专利名称：工业循环水中异养菌含量的检测方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，涉及一种工业循环水中异养菌含量的检测方法。
背景技术：
异养菌是指在营养类型方面靠有机物营养作为合成自身菌体的碳源、靠有机物氧化产生化学能进行代谢的一类混合菌群。在工业循环冷却水中，异养菌不仅生长繁殖最快，而且为数最多，基本上代表了水中全部细菌的数量，所以一般测定时，常以异养菌的数量代表水中的细菌总数。这类菌群能产生致密的粘液，粘附水中细小的悬浮物以及其他丝状菌、霉菌、藻类、原生动物等，从而形成黏泥。大量生物黏泥的积聚会堵塞管道、腐蚀设备、影响换热效率、恶化水质、影响生产。因此，异养菌的检测非常重要，是工业循环冷却水的一项重要控制指标。目前，国内循环冷却水系统中异养菌的检测方法，主要是国家技术监督局颁发的GB/T14643. 1-2009平皿计数法。该法需将操作过程所用的实验试剂、实验器皿进行杀菌处理，水样接种及灌皿的过程均需在无菌条件下进行，整个操作过程要求严格。在(29±1)°C恒温条件，细菌的培养时间下为72h。方法的准备工作繁多，加上需要很多设备，如高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱等，限制了它在行业中的广泛使用。培养时间较长这个因素更是导致了结果滞后，不能及时反映出当前水质微生物情况，尤其在水质恶化、已采取措施对水进行处理后，异养菌是否超标，急需快速了解处理结果时显得无能为力，不能满足工业循环冷却水处理实际工作的需要。目前国内大部分工厂都没有能力测定循环水中异养菌的含量，只是凭经验或直觉使用各种杀菌剂来控制水中异养菌含量，对杀菌剂的使用浓度、用后的效果缺乏跟踪监测，带有相当大的盲目性，往往过度使用药剂造成大量浪费，或在循环水系出现明显的菌藻滋生现象时才匆忙采取补救措施。经过对现有技术的相关文献检索，目前国内也有对标准平皿计数法进行改进的方法，有些是针对标准平皿计数法的准备步骤繁多进行改进，例如何世梅等(何世梅，曹立群，田剑临，余伟民，易绍金，平皿计数法检测异养菌存在的问题及解决办法，工业水处理，Vol. 23, No. 6, Jun.，2003)提出一种测试瓶法检测异养菌，采用绝迹稀释法将欲测定的水样用ImL无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释后，入恒温箱(30±0. 5) °C培养3d。这种方法的工作量虽然比标准平皿计数法略小，但测定得出结果的时间仍然很长。另外一些是对培养基进行改进，在标准平皿计数法的营养琼脂中加入显色剂TTC(氯化三苯基四氮唑)，其原理是TTC与含菌水样接触后，无色的TTC由于接受活菌中脱氢酶脱下来的氢而本身还原成鲜红色的TF(2，3，5-三苯甲基)，即每个平板上会长出一个个肉眼清晰可见的鲜红色菌落，很容易识别和计数。这种方法的优点是能够减小误差，但是测定时间仍然很长，不利于及时监测循环冷却水的水质状况。也有利用这种在培养基中加入显色剂的方法而研制的试纸来测定水样中的异养菌含量，它改善了标准平皿计数法准备工作繁多的缺点，将其在水样中浸泡5s后取出放入培养箱中培养2d，操作简单，目前应用较广泛，但测定时间仍然很长。
发明内容
本发明的目的是克服工业循环水中异养菌的测量时间过长而导致结果滞后，从而影响工厂对循环水水质状况或水处理效果做出及时判断的缺陷，提供一种检测异养菌含量的方法，由于工业循环冷却水中的细菌种类和数量较为恒定，检测手段可较为专一，将细菌体内的蛋白质水解可得到大量的氨基酸，利用茚三酮与氨基酸的的显色反应在特定波长下有一定的吸光度，通过分析细菌的氨基酸来推算异养菌数，方法快速、准确、可靠。具体方法为通过对水样中的细菌进行截留富集，对富集的细菌进行裂解释放出蛋白质，再水解为氨基酸，用茚三酮对氨基酸进行反应显色，根据测得的吸光度来确定水样中异养菌含量。整个测定过程采用常规试剂，时间不超过2h，相对于平皿计数法，可以快速准确获得水中的异养菌含量，且方法过程易于仪器化和自动化，有利于在工业循环水处理及监测中推广。本发明的目的是通过以下方式实现的—种工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于，具体步骤如下a)将水样过滤，将水样中的细菌富集在载体上；b)将富集细菌的载体转移至强碱性溶液中，水浴加热得到水解液；该步骤使菌膜裂解释放出蛋白质，并完全水解为氨基酸；
c)将水解液用酸中和；d)取中和后得到的裂解液、pH缓冲液和茚三酮显色剂混匀得到显色液，与空白对照液同置于恒温水浴中加热30-40min ；e)将显色液冷却至室温，在波长为562nm处测量吸光度，并将其与“吸光度_异养菌含量”标准曲线比较得出水样中异养菌的含量。所述的载体为微孔滤膜，富集方式为过滤截留。优选微孔滤膜孔径为
