专利名称：基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制作方法
基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒。 [背景技术]视黄醇结合蛋白属于Lipocalin超家族,相对分子质量约21 X IO3,配体主要是全反式视黄醇，即维生素A，Kd = 20Nm，结合位点I。RBP主要负责结合、转运血浆中的维生素A0外源性的维生素A进入血液循环系统后，首先与RBP结合，视黄醇-RBP复合体进一步与甲状腺素运载蛋白(transthyretin, TTR)形成三元复合物而被转运。肝脏是维生素A储存及RBP合成与分泌的主要场所。RBP的分泌严格受机体视黄醇含量的影响。有关RBP突变体和基因敲除小鼠的研究发现，血液中RBP的缺失，除了引起视觉功能障碍外，对机体其他方面功能没有明显影响，因此，RBP可能只是在膳食维生素A缺乏时为机体视黄醇的代谢稳定提供一种保障。与疾病的关系RBP是一种可自由通过肾小球、重吸收率很高的小分子量蛋白，在健康人尿中含量很低。糖尿病肾病患者早期就出现肾小管损害，尿RBP是诊断早期糖尿病肾病的一个较敏感的指标；慢性肾功能衰竭(CRF)患者血中RBP大量积聚。RBP由肝细胞合成，当肝细胞损伤时，RBP合成受抑制，故检测血液RBP水平，可敏感地反映肝功能的改变。放免法检测发现，肝硬化和急、慢性肝炎的血清RBP水平均明显低于正常对照组，急性病毒性肝炎早期血清RBP含量下降比晚期更明显RBP与机体的营养状态RBP不仅参与视黄醇的运转，其分泌也严格受机体维生素A含量的影响，大量口服视黄醇可导致血液及肝脏RBP下降。维生素A的缺乏可改变血液中RBP含量并抑制肝脏分泌RBP,机体营养不良或应激反应时RBP可迅速下降。由于RBP的半衰期相对较短，变化早于前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)等且灵敏性更高，故可作为判断营养状态应激反应的指标诊断方法胶乳颗粒增强比池法(particle-enhancedturbidimetric immunoassay, PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了 ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
视黄醇结合蛋白检测方法，由最初免疫电泳的定性检测，到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测，以及到免疫比浊的自动化检测，发展十分迅速。目前，国内外免疫比浊法是最为普遍通用的方法。但是免疫比浊法原理基于抗体抗原免疫反应结合形成浊度，来检测血清中RBP的浓度。并没有采用检测信号方法技术，其最低检测限只能达到10mg/l。同时存在着开瓶稳定性不好、较易受溶血干扰等问题。在临床上只能用于肾功能的辅助诊断。本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种高灵敏度、稳定性好、准确度高、抗干扰能力强的视黄醇结 合蛋白检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明设计了一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1，试剂R2以及校准品，其中试剂Rl为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液30-60mmol/l, PH值为
7.2-7. 6 ;聚合物 60_95mmol/l ;乙二胺四乙酸二纳 6-1 3mmoI / I ；试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液35-60mmol/l, PH值为7. 2-7. 6 ；参考校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂
O.2-2. 2% ;稳定剂 1-10%。所述试剂R2中，聚苯乙烯乳胶粒子的直径为45_92nm。所述试剂Rl中，聚合物为乙二醇6000-8000 ;或为聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，聚
氧乙烯类多聚物。所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子采用物理吸附法，具体步骤为将羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳混合，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清，用胶乳稀释液稀释至I. 2-2. 5%。所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与聚苯乙烯乳胶粒子质量比1/20-5/10。所述的封闭液包括脱脂奶粉和甘氨酸。所述胶乳稀释液包括，35-60mmol/l, PH值为7. 2-7. 6磷酸盐缓冲液；
O.01% -O. I %脱脂奶粉，O. 9% 的 NaN3。本发明同现技术相比，采用聚苯乙烯胶乳包被视黄醇结合蛋白多克隆抗体，与待测标本(血清或血浆)中的视黄醇结合蛋白发生结合反应，形成免疫复合物，用光透射强度检测这种变化，以视黄醇结合蛋白标准品的校准曲线得出样本中目标检测物视黄醇结合蛋白的浓度。本发明采用纳米微球信号放大技术，使得试剂最低检测限检达到lmg/1，抗血红蛋白干扰达到了 500mg/dl，开瓶稳定性达到了 I个月。在临床上，不但能用于肾功能疾病的辅助诊断，同时也能用于营养不良的辅助诊断。具有很高的临床应用价值。图I为本发明试剂中5种不同含量的视黄醇结合蛋白参考标准的标准曲线。图2为普通免疫比浊法试剂中5种不同含量的视黄醇结合蛋白参考标准的标准曲线。图3为本发明试剂对照普通免疫比浊法试剂相关性曲线图。下面结合附图
