专利名称：一种燕窝生物素的提取及检测方法
技术领域：
本发明涉及燕窝生物素提取及检测方法，具体的，涉及燕窝生物素的快速提取及高效薄层检测分析方法。
背景技术：
燕窝主产于马来西亚和印尼，是ー种极为名贵的中药材和保健品原料，具有养阴润燥、补中益气、入胃补脾和化痰止咳的功能。燕窝中的唾液酸，也是ー种有效防止流感病毒的天然产物，从而加强免疫系统的功能。燕窝的主要成分有蛋白质(62 63%)、碳水化合物05. 62 27.沈%)、灰分0.1%)和油脂(0. 14 1.观%)。燕窝的主要氨基酸有天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和半胱氨酸等。由于燕窝的营养价值很高而产量少，消费者需求日益増加，其价格也越来越昂贵，ー些商贩通过染色、漂白，或以银耳、猪皮、 琼脂、果胶等掺假伪造获取暴利。过去鉴定燕窝真假的方法主要是检测氨基酸、蛋白质和唾液酸的含量，由于检测指标少，而掺伪的人又能达到某些指标，所以燕窝真伪的分辨陷入尴尬的境地。因此，单ー或两种简单的鉴别手段已无法判断燕窝产品真伪及优劣，必须采用多种手段结合，通过多种检测指标和检测结果的综合分析以获得正确的检测結果。生物素含量的检测可以作为鉴定真假燕窝的方法之一。这之前人们还未对燕窝里的生物素含量进行过检測，人们曾对除燕窝以外的其它材料检测过生物素的含量，其方法有微生物法、高效液相色谱法、气相色谱法、ELISA法和荧光法等，其中微生物法和高效液相色谱法是最常用的方法。然而，微生物方法操作麻烦和耗时(检测ー个样品需2 3天的时间)，而高效液相方法投资大、溶剂用量大、成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供ー种操作简单、快速、准确、可靠的燕窝生物素的提取及检测方法。本发明目的可通过以下技术措施来实现 该方法按如下步骤进行
a.取燕窝除杂、烘干碎成粗粉，按照1公斤燕窝粉与25 40升ニ甲基甲酰胺的配比于 75 °C 95 aC水浴上搅拌提取1 2h，得提取液；
b.将提取液于高速离心机中离心，取离心液加入等体积量乙醇，在50 65て条件下旋转蒸发浓縮，得样品液；
c.取样品液15μ 1点在高效薄层板上，用氯仿丙酮甲醇冰乙酸=1.5-2. 5 1. 5-2. 5 1-2 0. 01-0. 1体积份比混合而成的展开剂在展开缸内展开，控制展距为6cm，并采用外标一点法点1 μ 1生物素标准品溶液，同时展开；
d.展开结束后取出展板晾干，然后用0.05%的高锰酸钾溶液喷雾染色，再将板放入 100-120て的烘箱中干燥8 12min，取出板后冷却；e.将染色冷却好的展板放在薄层扫描仪上，以400nm吸收波长进行扫描，得燕窝中的生物素含量。标准曲线的绘制
取Sigma公司销售的生物素标准品溶解于ニ甲基甲酰胺，浓度分别为0.4，0.99， 1. 48，2. 51，3. 19 mg/ml，在高效薄层板上各点1 μ 1，用Camag薄层扫描仪3，以400nm的吸收波长扫描，经扫描仪的软件Wincats 1.4. 1统计，得到的线性方程Y = 397. 891+4. 499X。 相关系数 r = 0.9995，RSD = 1. 07 %。2、燕窝生物素含量检测的准确度和可靠性 1)板内变异和板间变异
制备1. 48 mg/ml生物素标准溶液，在同一块高效薄层板上点四个点，每点为1 μ 1，分别在0，2，4和6h扫描测量，RSD=L 22%。在板上分別滴1 μ 1即1. 48mg/ml和3. 19 mg/ml标准品溶液早晚扫描定量，共测定2天。测得板内变异分别为0.56，1. 17，0.78和1. 02%，而板间变异分别为1.66,0. 55, 0. 46 和 1. 03%。2)加样回收率
向提取配制的样品液中，加50，100和150%的生物素标准品，其加样平均回收率为 99. 12%ο
表-1精确度
麵 (含量)醜 《小时)錄醒親IoDi^ilRSDtLffl UgO7UBZ.2571· 士亂 43L222f im 754I 9LI5i7123.5
表-2板内变异和板间变异
斑点(含量)峰面积SDRSD%板内1. 48 710939. 880. 56717084. 021. 173. 19 14491112.690. 7814398. 67146. 661. 02板间1. 48 7134. 67118. 091. 667078. 3338. 800. 553. 19 14484. 6766. 000. 4614491. 33149. 371. 03
表-3加样回收率
添加(％)获得(％)回收(％)平均回收(％)5049. 298. 499. 1210099. 799. 权利要求
1. 一种燕窝生物素的提取及检测方法，其特征在于该方法按如下步骤进行a.取燕窝除杂、烘干碎成粗粉，按照1公斤燕窝粉与25 40升二甲基甲酰胺的配比于 75冗 95冗水浴上搅拌提取1 池，得提取液；b.将提取液于高速离心机中离心，取离心液加入等体积量乙醇，在50 65T条件下旋转蒸发浓缩，得样品液；c.取样品液15μ 1点在高效薄层板上，用氯仿丙酮甲醇冰乙酸=1.5-2. 5 : 1. 5-2. 5 :1-2 0. 01-0. 1体积份比混合而成的展开剂在展开缸内展开，控制展距为6cm，并采用外标一点法点1 # 1生物素标准品溶液，同时展开；d.展开结束后取出展板晾干，然后用0.05%的高锰酸钾溶液喷雾染色，再将板放入 100-120 dC的烘箱中干燥8 12min，取出板后冷却；e.将染色冷却好的展板放在薄层扫描仪上，以400nm吸收波长进行扫描，得燕窝中的生物素含量。
全文摘要
本发明提供一种燕窝生物素的提取及检测方法，是采用二甲基甲酰胺从燕窝中提取生物素，经离心除杂和浓缩制备样品液，然后与生物素标准品液采用外标一点法，在涂有硅胶60F254高效薄层板上展开，展开剂为按比例配制的氯仿、丙酮、甲醇和冰乙酸的混合液。展完后的展板用0.05%的高锰酸钾溶液喷雾染色，经干燥后以400nm吸收波长进行薄层扫描，从而得到燕窝中生物素含量。该发明方法简单、准确、快速、稳定可靠，克服了目前所采用的微生物法检测步骤繁琐、耗时长，高效液相色谱法投资大、溶剂用量大、成本高等缺点。
文档编号G01N30/94GK102539616SQ201210031728
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者刘代成, 张北山 申请人:山东师范大学