专利名称：具有保护柱的色谱系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及色谱分离(chromatographic separation),以及具体来说，涉及诸如单克隆抗体之类的生物分子的大规模色谱分离。更具体来说，它涉及具有保护柱(guardcolumn)的色谱系统以及操作这种系统的半连续方法。
背景技术：
在生物制药领域，遗传工程和细胞培养技术近来的进步已经推动比以前更高的表达水平，从而对下游纯化、特别是捕获步骤施加相当大的负担。虽然新色谱树脂的引入显著提高基于常规单柱色谱的过程的效率，但是能够通过工作在具有若干柱的循环模式来实现附加增益。这一直应用于不同种类的连续或半连续色谱中，例如W02008153472中描述的模拟移动床(SMB)以及由 Heeter 等人(Herrter G.A.和 Liapis A.1., J Chromatography A711,3-21 (1995))所述的周期逆流色谱(PCC)。溶质的色谱柱的结合能力是生产型色谱(process chromatography)中的极重要因素。结合能力直接影响色谱步骤的生产率和成本。结合能力根据动态/穿透能力(dynamic/breakthrough capacity)或者作为最大结合能力来定义。动态能力取决于溶液流经填充有色谱介质的柱的条件，例如定义为柱体积与进样流率(feed flow rate)之间的比率的停留时间。如果停留时间是无限长，则最大结合能力表示柱的穿透能力。初始穿透能力定义为柱在流出物中首次检测到溶质时的点所吸收的结合溶质量。穿透能力还能够定义为给定百分比的穿透的能力，其中百分比表示来自柱的流出物中存在的以进样中存在的溶质的百分数所表达的结合溶质的量。按照这个定义，最大结合能力将等于100%的穿透、即在没有更多溶质能够结合到柱的点的穿透能力。因此，为了确定最大能力，在不同的穿透等级来测量穿透能力，其中等级通过样本上样(sample loading)期间来自柱的流出物中测量的溶质的浓度等级来定义。常常通过连续监测通过放置在流出物管线中的检测器的流量中的信号来确定这些浓度。这些浓度(信号)对时间(或者所上样的体积或质量)的线图称作穿透曲线。色谱图上的穿透的位置及其形状与柱上能够结合多少溶质以及多快使所有吸收部位处于溶质饱和相关。它还表明，还有多少溶质在任何给定时间能够结合到柱。在杂质存在的情况下的溶质的穿透结合能力是优化发展纯化规程的时间的最关键参数之一。用于单克隆抗体的下游处理的典型过程涉及使用具有蛋白A配体的树脂以极高选择性来结合抗体的捕获步骤。这是极有效的步骤，因为在这里去除杂质的大多数。但是，由于蛋白A树脂的成本，存在例如通过增加树脂的结合能力的利用的化学工程方法来优化效率的强烈动机。在蛋白A步骤之后，抗体在其它色谱步骤中、例如结合-洗脱(bind-elute)阳离子交换色谱和/或在结合洗脱或流通多峰(flowthrough multimodal)或阴离子交换色谱中进一步纯化。另外，在这些步骤中，需要增加所使用树脂的能力利用，特别是当步骤运行于结合-洗脱模式时。较大柱之前的小的一次性保护柱的使用是从单柱色谱众所周知的，作为增加主柱的使用寿命的手段。当不可逆垢发生时，只有保护柱将被损坏并且能够更换为新柱。但是，这个布置将不会提供树脂能力利用的任何改进。虽然例如SMB和PCC等的连续色谱方法具有改进能力利用的可能性，但是它们是建立和运行的复杂方法，其中涉及大量阀和柱的控制。因此，需要一种与单柱色谱相比增加能力利用的简单稳健的解决方案。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种用于生物分子的大规模色谱分离的有效过程。这采用如权利要求1所述的色谱系统以及采用如权利要求13所述的色谱方法来实现。这种系统和方法的一个优点在于，有效地利用色谱介质的结合能力。另一个优点在于，延长色谱介质的使用寿命。这些效果均有助于色谱分离的改进经济性。在从属权利要求中描述本发明的其它适当实施例。
