFA”指VEGFm。在本发明的语境中，术语“ VEGFA”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:1，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFA特异性抗体识别，诸如抗体克隆3C5和26503，它们分别可得自Bender RELIATech和R&D Systems，和A4.6.1,如记载于 Kim 等，Growth Factors7 (1):53-64 (1992)。在本发明的语境中，VEGF或VEGF-A的术语“同等型”(isoform)指剪接同等型和通过酶促切割(例如纤溶酶)生成的形式二者。在一个实施方案中，“VEGFA”指未修饰的VEGF。在本发明的语境中，“未修饰”VEGF涉及VEGF、它的同等型和它的切割产物的未修饰氨基酸序列。例如，未修饰的VEGF可以合成生成，或优选在原核表达系统，例如大肠杆菌中重组生成。例如，未修饰的VEGF不携带翻译后修饰，像糖基化。在本发明的语境中，术语“未修饰VEGF-A”还涵盖其变体和/或同源物，以及VEGF-A的片段，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到未修饰VEGF-A特异性抗体识别，诸如抗体克隆3C5，它可得自RELIATech GmbH,WoIfenbiitteI, Germany。在本发明的语境中，“VEGFR2”指血管内皮生长因子受体2，以SEQ ID NO:2例示，在图 9 中显示(Swiss Prot 登录号 P35968，Gene ID (NCBI):3791)。术语“VEGFR2”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“VEGFR2”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:2，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFR2特异性抗体识别，诸如抗体克隆89115 和 89109，它们可得自 R&D Systems。在本发明的语境中，“PLGF”指胎盘生长因子，以SEQ ID NO:3例示，在
图10中显示(Swiss Prot登录号P49763，Gene ID (NCBI):5228)。术语“PLGF”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“PLGF”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:3，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种PLGF特异性抗体识别，诸如抗体克隆2D6D5和6A11D2，它们可得自 Roche Diagnostics GmbH。因而，本发明涵盖测定蛋白质，包括但不限于如本文中描述的氨基酸序列的表达水平。在此语境中，本发明涵盖检测VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的同源物、变体和同等型；所述同等型或变体可例如包含等位变体或剪接变体。还涵盖检测与如本文中描述的VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项或其片段同源，例如与氨基酸序列SEQ ID NO =USEQID NO:2 或 SEQ ID NO:3 或其片段具有至少 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的蛋白质。或者/另外，本发明涵盖检测由与编码SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或其片段、变体或同等型的核酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列或其片段编码的蛋白质的表达水平。在此语境中，术语“变体”表示VEGFA、VEGFR2和/或PLGF氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核酸序列因突变，例如删除、添加、替代、插入等而不同于由SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ ID N0:3鉴别的和/或在上文所述Swiss Prot登录号下可得的独特序列。另外，术语“同源物”指与一种或多种SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示多肽或其片段具有至少60%、更优选至少80%和最优选至少90%序列同一'丨生的分子。为了测定一种氨基酸或核酸序列与如本文中描述的氨基酸或核酸序列是否具有某种程度的同一性，技术人员可使用本领域公知的手段和方法，例如比对，或是手工或是通过使用本领域已知的或本文中描述的计算机程序。依照本发明，术语“相同”或“百分比同一性”在两种或更多种氨基酸或核酸序列的语境中指如使用本领域已知的序列比较算法或通过手工比对和目视检查测量的，在比较窗口上或在指定区域上为最大对应进行比较和比对时，两种或更多种序列或亚序列相同，或规定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(例如与例如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3氨基酸序列具有60%或65%同一性、优选70-95%同一性、更优选至少95%同一性)。认为具有例如60%至95%或更大序列同一性的序列是基本相同的。此类定义也适用于测试序列的互补物。优选地，所描述的同一性在长度为至少约15至25个氨基酸或核苷酸的区域上、更优选在长度为约50至100个氨基酸或核苷酸的区域上存在。