对本发明作进一步描述。实施例I :试剂Rl
PH 值为 7. 4，Tris-Hcl 缓冲液45mmol/l
聚乙二醇 600085mmol/l
乙二胺四乙酸二钠8. 5mmol/l
NaN3O. 9%将上述各种成分在室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。
试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液35-60mmol/l，PH值为7. 2-7. 6 ;其制备方法如下称取直径为45nm的聚苯乙烯胶乳粒子，在经过浓度为45mmol/l，PH值为7. 4的Tris-Hcl缓冲液清洗后，与羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体以5 10的质量比混合，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体。加入封闭液，封闭2小时，封闭液的主要成分为O. I %脱脂奶粉和O. 2mm的甘氨酸。离心去上清，用胶乳稀释液稀释至1.5%，胶乳稀释液的主要成分PH值为7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3。参考校准品校准品制备将经过处理的牛血清，加入BAS O. 1%，NaN30. 9%得到校准品稀释液。用重组视黄醇结合蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品(O、5mg/1、15mg/
I、30mg/1、60mg/1、120mg/1)本实施例描述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表I。分析方法两点终点法，即试剂Rl，R2的用量分别为120ul和120ul，样本量3ul。120ul试剂Rl加入3ul样本于37C5min后加入120ulR2，即开始读点，反应5min后读取另一点；检测波长分别主波长570nm副波长800nm。表I :
—加人物空白管校准管质控管样品管蒸馏水__3ul____
~校准品I 3ul I
权利要求
1.一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1，试剂R2以及校准品7其中 试剂Rl为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液30-60mmol/l,PH值为7. 2-7. 6 ；聚合物60_95mmol/l ;乙二胺四乙酸二纳6-1 3mmoI / I ； 试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液 35-60mmol/l, PH 值为 7. 2-7. 6 ； 参考校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂O. 2-2. 2% ;稳定剂 1-10%。
2.根据权利要求I所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂R2中，聚苯乙烯乳胶粒子的直径为45-92nm。
3.根据权利要求I所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂Rl中，聚合物为乙二醇6000-8000 ;或为聚乙二醇6000-8000，葡聚糖，聚氧乙烯类多聚物。
4.根据权利要求I所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子采用物理吸附法，具体步骤为将羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳混合，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清，用胶乳稀释液稀释至1.2-2. 5%。
5.根据权利要求4所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与聚苯乙烯乳胶粒子质量比1/20-5/10。
6.根据权利要求4所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的封闭液包括脱脂奶粉和甘氨酸。
7.根据权利要求4所述的基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述胶乳稀释液包括，35-60mmol/l，PH值为7. 2-7. 6磷酸盐缓冲液；0. 01% -O. 1%脱脂奶粉，O. 9%的NaN3。
全文摘要
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1，试剂R2以及校准品，其中试剂R1为Tris-HCl缓冲体系，包括Tris-HCl缓冲液，聚合物，乙二胺四乙酸二钠。试剂R2，包括羊抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体包被聚苯乙烯乳胶粒子致敏颗粒；磷酸盐缓冲液。参考校准品，包括牛血清基质；根据牛血清基质的体积用量百分比，还包括防腐剂0.2-2.2％，稳定剂1-10％。本发明同现技术相比，不但能用于肾功能疾病的辅助诊断，同时也能用于营养不良的辅助诊断。具有很高的临床应用价值。
文档编号G01N33/68GK102621332SQ20121009953
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者房君江, 李子樵 申请人:上海蓝怡科技有限公司