图1示出按照本发明的色谱系统；
图2示出按照本发明的色谱分离的方法。定义
本文中的术语“进样”表示提供给色谱系统并且包含待纯化的目标物质的液体。目标物质能够是生物分子，例如单克隆抗体。进样的示例能够是澄清的发酵液、生物流体等以及来源于前一个分离步骤并且包含经部分纯化的目标物质的液体。本文中的术语“保护柱”表示与主色谱柱串联连接并且具有比主柱显著要小的体积的色谱柱。
具体实施例方式在图1所示的一个方面，本发明公开一种色谱系统，其中包括:主柱1，包含色谱树脂；第一保护柱2 ；以及第二保护柱3，其中第一保护柱2连接到主柱I的第一端4，第二保护柱3连接到主柱的第二端5。换言之，主柱的各端连接有一个保护柱。具有主柱的各端连接有一个保护柱的一个优点在于，因此有可能以色谱树脂的改进能力利用来运行分离。在某些实施例中，第一和第二保护柱的柱床(bed)体积各小于主柱I的柱床体积的大约50%、例如小于大约25%、小于大约15%或者小于大约10%。其优点在于，更有效地使用色谱树脂。主体积的柱床体积能够为至少一升，例如至少10升或者至少100升，因为在例如生物制药的分离的大规模制备型色谱中存在使用本发明的独特优点，其中增加树脂能力利用是重要的。在一些实施例中，第一浓度检测器6连接在主柱I的第一端4与第一保护柱2之间，以及第二浓度检测器7连接在主柱I的第二端5与第二保护柱3之间。第一和第二浓度检测器能够是紫外吸收检测器，它们对于检测例如蛋白质的浓度是便利的。但是，它们也能够是能够用于检测非UV吸收物质的折射率检测器，或者它们能够是用于各种目标物质或污染物的特定检测器。在这些位置具有检测器的一个优点在于，因此有可能监测主柱在上流和下流两个方向的主柱的穿透，从而提供一旦检测到穿透则控制通过系统的流径的可能性。穿透的监测能够手动或自动进行，并且流径的控制能够手动或自动进行。
在一个实施例中，色谱系统还包括确定单元18，确定单元18电连接到第一浓度检测器6和第二浓度检测器7，并且适合检测表示提供给主柱的一端4、5的进样材料的组成的进样信号以及表示来自主柱的相对端5、4的流出物的流出物信号。在一个实施例中，确定单元18能够适合确定主柱I的穿透点和/或饱和点。确定单元18能够是计算机、可编程逻辑控制器或者能够根据从浓度检测器信号所计算的函数来控制阀的任何其它类型的数字或模拟单元。能够通过比较第一检测器6和第二检测器7上测量的信号，来计算穿透点。在第一检测器6上测量的信号表示(在UV检测器的情况下)进样中存在的全部UV吸收成分、即结合到第一保护柱2的成分以及经过的成分的浓度。信号在非吸收物质穿透保护柱2时到达第一坪值(plateau)，然后在第一保护柱2变为饱和时到达第二坪值。第二坪值表示进样流中存在的全部物质的总浓度。第二检测器7监测来自柱I的流出物流中的物质的浓度。在第二检测器上测量的信号之间的差达到例如第一检测器上测量的第二坪值与第二检测器上测量的第一坪值之间的差的1%的预定值时，达到第一穿透点。称作饱和点的第二穿透点按照类似方式来确定，除了两个检测器上测量的信号之间的差达到另一个值、例如70%之外。在某些实施例中，第一保护柱2经由第一阀10连接到进样槽8或者废料容器9，以及第二保护柱3经由第二阀17连接到进样槽15或者废料容器16，条件是:当第一保护柱连接到进样槽时，则第二保护柱连接到废料容器，而当第一保护柱连接到废料容器时，则第二保护柱连接到进样槽。在一个实施例中，确定单元18电连接到第一和第二阀，并且适合控制所述第一和第二阀的位置。这个布置的一个优点在于，当确定单元检测穿透或饱和点时，它能够自动将出射流从主柱转向例如进样槽。