本领域技术人员会知道如何测定序列之间的百分比同一'I"生，例如使用诸如那些基于CLUSTALW计算机程序(Thompson,Nucl.Acids Res.2 (1994)，4673-4680)或 FASTDB (Brutlag,Comp.App.Biosc1.6 (1990)，237-245)的算法，如本领域已知的。虽然FASTDB算法通常不考虑序列中的内部不匹配删除或添加，即缺口，但是在它的计算中，这可以手工修正以避免过高估算％同一性。然而，CLUSTALW在它的同一性计算中确实考虑序列缺口。本领域技术人员还可得到BLAST(基本局部算法搜索工具)和BLAST2.0算法(Altschul，1997，Nucl.Acids Res.25:3389-3402 ；Altschul,1993J.Mol.Evo1.36:290-300 ；Altschul, 1990, J.Mol.Biol.215:403_410)。作为缺省，用于核酸序列的 BLASTN程序使用词长(W ) 11、预期(E ) IO、M=5、N=4和双链比较。对于氨基酸序列，作为缺省，BLASTP程序使用词长(W) 3 和预期(E) 10。BL0SUM62 评分矩阵(Henikoff (1989) PNAS89:10915)使用比对(b ) 50、预期(E ) 10、M=5、N=4和双链比较。如上文讨论的，BLAST算法生成氨基酸和核苷酸序列二者的比对以测定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST在测定精确匹配中或在鉴定相似序列中尤其有用。BLAST算法输出的基础单元是高评分区段对(HSP)。HSP由任意但相等长度的两个序列片段组成，它们的比对是局部最大的且它们的比对得分达到或超出由使用者设置的阈或截留得分。BLAST办法寻找查询序列和数据库序列之间的HSP以评估找到的任何匹配的统计学显著性，而且只报告那些满足使用者选择的显著性阈的匹配。参数E为报告数据库序列匹配建立统计学显著的阈。E解读为HSP (或一组HSP)在整个数据库搜索的范围内的机会发生的期望频率的上界。在程序输出中报告其匹配满足E的任何数据库序列。可以用使用BLAST的类似计算机技术来搜索蛋白质或核酸数据库诸如GenBank或EMBL中的相同或相关分子。这种分析比多种基于膜的杂交快得多。另外，可以修改计算机搜索的灵敏度来确定任何特定匹配是否归类为精确或相似。搜索的基础是一个乘积得分，其定义如下:%序列同一性X %最大BLAST得分100且考虑两种序列之间的相似性程度和序列匹配的长度二者。例如，对于乘积得分40，匹配在1-2%误差内会是精确的；而对于70，匹配会是精确的。相似分子通常通过选择那些显示乘积得分介于15和40之间的来鉴定，尽管更低的得分可鉴定相关分子。能够生成序列比对的程序的另一个例子是CLUSTALW计算机程序(Thompson, 1994, Nucl.Acids Res.2:4673-4680)或 FASTDB (Brutlag, 1990，Comp.App.Biosc1.6:237-245),如本领域已知的。在本文所述发明的语境中，VEGFA、VEGFR2和/或PLGF的表达水平，特别是蛋白质表达水平可作为单独的标志物分开考虑，或者作为表达概况或标志物组以两项或更多项的组考虑。在本文所述发明的语境中，表达概况或标志物组(其中两种或更多种标志物的表达概况可以一起考虑)也可以称作组合表达水平。例如，两种或更多种标志物的表达水平可以添加到一起及与相似测定的对照组合表达水平比较。因此，本发明的方法涵盖基于一种或多种标志物的表达水平测定表达概况，包括组合表达水平。在本文所述发明的语境中及依照所附示例性实施例，对于分开考虑VEGFA或VEGFR2，使用下述值作为标志物的相应高或低表达值:高VEGFA (彡125pg/ml)，低VEGFA(<125pg/ml)，高 VEGFR2 (彡 llng/ml)和低 VEGFR2 (〈llng/ml)。这些水平是按照前瞻性分析计划作为样品中值确定的。另外，构成特定标志物的高和低表达之间截留值的经过优化的水平可以通过改变截留直至高于和低于截留的患者子集满足有关统计学最优性标准来确定。例如，可以选择最佳割点，使得高于和低于的子集之间的治疗危害比差异最大化，或使得一个子集中的治疗效果最大化，或任何其它有关统计学标准。然而，技术人员会理解特定标志物的表达水平和因此构成高或低表达水平的表达水平可以随患者和随患者群体而变化。因而，技术人员会理解在使用所附示例性实施例中所述以外的检测方法及研究所附示例性实施例中所述以外的患者和患者群体时，技术人员考虑的特定生物标志物的高和/或低表达水平可以不同于本文中描述的值。鉴于本文中描述的方法，技术人员能确定什么构成特定生物标志物的高和/或低表达水平。正如技术人员会领会的，有多种方式使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。在一种相当简单但常常有效的办法中，如果样品对于至少一种调查标志物呈阳性，那么假定为阳性结果。然而，也可以评估标志物组合。可以数学组合为标志物组的标志物，例如对VEGFA和VEGFR2、或VEGFA和PLGF、或VEGFA、VEGFR2和PLGF测量的值(或组合表达水平)，并将组合值与潜在的诊断问题关联起来。标志物值可以通过任何适宜现有技术数学方法来组合。用于将标志物组合与疾病或与治疗效果关联起来的公知数学方法采用像判别分析(DA) (SP线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k_最近邻居分类器)、PLS (部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法的方法。技术人员选择适宜方法来评估本发明的标志物组合不会有问题。将依照本文中公开的本发明的标志物组合与例如改善的总体存活、无进展存活、对将贝伐单抗添加至化疗剂/化疗方案的响应性或敏感性和/或预测对(添加至一种或多种化疗剂/化疗方案的) 贝伐单抗的响应或敏感性关联起来中使用的方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k_最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。