专利名称：测定心律失常的风险的方法
测定心律失常的风险的方法本发明涉及使用干细胞衍生的心肌细胞以高通量阻抗或多电极阵列测定法测定药物诱导的心律失常风险的方法。
背景技术：
药物诱导的尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes) (TdP)是一种威胁生命的多形性室性快速性心律失常(polymorphic ventricular tachyarrhythmia),它已经导致了许多药物使用的撤销或严重限制((Journal of Pharmacological andToxicological Methods52:46-59, 2005)。TdP 的通常原因是内向整流钟通道(inwardrectifying potassium channel),hERG (KCNH2 编码的人或 go-go 相关基因)的抑制，导致了延长的QT间隔。当前，标准的方法是应用过表达hERG的非心肌细胞系筛选用于hERG抑制的药物候选物。然而，hERG筛选是次最佳的，因为并非抑制hERG通道的所有化合物都导致QT延长或者诱导TdP(Cardiovascular Research58:32-45, 2003)。此外，可以通过在体外不显示出hERG抑制或者在临床前的动物模型中不造成QT延长的药物，在人类中诱导心律失常。例如，维拉帕米，一种有效的hERG抑制剂，它不会在患者中造成QT延长或者TdP，并且被安全且有效地使用。尽管存在这种不一致性，但主要由于精制的备选物的普遍缺乏，所以药物研发的大量时间和精力都花费在研究化合物(作为TdP电位的替代物)对hERG抑制和QT间隔延长的影响上。当检查同源和电偶联的细胞群时，可以将诸如多电极测定法(MEA)的技术用于测量场电位，并模拟体内心电图(Journal of Electrocardiology37Suppl:110-116, 2004)。以前已经将MEA用于评估干细胞衍生的心肌细胞动作电位的一般性质，并且可以将电生理学改变用作心律失常的替代测量。然而，技术局限限制了 MEA研究的流通量和持续时间((Stem Cell Research4:107-116 ;Stem Cell Research4:189_200)。除hERG抑制以外，用于查询TdP电位的最常用研究模型是低通量离体模型，如LangendorfT制备物和心室楔形物(ventricular wedge)((Journal of Pharmacological and Toxicological Methods52:46-59,2005)。需要通过制药和生物技术工业来改进用于预测药物诱导的毒性的体外系统，以降低晚期药物损耗(drug attrition)。特别地,存在高通量体外模型的需求,所述体外模型除考虑QT延长外，还直接探究人类心肌细胞所使用的多个离子通道的功能性相互影响，其用于协调正常的节律性收缩。发明概述在本文中，我们公开了第一个应用人诱导的多潜能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)进行的高通量功能测定法，所述测定法准确检测了药物诱导的心脏异常。使用了两种独立的方法，一种是具有测量阻抗的相互交错的电极传感器阵列的96孔板，第二种方法使用多电极阵列。在无破坏地连续测量细胞对平皿的物理吸附的情况下，每12.9毫秒取样一次由于附着iPSC-CM引起的阻抗。阻抗的迹线揭示了 iPSC-CM的节律性收缩。用已知改变心脏功能的多种药物处理，诱导心博率改变，并通过阻抗检测收缩性。在微电极阵列上收集了药物效应的相似结果，从而确认了该模型的有效性。检测、定量药物诱导的心律失常，并计算致心律失常的电位(PPS ;预测的致心律失常得分)的预测，说明这个系统能以以前不可能的方式查询iPSC-CM的功能性质，所述系统提供了预测心血管安全性的新的可能。本申请提供了测定药物诱导的心律失常风险的方法，其包括:a)提供心肌细胞；b)将所述心肌细胞与所述药物接触；c)通过监测细胞收缩或者场电位检测心博率的不规律性。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞是人源的。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞产生自多潜能干细胞来源。本申请提供了上述方法，其中干细胞源是诱导的多潜能干细胞来源。本申请提供了上述方法，其中通过监测细胞场电位的改变来监测心律失常的发生率。本申请提供了上述方法，其中通过测量阻抗监测细胞收缩。本申请提供了上述方法，其中通过在收缩期间，以能鉴定心肌细胞运动的数据捕获率频率测量阻抗来监测细胞收缩。本申请提供了上述方法，其中心律失常的检测包括监测心博率节律的加快、减慢或不规律。本申请提供了上述方法，其中所述方法进一步包括:d)计算IBR。本申请提供了上述方法，其中将小于或等于0.2的IBR用于指示心律失常的低风险。