在一些实施例中，色谱系统还包括:主柱I与第一保护柱2之间的第三阀12，其中第三阀12适合将流体从主柱I转向洗出液槽(eluate tank) 11或者废料容器16 ;以及主柱I与第二保护柱3之间的第四阀14，其中第四阀14适合将流体从主柱I转向洗出液槽13或者废料容器16，并且其中确定单元18适合控制第三和第四阀的位置。这个布置的一个优点在于，当确定单元检测洗涤循环完成时，它能够自动开始洗脱循环。这个布置的第二优点在于，当确定单元检测穿透点时，它能够自动将第二保护柱3与主柱I串联连接。这防止第二保护柱3暴露于产物耗尽进样流。在某些实施例中，所述第一和第二保护柱包括具有基本上与主柱中的色谱树脂相同的选择性的色谱树脂。这意味着，保护柱和主柱中的树脂在离子强度、PH等的给定条件下结合相同物质。为了提供相同选择性，树脂能够采用相同类型的配体、适当地以近似相同的配体含量或者以小于大约20%的配体含量的差来置换。具有基本上相同的选择性的一个优点在于，来自主柱的任何目标物质穿透将由主柱之后的保护柱来捕获。在一些实施例中，所述主柱以及所述第一和第二保护柱包括具有Fe片段-结合亲合配体的色谱树脂。这类配体常用于单克隆抗体处理中的捕获步骤，其中它们的高成本对增加步骤效率和树脂的使用寿命施加压力。它们对抗体具有极高选择性，从而允许对洗脱使用单级梯度，这对于本发明的方法和系统是特别有利的。亲合配体能够是蛋白质配体，例如:蛋白 A、变异种类的蛋白 A，如 EP1485407 B1、W0200803914U W02010080065、EP2202310A2、EP2157099 Al、JP2006304633,US20100168395、CN101337986、W02009146755等中所述；蛋白G或Fe结合单域抗体片段，例如W02009011572中所述。备选地，亲合配体能够是肽、核酸或小有机分子。树脂的配体含量例如能够在1-15 mg/ml树脂的范围之内。在一些实施例中，所述第一和第二保护柱包括体积平均粒度比主柱中的色谱树脂的体积平均粒度要大至少大约10%、例如至少大约25%或者大约50%的色谱树脂。主柱树脂的平均粒度能够为大约50-100微米、例如80-95微米，而保护柱树脂的平均粒度能够为大约100-250微米、例如130-210微米。树脂的平均粒度能够有利地在整个第一和第二保护柱是相同的。在一个具体示例中，主柱能够填充有85微米平均粒度的蛋白A官能MabSelect树脂(GE Healthcare Life Sciences),以及保护柱填充有按照本领域已知方法(如ΕΡ873353Β1中所述)采用蛋白A来官能化的200微米平均粒度的Sepharose Big Beads(GE Healthcare Life Sciences)。在保护柱中具有较大粒度树脂的一个优点在于,反压(back pressure)将比较低,而通常与较大颗粒关联的穿透曲线的较低陆度不成问题,因为保护柱不必在其穿透点附近使用。在图2所示的一个方面，本发明公开一种用于目标物质的色谱分离的方法，包括下列步骤:
a)通过将进样从进样槽8经由第一保护柱2通过主柱I传送到i)废料容器16或者 )经由第二保护柱3传送到废料容器16，以将目标物质上样至主柱I上，
b)通过经由第一保护柱2通过主柱I和第二保护柱3传送洗涤流体，来洗涤柱，以及
c)通过将洗脱流体经由第 一保护柱2或第二保护柱3通过主柱I传送到洗出液槽11、13来洗脱目标物质。在上样步骤a)中，目标物质、例如生物分子、如蛋白质、免疫球蛋白、IgG或单克隆抗体能够结合到第一保护柱中和主柱中的色谱树脂，使得只将耗尽进样传送到废料容器。这能够继续进行，直到主柱表明产物穿透。此时，第二保护柱能够连接到主柱，并且没有结合在主柱上的目标物质则被吸收在第二保护柱上。这个过程能够继续进行，直到第一保护柱和主柱饱和，并且某种目标物质结合到第二保护柱中的色谱树脂。流量则能够在步骤b)改变成洗涤模式，其中洗涤流体沿任何方向被传送通过全部三个柱，但是优选地沿与步骤a)中相同的方向，以及从主柱浸出的任何目标物质由主柱之后的保护柱来捕获。当洗涤完成时，流量能够在步骤c)改变到洗脱模式，其中洗脱流体通过保护柱之一和主柱沿任何方向、但是优选地沿与步骤a)中相同的方向、例如通过第二保护柱然后通过主柱来传送到洗出液槽，其中收集分离的目标物质。这种方法的一个优点在于，来自主柱的任何穿透目标物质能够由保护柱在上样和洗涤期间来捕获，然后在洗脱期间回收。在某些实施例中，该方法还包括下列步骤