涉及这些统计方法的详情见下述参考文献=Ruczinski, 1.等，J.0fComputational and Graphical Statistics，12 (2003) 475-511 ；Friedman, J.H., J.0fthe American Statistical Association84(1989)165-175 ;Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert， Friedman， Jerome， The Elements of Statistical Learning， Springer Seriesin Statistics，2001 ;Breiman，L，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.(1984)Classification and regression trees，California:Wadsworth ;Breiman，L，RandomForests，Machine Learning,45 (2001) 5-32 ；Pepe, M.S., The Statistical Evaluationof Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical ScienceSeries, 28 (2003)；及 Duda，R.0.，Hart, P.E.，Stork, D.G.，Pattern Classification，Wiley Interscience,2nd Edition (2001)。因而，本文中公开的本发明涉及经过优化的多变量截留用于生物学标志物的潜在组合及区分状态A与状态B，例如对将贝伐单抗添加至化疗方案响应或敏感的患者与作为将贝伐单抗疗法添加至化疗方案的较差响应者的患者的用途。在这类分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物组或组合表达水平。因此，本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA、PLGF和VEGFR2中两项或更多项的表达水平，通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数(或加权因子)来进行。令人惊讶地，结果(“值”，数学运算的结果，或组合表达水平)与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的(多变量)截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。因而，本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA和VEGFR2中两项或更多项的表达水平，通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数(或加权因子)来进行。令人惊讶地，结果(“值”，数学运算的结果，或组合表达水平)与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的(多变量)截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA和PLGF中两项或更多项的表达水平，通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数(或加权因子)来进行。令人惊讶地，结果(“值”，数学运算的结果，或组合表达水平)与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的(多变量)截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。因而，本发明涉及通过将贝伐单抗添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过测定VEGFA、VEGFR2和PLGF的表达水平，及通过叠加这些表达水平使得每一个表达水平乘以权函数(或加权因子)来进行。令人惊讶地，结果(“值”，数学运算的结果，或组合表达水平)与施用与化疗方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果有关，使得高于预先规定的(多变量)截留的值指示患者的治疗效果较好，而低于此截留的值指示治疗效果较差。例如，正如所附示例性实施例中显示的，当治疗效果为患有局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中的无进展存活且治疗为低(每3周7.5mg/kg)或高剂量(每3周15mg/kg)贝伐单抗加多西他赛疗法(与安慰剂加多西他赛疗法相比)时，下述方程式可用于评估VEGFA和VEGFR2或VEGFA和PLGF的组合表达水平。公式1:norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2)等效公式:0.71*log2 (VEGFA)+3.16*log2 (VEGFR2)-15.6和公式2:0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF)等效公式:0.18*log2 (VEGFA)+0.42*log2 (PLGF)-3.1其中我们使用log2变换和
权利要求
1.一种通过将贝伐单抗(bevacizumab)添加至化疗方案,用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括: (a)测定患者样品中VEGFA和/或VEGFR2的蛋白质表达水平；并 (b)对VEGFA和/或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