本申请提供了上述方法，其中上述方法进一步包括:e)计算IB2tl相对于Cmax的比率，得到PPS或者计算IB2tl相对于Cmax的比率，得到PPS。本申请提供了上述方法，其中将小于或等于100的PPS用于指示心律失常的低风险。本申请提供了上述方法，其中测定药物诱导的心律失常风险的方法以高通量形式进行。本申请提供了上述方法，其中进行测定药物诱导的心律失常风险的方法，以在药物研发设定下筛选分子。发明详述本申请提供了测定药物诱导的心律失常风险的方法，其包括:a)提供心肌细胞；b)将所述心肌细胞与所述药物接触；c)通过监测细胞收缩或者场电位检测心博率的不规律性。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞是狗、猴子、大鼠、兔或者人源的。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞是人源的。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞产生自干细胞来源。 本申请提供了上述方法，其中干细胞源是胚胎干细胞来源。本申请提供了上述方法，其中心肌细胞产生自多潜能干细胞来源。本申请提供了上述方法，其中干细胞源是诱导的多潜能干细胞来源。本申请提供了上述方法，其中通过监测细胞场电位的改变来监测心律失常的发生率。本申请提供了上述方法，其中通过测量阻抗监测细胞收缩。
本申请提供了上述方法，其中通过在收缩期间，以能鉴定心肌细胞运动的数据捕获率频率测量阻抗来监测细胞收缩。本申请提供了上述方法，其中心律失常的检测包括监测心博率节律的加快、减慢或不规律。本申请提供了上述方法，其中心博率节律的不规律性是尖端扭转型室性心动过速的指征。本申请提供了上述方法，其中心博率节律的不规律性是QT延长的指征。本申请提供了上述方法，其中心博率节律的不规律归因于心脏离子通道的破坏。本申请提供了上述方法，其中以约每12.9毫秒一次的取样率测量阻抗。本申请提供了上述方法，其中所述方法进一步包括:d)计算IBR。本申请提供了上述方法，其中将小于或等于0.2的IBR的用于指示心律失常的低风险。本申请提供了上述方法，其中上述方法进一步包括:e)计算IB2tl相对于Cmax的比率，得到PPS或者计算B2tl相对于Cmax的比率，得到PPS。本申请提供了上述方法，其中上述方法进一步包括:e)计算Cmax相对于IB2tl的比率，得至IJ PPS。本申请提供了上述方法，其中将IB2tl相对于Cmax的比率小于或等于100用于指示心律失常的低风险。本申请提供了上述方法，其进一步包括:f)将步骤e)的结果与已知诱导心律失常的药物的结果比较。本申请提供了上述方法，其中心脏离子通道是钾通道。本申请提供了上述方法，其中钾通道是hERG通道。本申请提供了上述方法，其中心脏离子通道是钙通道。本申请提供了上述方法，其中心脏离子通道是钠通道。本申请提供了上述方法，其中测定药物诱导的心律失常风险的方法以高通量形式进行。本申请提供了上述方法，其中进行测定药物诱导的心律失常风险的方法，以在药物研发设定下筛选分子。理解的是，本文中所提供的方法是体外方法，即所述方法不在人类或动物身体上进行。指导多潜能干细胞(PSC)分化成博动的成熟心肌细胞的能力提供了在体外研究心血管生物学的新途径(Trends in Pharmacological Sciences30:536-545, 2009)。此外，基于人PSC预测的毒性测定法可以在研发过程的早期，帮助校准有希望的药物候选物的潜在的安全问题，并提供对药物诱导的器官毒性机制的深入见解，这些都降低、改进并替换了对活动物测试的依赖。使用核型正常的人PSC衍生的组织可以增加相关性和临床前安全评估的预测值，因为常规方法主要依赖于很少预测人类应答的动物模型，并且对驳斥假阳性仅提供有限的能力(Regul.Toxicol.Pharmacol.32:56-67, 2000)。此外，具有确定的人类等位基因变异的一组PSC可以帮助鉴定显示出改变的药物应答的患者亚群，帮助优化对成功的临床试验设计关键的包含和排除标准。
本文中所述的方法使用具有能对阻抗快速取样的相互交错的电极传感器阵列的96孔组织培养平板。以前公开的在细胞培养物中的阻抗测量的应用依赖于更慢的取样速率，并且通常受限于测量的一般细胞效应，如细胞毒性或运动性((Nature366 =591-592,1993, Biotechnology Journal3:484-495, 2008)。通过将取样速率增加至 12.9 毫秒，可以观察到收缩心肌细胞的物理运动。这允许实时、无标记地监测活的人iPSC衍生的心肌细胞的节律性收缩。直接测量人心肌细胞的功能性收缩使得有可能在体外高通量筛选新分子实体的致心律失常的潜能。由于快速阻抗取样的使用还没有应用于检测自发性心肌细胞博动，所以我们首先试图完全表征该系统。如通过MEA和阻抗所测量，在各个孔和平板之间的未经处理的iPSC-CM的博动速率恒定地为每分钟平均 40次博动(BMP)。为了建立反映与电改变相反的细胞物理收缩的快速阻抗读数，检查了肌球蛋白II抑制剂(blebbistatin)的作用。用blebbistatin处理后，使用阻抗没有观察到心肌细胞博动，而通过MEA检测的心肌细胞电生理学保持不变，证实在收缩期间阻抗的确直接测量心肌细胞的物理运动，而不是测量与电压依赖的心脏动作电位的电场相关的人为产物。然后我们系统性地检查了不同种类的作用于心脏的药物的作用(表1-11)。IBR代表“不规律心博比率(Irregular Beat Ratio)”,计算为一分钟内不规律搏动数除以总搏动(=不规律搏动/总搏动)。IBR将为0-1 (或者如果使用％作为单位，则为