O.22-0. 45 μ m,尼龙材质。所述的强碱性溶液为pH值为10-14的碱性溶液，碱性溶液优选I. OOmo 1/1的NaOH溶液。所述的步骤b)中水浴加热温度范围为95_100°C。所述的步骤c)中所用的酸为pH值为1-4的酸性溶液，酸性溶液优选I. OOmol/IHCl溶液。所述的步骤d)中裂解液、pH缓冲液和茚三酮显色剂的三者混合用量比例是2:1-3: 2.5-3。所述的步骤d)中pH缓冲液的pH = 5. 9,是通过45ml l/15mol/l磷酸二氢钾溶液与5mll/15mol/l的磷酸氢二钠溶液混合配制的。茚三酮显色剂是通过以下方法制备得到的0. 6g果糖与I. Og却三酮溶于IOOml蒸懼水中。“吸光度-异养菌数量”的标准曲线绘制方法如下分别取不同体积的水样经裂解、水解、中和、显色后，测量吸光度；同时用平皿计数法测定该水样中的异养菌含量，则可得到不同体积中的异养菌数量，以异养菌数量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，平皿计数法测定水样中异养菌含量参照GB/T14643. 1-2009《工业冷却循环水中菌藻的测定方法第一部分黏液形成菌的测定平皿计数法》。与现有技术比较本发明的有益效果本发明测定方法快速、简便、准确，可在短时间内获取循环冷却水中异养菌的含量，而且本发明方法便于实现仪器化和自动化，易于推
广应用。
图I为吸光度-单位体积水中异养菌数的标准曲线。
具体实施例方式以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。实施例I : 配制实验所需试剂茚三酮试剂0. 6g果糖与I. Og茚三酮溶于IOOml蒸馏水中，用棕色容量瓶贮存；pH缓冲液配制pH = 5. 9,45mll/15mol/l磷酸二氢钾溶液与5mll/15mol/l的磷酸氢二钠溶液；按照标准方法准确配制I. OOmol/lNaOH溶液及I. OOmol/lHCl溶液；取循环水体积为IOOml (水样来源是炼油厂使用的循环冷却水)a)将水样采用过滤方式，将水样中的细菌富集在尼龙材质，滤膜孔径为0. 22μπι的微孔滤膜上；b)将富集细菌的载体转移至5mll. OOmol/lNaOH溶液中，100°C水浴加热50min得到水解液；该步骤使菌膜裂解释放出蛋白质，并完全水解为氨基酸；c)将水解液用I. OOmol/lHCl溶液中和得到裂解液；d)取中和后得到的裂解液、pH5. 9缓冲液和茚三酮显色剂按照体积比2 I 2. 5比例混匀得到显色液，与空白对照液同置于恒温水浴中加热35min ；e)将显色液冷却至室温，通过紫外分光光度计，在波长为562nm条件下测量吸光度，并将其与“吸光度-异养菌数量”标准曲线比较得出水样中异养菌的含量。实施例2 茚三酮试剂0. 6g果糖与I. Og茚三酮溶于IOOml蒸馏水中，用棕色容量瓶贮存；pH缓冲液配制pH = 5. 9,45mll/15mol/l磷酸二氢钾溶液与5mll/15mol/l的磷酸氢二钠溶液；按照标准方法准确配制I. OOmol/lNaOH溶液及I. OOmol/lHCl溶液；取循环水体积为IOOml (水样来源是比实施例I晚7天的炼油厂使用的循环冷却水)a)将水样采用过滤方式，将水样中的细菌富集在尼龙材质，滤膜孔径为0. 45μπι的微孔滤膜上；b)将富集细菌的载体转移至5mlI. OOmol/lNaOH溶液中，95°C水浴加热60min得到水解液；该步骤使菌膜裂解释放出蛋白质，并完全水解为氨基酸；c)将水解液用I. OOmol/lHCl溶液中和得到裂解液；d)取中和后得到的裂解液、pH 5. 9缓冲液和茚三酮显色剂按照2 3 3体积比混匀得到显色液，与空白对照液同置于恒温水浴中加热40min ；
e)将显色液冷却至室温，通过紫外分光光度计，在波长为562nm条件下测量吸光度，并将其与“吸光度-异养菌数量”标准曲线比较得出水样中异养菌的含量。实施例3 “吸光度-异养菌数量”标准曲线的绘制取相同间隔不同体积的水样，根据测定水样的测定步骤，同时参照GB/T 14643. 1-2009测定异养菌的平皿计数法对水样中的异养菌进行测定，从而可确定不同体积水样中的异养菌数量，以异养菌数量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，循环水样来源同实施例1，具体如下参照GB/T14643. 1-2009中的标准平皿计数法，方法具体如下 I、培养基的配制牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，将上述试剂加约950ml水在电炉上加热溶解，趁热用四层医用脱脂纱布过滤，并用热水补充至1000ml，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至7. 2±0. 2，并分装在三角瓶中，每瓶的装量不可超过其容量的2/3，塞上棉花，用废旧报纸包好，放入蒸汽压力锅于(121 土 I) °C中灭菌15min。2、无菌稀释水的准备生理盐水的配制称取8. 5g氯化钠于IOOOml水中溶解，将其分装于三角瓶中于(121±1)°C灭菌15min。3、刻度吸管、培养皿的灭菌将包扎好的刻度吸管及培养皿于(160±2)°C的电热干燥箱中灭菌2h。