d)通过将进样从进样槽15经由第二保护柱3通过主柱I传送到i)废料容器9或者 )传送到第一保护柱2以及废料容器9，以将目标物质上样至主柱I上。这个上样步骤沿与上样步骤a)相反的方向执行，并且能够例如在步骤a)、b)和c)按照这种顺序的序列之后运行。其优点在于，第一保护柱准备好捕获开始穿透主柱从而通过穿透点的任何产物。在某些实施例中，步骤b)和c)在步骤d)之后重复进行，其中重复步骤b)和c)中的流向与原始步骤b)和C)中的流向相反。重复步骤C)中的流通过第二保护柱然后通过主柱到洗出液槽8。在一些实施例中，步骤a)还包括测量离开主柱的流体中的目标物质的浓度，以及当所述浓度达到预定值时结束步骤a)。
在某些实施例中，步骤a)还包括确定主柱的穿透点或饱和点，并且当达到所述穿透或饱和点时结束步骤a)。其优点在于，有效地利用主柱中的树脂，并且基本上所有穿透目标物质均由保护柱来捕获。在一些实施例中，步骤b)还包括测量离开主柱的流体中的目标物质的浓度，以及当所述浓度低于预定值时结束步骤b)。其优点在于，使洗涤流体的消耗为最小。本书面描述使用示例来公开本发明，其中包括最佳模式，以及还使本领域的技术人员能够实施本发明，包括制作和使用任何装置或系统并且执行任何结合的方法。要指出，以上所公开的本发明的各个方面的具体实施例能够在本发明的范围之内自由组合到其它实施例。本发明的专利范围由权利要求书来定义，并且可包括本领域的技术人员想到的其它示例。如果这类其它示例具有与权利要求书的文字语言完全相同的结构单元，或者如果它们包括具有与权利要求书的文字语言的非实质差异的等效结构单元，则它们意在落入权利要求书的范围之内。
权利要求
1.一种色谱系统，包括:主柱(I)，包含色谱树脂；第一保护柱(2);以及第二保护柱(3)，其中所述第一保护柱(2)连接到所述主柱(I)的第一端(4)，所述第二保护柱(3)连接到所述主柱的第二端(5)。
2.如权利要求1所述的色谱系统，其中，所述第一(2)和第二(3)保护柱的柱床体积各小于所述主柱⑴的所述柱床体积的大约50%,例如小于大约25%或者小于大约15%。
3.如权利要求1或2所述的色谱系统，其中，第一浓度检测器(6)连接在所述主柱(I)的所述第一端(4)与所述第一保护柱(2)之间，以及第二浓度检测器(7)连接在所述主柱(I)的所述第二端(5)与所述第二保护柱(3)之间。
4.如权利要求3所述的色谱系统，其中，所述第一和第二浓度检测器(6，7)是紫外吸收检测器。
5.如权利 要求3或4中的任一项所述的色谱系统，还包括确定单元(18)，所述确定单元(18)电连接到所述第一和第二浓度检测器，并且适合检测表示提供给所述主柱的一端(4,5)的进样材料的组成的进样信号以及表示来自所述主柱的所述相对端(5，4)的流出物的流出物信号。
6.如权利要求5所述的色谱系统，其中，所述确定单元(18)适合确定所述主柱(I)的穿透点和/或饱和点。
7.如以上权利要求中的任一项所述的色谱系统，其中，所述第一保护柱(2)经由第一阀(10)连接到进样槽⑶或者废料容器(9)，以及所述第二保护柱(3)经由第二阀(17)连接到进样槽(15)或者废料容器(16)，条件是:当所述第一保护柱连接到进样槽时，则所述第二保护柱连接到废料容器，而当所述第一保护柱连接到废料容器时，则所述第二保护柱连接到进样槽。
