专利名称：一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法。
背景技术：
大分子胶原蛋白是指胶原蛋白分子具有完整的三螺旋结构，分子量在30万以上的胶原蛋白。以往研究胶原蛋白热变性程度的方法主要有粘度法、DSC法、圆二色谱法(CD法)等。粘度法是根据加热情况下，胶原蛋白分子解螺旋、断裂导致溶液粘度下降的原理来测定的；DSC法基于三螺旋解体过程会伴随热吸收的过程；CD法测定基于胶原蛋白中存在的a螺旋，在特定的波长有正吸收或负吸收的原理。但不论哪种方法都要有相应的设备，特别是CD法、DSC法对于设备的要求较高，并且测定结果受较多因素影响。采用酶法(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)评价胶原蛋白的热变性程度不但采用的设备简单，而且通过电泳图既可以反映胶原中具有完整三螺旋结构的蛋白情况，又可以反映由胶原蛋白亚基构成的二聚体、单体以及亚基分解后的片段的情况，对蛋白质变性状况的反映更加全面和直观。
发明内容
本发明提供一种采用胃蛋白酶结合SDS-PAGE法评价胶原蛋白的热变性程度，它具有但采用的设备简单，而且通过电泳图既可以反映胶原中具有完整三螺旋结构的蛋白情况，又可以反映由胶原蛋白亚基构成的二聚体、单体以及亚基分解后的片段的情况，对蛋白质变性状况的反映更加全面和直观的优点。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，步骤如下(I)原料选择，选择水产品加工的下脚料-鱼皮为原料，也可以选择其他富含胶原蛋白的动物组织如猪皮、牛皮、筋腱。(2)浸泡溶解在步骤(I)中原料加入0. 01-1. OmoI/L醋酸，获得胶原蛋白溶液，胶原蛋白溶液的浓度为0. 1-20%。(3)加热预处理将步骤(2)中获得的胶原蛋白溶液加热，加热时间为10-200分钟，加热温度为20°C _80°C，加热过程中，每隔5分钟晃动一次，加热完成后迅速降温冷却。(4)酶解在步骤⑶中获得的胶原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量为1_20%，反应温度10-60°C，时间10-100分钟，反应完成后加入苯甲基磺酰氟终止反应。(5)制作电泳样品并电泳将终止反应的胶原蛋白溶液加入十二烷基磺酸钠溶液制作电泳样品并电泳。优选地，步骤(2)中加入的醋酸浓度为0.04-0. 8mol/L，胶原蛋白溶液的浓度为5-15%。 优选地，步骤(3)中加热时间为20-180分钟，加热温度为20°C _80°C。优选地，步骤(4)中，酶解时加入胃蛋白酶的量为5-15%。
优选地，步骤(4)中，加热温度为15_55°C，加热时间为20-50分钟。
优选地，步骤(5)中胶原蛋白的热变性程度根据胶原蛋白中P链浓度的减少量来表示，P链浓度降低的越多说明胶原蛋白热变性的程度越大。本发明的优点采用的设备简单，而且通过电泳图既可以反映胶原中具有完整三螺旋结构的蛋白情况，又可以反映由胶原蛋白亚基构成的二聚体、单体以及亚基分解后的片段的情况，对蛋白质变性状况的反映更加全面和直观。
图I为本发明的流程图。图2为不同温度酶解后的电泳图谱，变性温度酶解1/10 I 28°C,2 30°C,3 31. 5°C,4 33°C,5 35°C,6 40°C,7 :50°C。
具体实施例方式(I)原料选择，选择水产品加工的下脚料-鱼皮为原料，也可以选择其他富含胶原蛋白的动物组织如猪皮、牛皮、筋腱。(2)浸泡溶解在步骤⑴中原料加入0. 01-1. OmoI/L醋酸，获得胶原蛋白溶液，胶原蛋白溶液的浓度为0. 1-20%。(3)加热预处理将步骤(2)中获得的胶原蛋白溶液加热，加热时间为10-200分钟，加热温度为20°C _80°C，加热过程中，每隔5分钟晃动一次，加热完成后迅速降温冷却。(4)酶解在步骤(3)中获得的胶原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量为1_20%，反应温度10-60°C，时间10-100分钟，反应完成后加入苯甲基磺酰氟终止反应。(5)制作电泳样品并电泳将终止反应的胶原蛋白溶液加入十二烷基磺酸钠溶液制作电泳样品并电泳。实施例如图2所示，取牛皮、鲤鱼皮、鳕鱼皮胶原蛋白样品，配制成0. 5%的0. 5M醋酸溶液，并于 I :28°C、2 :30°C、3 31. 5°C、4 :33°C、5 :35°C、6 :40°C、7 :50°C温度下加热 30 分钟后，加入I/10胃蛋白酶，在20 C反应3小时后，电泳并分析电泳图谱。以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
权利要求
1.一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于，步骤如下 (1)原料选择，选择水产品加工的下脚料-鱼皮为原料，也可以选择其他富含胶原蛋白的动物组织如猪皮、牛皮、筋腱。
(2)浸泡溶解在步骤(I)中原料加入O.01-1. Omol/L醋酸，获得胶原蛋白溶液，胶原蛋白溶液的浓度为O. 1-20%。
(3)加热预处理将步骤(2)中获得的胶原蛋白溶液加热，加热时间为10-200分钟，力口热温度为20°C -80°C，加热过程中，每隔5分钟晃动一次，加热完成后迅速降温冷却。
(4)酶解在步骤(3)中获得的胶原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量为1_20%，反应温度10-60°C，时间10-100分钟，反应完成后加入苯甲基磺酰氟终止反应。
(5)制作电泳样品并电泳将终止反应的胶原蛋白溶液加入十二烷基磺酸钠溶液制作电泳样品并电泳。
2.根据权利要求I所述的胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于步骤(2)中加入的醋酸浓度为O. 04-0. 8mol/L，胶原蛋白溶液的浓度为5-15%。
3.根据权利要求I所述的胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于步骤(3)中加热时间为20-180分钟，加热温度为20°C -80°C。
4.根据权利要求I所述的胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于步骤(4)中，酶解时加入胃蛋白酶的量为5-15%。
5.根据权利要求I所述的胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于步骤(4)中，加热温度为15-55°C，加热时间为20-50分钟。
6.根据权利要求I所述的胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于步骤(5)中通过胶原蛋白β链的变化来判断胶原蛋白的变性程度。
全文摘要
本发明公开了一种胃蛋白酶法大分子胶原蛋白热变性程度的评价方法，其特征在于，步骤如下(1)原料选择，选择水产品加工的下脚料-鱼皮为原料；(2)浸泡溶解在原料加入0.01-1.0mol/L醋酸，获得胶原蛋白溶液；(3)加热预处理将胶原蛋白溶液加热，加热过程中，每隔5分钟晃动一次，加热完成后迅速降温冷却；(4)酶解在胶原蛋白液中加入胃蛋白酶，加热反应，反应完成后加入苯甲基磺酰氟终止反应；(5)制作电泳样品并电泳；本发明的优点是采用的设备简单；对蛋白质变性状况的反映更加全面和直观。
文档编号G01N1/44GK102621213SQ20121000968
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张俊杰, 段蕊, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所, 淮海工学院