4、无菌箱(室)的灭菌将实验所用的无菌稀释水、无菌培养基、无菌刻度吸管等实验用品放入无菌箱(室)内，打开紫外灯灭菌30min。5、水样的稀释和接种用十倍稀释度法稀释实施例I循环水样，将不同稀释度的循环水样分别接种到无菌培养皿中，每个稀释度重复接种3 5个皿，每皿1ml，另取一组培养皿不接水样做空白。将灭过菌的培养基冷却至(45 ± I) V，将其灌入培养皿内，每皿灌约15 20ml，并使水样与培养基混合均匀。6、待培养皿中培养基固化之后将培养皿倒置于生化培养箱中，(29±1)°C培养72h。通过标准平皿法得出炼油厂循环水样中的异养菌含量，即可得到不同体积循环水中的异养菌数量。分别抽取100ml、200ml、300ml、400ml、500ml循环冷却水，按照实施例I的方法分
别测其吸光度值。根据标准平皿法同步测得循环冷却水中异养菌含量为3X IO4个/ml，则可得到不同体积中的异养菌数量。以异养菌数量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制该水样的标准曲线，该标准方法只用于第一次校正，待测水样的异养菌检测方法，按照实施例I方法实施，根据吸光度值在标曲中所对应的异养菌数量即可得到水样中的异养菌含量。图I所示标准曲线中的异养菌数量如下表
V/ml~ 00~200 ~300400~500
~0.0440.089 O. 122 O. 1610.212异养菌数量(个)I~3 X IO6 ~6 X IO6~~9 X IO6~~I. 2 X IO7~I. 5 X IO7~实施例I和实施例2中循环水样测得吸光度值分别为O. 150和O. 175，通过“吸光度-异养菌数量”标准曲线上可分别得出IOOml中的异养菌数量为IlX IO7个、I. 3X IO7个，则不同时期的循环水样中的异养菌含量分别为11 X IO5个/ml，I. 3X IO7个/ml。
权利要求
1.一种工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤 a)将水样过滤，使水样中的细菌富集在载体上； b)将富集细菌的载体转移至强碱性溶液中，水浴加热得到水解液； c)将水解液用酸中和； d)取中和后得到的裂解液、pH缓冲液和茚三酮显色剂混匀得到显色液，与空白对照液同置于恒温水浴中加热30-40min ； e)将显色液冷却至室温，在波长为562nm处测量吸光度，并将其与“吸光度_异养菌数量”标准曲线比较得出水样中异养菌的数量。
2.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的载体为微孔滤膜，富集方式为过滤截留。
3.根据权利要求2所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的微孔滤膜孔径为O. 22-0. 45 μ m,尼龙材质。
4.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的强碱性溶液为pH值为10-14的碱性溶液，碱性溶液优选I. OOmo 1/1的NaOH溶液。
5.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的步骤b)中水浴加热温度范围为95-100°C。
6.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的步骤c)中所用的酸为为pH值为1-4的酸性溶液，酸性溶液优选I. 00mol/l HCl溶液。
7.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的步骤d)中裂解液、pH缓冲液和茚三酮显色剂的三者混合用量体积比例为2 1-3 2.5-3。
8.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的步骤d)中pH缓冲液，pH = 5. 9，是通过45mll/15mol/l磷酸二氢钾溶液与5mll/15mol/l的磷酸氢二钠溶液混合配制的。
9.根据权利要求I所述的工业循环水中异养菌含量的测定方法，其特征在于所述的步骤d)中茚三酮显色剂是通过以下方法制备得到的0. 6g果糖与I. Og茚三酮溶于IOOml蒸馏水中。
全文摘要
本发明公开了一种工业循环水中异养菌含量的检测方法，该方法通过对水样中的细菌进行截留富集，对富集的细菌进行裂解释放出蛋白质，再水解为氨基酸，用茚三酮对氨基酸进行反应显色，根据测得的吸光度与“吸光度-异养菌数量”标准曲线比较，得出一定体积工业循环水中异养菌的数量。相对于国标平皿计数法，本发明测定方法快速简便，可在短时间内获取循环冷却水中异养菌的含量，且本发明方法便于实现仪器化和自动化，易于推广。
文档编号G01N21/31GK102618621SQ20121012123
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者唐美华, 张之翼, 张琳昀, 陈国松, 魏寒桥 申请人:南京工业大学