0-100%)之间的值。IB2tl等于产生IBR值彡0.2 (在一分钟内彡20%的不规律搏动)的最低浓度。在本申请中，PPS通过两种不同的方式计算:l)Cmax/IB20, Cmax相对于IB2tl的比率，并且作为相关水平，截断为> 100 (表I):表1.
权利要求
1.测定药物诱导的心律失常风险的方法，其包括: a)提供心肌细胞； b)将所述心肌细胞与所述药物接触； c)通过监测细胞收缩或场电位，监测搏动速率的不规律性。
2.权利要求1的方法，其中所述心肌细胞是狗、猴子、大鼠、兔子或人类来源的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述心肌细胞是人类来源的。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述心肌细胞产生自干细胞来源。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述干细胞来源是胚胎干细胞来源。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述心肌细胞产生自多潜能干细胞来源。
7.权利要求6的方法，其中所述干细胞来源是诱导的多潜能干细胞来源。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述心律失常的发生率通过监测细胞场电位的改变来检测。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述细胞收缩通过测量阻抗来监测。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞收缩通过在收缩期间以能鉴定心肌细胞运动的数据捕获速率频率测量阻抗来监测。
11.权利要求9或1 0的方法，其中所述阻抗用约12.9毫秒一次的取样速率测量。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述心律失常的检测包括监测搏动速率节律的增加、降低或不规律。
13.权利要求12的方法，其中所述搏动速率节律的不规律是尖端扭转型室性心动过速(Torsades de Pointes)的指征。
14.权利要求12的方法，其中所述搏动速率节律的不规律是QT延长的指征。
15.权利要求12的方法，其中所述搏动速率节律的不规律归因于心脏离子通道的破坏。
16.权利要求15的方法，其中所述心脏离子通道是钾通道。
17.权利要求16的方法，其中所述钾通道是hERG通道。
18.权利要求15的方法，其中所述心脏离子通道是钙通道。
19.权利要求15的方法，其中所述心脏离子通道是钠通道。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其进一步包括: d)计算IBR0
21.权利要求20的方法，其中将小于或等于0.2的IBR用于指示心律失常的低风险。
22.权利要求20或21的方法，其进一步包括: e)计算IB2tl相对于Cmax的比率，得到PPS或者计算IB2tl相对于Cmax的比率，得到PPS。
23.权利要求20或21的方法，其进一步包括: e)计算Cmax相对于IB2tl的比率，得到PPS。
24.权利要求20或21的方法，其中将小于或等于100的PPS用于指示心律失常的低风险。
25.权利要求20-24中任一项的方法，其进一步包括: f)将步骤e)的结果与已知诱导心律失常的药物的结果比较。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述测定药物诱导的心律失常风险的方法以高通量形式进行。
27.权利要求1-27中任一项的方法，其中进行所述测定药物诱导的心律失常风险的方法，以在药物研 发设定下筛选分子。
全文摘要
本发明涉及使用干细胞衍生的心肌细胞以高通量阻抗或多电极阵列测定法测定药物诱导的心律失常风险的方法。
文档编号G01N33/68GK103221826SQ201180051232
公开日2013年7月24日 申请日期2011年10月25日 优先权日2010年10月29日
发明者R·阿布拉姆斯, J·巴比亚兹, E·乔, 郭亮, K·L·科拉雅 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司