8.如权利要求7所述的色谱系统，其中，确定单元(18)电连接到所述第一和第二阀，并且适合控制所述第一和第二阀的位置。
9.如权利要求8所述的色谱系统，还包括:所述主柱(I)与所述第一保护柱(2)之间的第三阀(12)，所述第三阀适合将流体从所述主柱(I)转向流出液槽(11)或者所述废料容器(16);以及所述主柱⑴与所述第二保护柱(3)之间的第四阀(14)，所述第四阀适合将流体从所述主柱(I)转向流出液槽(13)或者所述废料容器(16)，并且其中所述确定单元(18)适合控制所述第三和第四阀的位置。
10.如以上权利要求中的任一项所述的色谱系统，其中，所述第一和第二保护柱包括具有基本上与所述主柱中的色谱树脂相同的选择性的色谱树脂。
11.如以上权利要求中的任一项所述的色谱系统，其中，所述主柱以及所述第一和第二保护柱包括具有Fe片段-结合亲合配体的色谱树脂。
12.如以上权利要求中的任一项所述的色谱系统，其中，所述第一和第二保护柱包括体积平均粒度比所述主柱中的色谱树脂的所述体积平均粒度要大至少大约10%、例如至少大约25%或者大约50%的色谱树脂。
13.一种用于目标物质的色谱分离的方法，包括下列步骤: a)通过将进样从进样槽(8)经由第一保护柱(2)通过主柱(I)和第二保护柱(3)传送到废料容器(16)，以将所述目标物质上样至所述主柱(I)上 b)通过经由所述第一保护柱(2)通过所述主柱(I)和所述第二保护柱(3)传送洗涤流体，来洗涤所述柱 c)通过将洗脱流体经由所述第一保护柱(2)或者所述第二保护柱(3)通过所述主柱(1)传送到洗出液槽(11，13)来洗脱所述目标物质。
14.如权利要求13所述的方法，还包括下列步骤 d)通过将进样从进样槽(15)经由所述第二保护柱(3)通过所述主柱(I)和所述第一保护柱(2)传送到废料容器(9)，以将所述目标物质上样至所述主柱(I)上。
15.如权利要求13或14中的任一项所述的方法，其中，步骤a)还包括测量离开所述主柱的流体中的目标物质的浓度，以及当所述浓度达到预定值时结束步骤a)。
16.如权利要求13-15中的任一项所述的方法，其中，步骤a)还包括确定所述主柱的穿透点或饱和点，并且当达到所述穿透或饱和点时结束步骤a)。
17.如权利要求13-16中的任一项所述的方法，其中，步骤b)还包括测量离开所述主柱的流体中的目标物质的浓度，以及当所述浓度低于预定值时结束步骤b)。
18.如权利要求13-17中的任一项所述的方法，其中，所述第一和第二保护柱包括具有基本上与所述主柱中 的色谱树脂相同的选择性的色谱树脂。
19.如权利要求13-18中的任一项所述的方法，其中，所述主柱以及所述第一和第二保护柱包括具有Fe片段-结合亲合配体的色谱树脂。
20.如权利要求13-19中的任一项所述的方法，其中，所述第一和第二保护柱包括体积平均粒度比所述主柱中的色谱树脂的所述体积平均粒度要大至少10%、例如至少25%或50%的色谱树脂。
21.如权利要求13-20中的任一项所述的方法，其中，所述第一(2)和第二(3)保护柱的所述柱床体积各小于所述主柱(I)的所述柱床体积的大约50%，例如小于大约25%或者小于大约15%。
全文摘要
一种色谱系统，具有主柱(1)，包含色谱树脂；第一保护柱(2)；以及第二保护柱(3)，其中第一保护柱(2)连接到主柱的第一端(4)，第二保护柱(3)连接到主柱的第二端(5)，并且所述第一和第二保护柱的柱床体积各小于主柱的柱床体积的大约50%。
文档编号G01N30/60GK103180727SQ201180051833
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月24日 优先权日2010年10月27日
发明者K.拉基 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司