2.一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化疗方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括测定来自怀疑 患有或倾向于患上乳腺癌的患者的样品中VEGFA和/或VEGFR2的蛋白质表达水平，由此VEGFA和/或VEGFR2的表达水平相对于患有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高指示患者对将贝伐单抗添加至所述化疗方案的敏感性。
3.贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案无进展存活的用途，包括下述步骤: (a)测定患者样品中VEGFA和/或VEGFR2的蛋白质表达水平；并 (b)对VEGFA和/或VEGFR2的表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
4.权利要求1至3任一项的方法或用途，其中施用的贝伐单抗剂量为低剂量贝伐单抗。
5.权利要求4的方法或用途，其中所述低剂量贝伐单抗为每3周7.5mg/kg体重。
6.权利要求1至3任一项的方法或用途，其中施用的贝伐单抗剂量为高剂量贝伐单抗。
7.权利要求6的方法或用途，其中所述高剂量贝伐单抗为每3周15mg/kg体重。
8.权利要求6的方法或用途，其中所述高剂量贝伐单抗为每2周10mg/kg体重。
9.一种预测怀疑患有、正患有或倾向于患上乳腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的体外方法，包括测定患者样品中VEGFA和/或VEGFR2的蛋白质表达水平。
10.权利要求1至9任一项的方法或用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA和VEGFR2的组合表达水平。
11.权利要求1至5和9任一项的方法或用途，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA和VEGFR2的组合表达水平。
12.权利要求1至9任一项的方法或用途，进一步包括测定PLGF的蛋白质表达水平，其中测定的蛋白质表达水平为VEGFA和PLGF的组合表达水平。
13.特异性探针用于制备用于预测患有、怀疑患有或倾向于患上乳腺癌的患者对将贝伐单抗添加至化疗方案的响应或敏感性的诊断组合物的用途，包括测定患者样品中VEGFA和VEGFR2中一项或多项的表达水平，其中所述探针能够检测VEGFA和VEGFR2中一项或多项。
14.权利要求13的用途，进一步包括用于测定PLGF的表达水平的探针。
15.权利要求13或14的用途，其中该探针为结合分子，像抗体。
16.权利要求1至15任一项的方法或用途，其中所述表达水平通过免疫测定法方法来检测。
17.权利要求16的方法或用途，其中所述免疫测定法方法为ELISA。
18.权利要求1至17任一项的方法或用途，其中所述患者样品为血液样品。
19.权利要求1至18任一项的方法或用途，其中所述患者样品为血浆样品。
20.权利要求1至19任一项的方法或用途，其中该乳腺癌为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。
21.权利要求1至20任一项的方法或用途，其中所述化疗方案包含多西他赛(docetaxel)或帕利他赛(paclitaxel )。
22.权利要求1至21任一项的方法或用途，其中所述化疗方案包含多西他赛。
23.权利要求1至22任一项的方法或用途，其中所述患者正在用一种或多种抗癌疗法共同治疗。
24.权利要求23的方法或用途，其中所述抗癌疗法为放射疗法。
25.权利要求1至24任一项的方法或用途，其中所述样品是在新辅助或辅助疗法之前获得的。
26.权利要求1至24任一项的方法或用途，其中所述样品是在新辅助或辅助疗法之后获得的。
27.—种可用于进行权利要求1至26任一项的方法的试剂盒，包含能够测定VEGFA、VEGFR2和/或PLGF中一项或多项的表达水平的多肽。
28.多肽用于在权利要求1至26任一项中测定VEGFA、VEGFR2和/或PLGF中一项或多项的表达水平的用途。
29.权利要求27的试剂盒或权利要求28的用途，包含能够测定VEGFA、VEGFR2和/或PLGF中一项或多项的表达水平的多肽，其中所述多肽是适合在免疫测定法方法中使用的多肽和/或是对VEGFA、VEGFR2或PL`GF特异性的抗体。
全文摘要
本发明提供通过将贝伐单抗(bevacizumab)()添加至化疗方案，用于改进患有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的方法，其通过相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。特别是，本发明提供改进治疗效果的方法，其中治疗效果为患者的无进展存活。本发明进一步提供用于评估患者对与化疗方案组合的贝伐单抗()的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断有乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌的患者中的对照水平，测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，特别是血浆表达水平来进行。
文档编号G01N33/574GK103109188SQ201180044840
公开日2013年5月15日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月19日
发明者S.L.德哈斯, P.德尔马, D.福尔恩兹勒, U.克劳斯, S.谢勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司