Il-18结合蛋白的制作方法

专利名称：Il-18结合蛋白的制作方法
IL-18结合蛋白本申请是申请号为201010274020. X、申请日为2004年11月12日的发明专利的分
案申请。相关申请的交叉文献本申请要求2003年11月12日申请的美国申请No. 10/706, 689的优先权利益。技术领域 本发明涉及白细胞介素18(IL_18)结合蛋白，特别涉及它们在急性和慢性炎症疾病的预防和/或治疗中的用途。
背景技术：
最早在1989年白细胞介素-18 (IL-18)被描述为Y-干扰素诱导因子(IGIF)，并且是促炎症细胞因子，除了具有诱导Y-干扰素的能力外，还具有多方面功能。这些生物学性能包括NF- K b的激活，Fas配体表达，CC和CXC趋化因子的诱导，感受态人免疫缺陷病毒的增加的产生。由于IL-18有诱导T细胞和巨噬细胞中Y-干扰素产生的功能，它在Thl-型免疫应答中和參与先天和后天免疫性中起着重要作用。IL-18就其结构和功能来说涉及IL-I家族。有关IL-18结构，功能和生物学活性，參见，例如Dinarello，C.等(1998)J. Leukoc. Biol. 63 :658-654 ；Dinarello, C. A. (1999)Methods 19 121-132 ;和 Dinarello,C.A. (1999)J. Allergy Clin. Immunol. 103 :11-24 ; (Mclnne s, I. B.等(2000)ImmunologyToday 21 :312-315 ；Nakanishi, K.等(2001)Ann. Rev. Tmmunol 19 :423474。细胞内IL-18-原在内毒素-刺激的细胞中经胱天蛋白酶I (Ghayur，T.等，(1997) Nature 386 :619-623 ；Gu, Y.等，(1997) Science 275 :206-209)，在 Fas-L 或细菌DNA刺激细胞中经胱天蛋白酶4，5和6蛋白酶解加工成18kDa活性形式(Tsutsui，H.等，(1999) Immunity 11 :359-67 ； Ghayur, T.，没有出版的 Observations)。IL-18-原还被其他蛋白酶解加工，例如嗜中性白细胞蛋白酶3(Sugawara, S.等，(2001) J. Immunol. , 167,6568-6575)，胱天蛋白酶 3 (Akita, K.等，(1997) J. Biol. Chem. 272，26595-26603)，和丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶和组织蛋白酶(Gracie J.A.,等，(2003) Journal of LeukocyteBiology 73，213-224)。人和鼠IL-18没有常规的前导序列，并且细胞成熟IL-18释放的原理还不十分清楚。IL-18的生物活性通过IL-18与由两个亚基构成的异ニ聚体IL-18受体(IL-18R)结合而介导α-亚基(IL-1R家族中的ー员，也称作IL-IR-相关蛋白-1或IL-IRrpl)和β-亚基(也称作IL-18R辅助蛋白，IL-18AP或AcPL)。IL_18Ra亚基直接结合IL-18，但是不能信号传导。β_亚基本身不结合IL-18，但是与a-亚基联合形成信号转导必需的高亲和性受体(Kd = 0. 3nM) (Sims, J. E.，(2002) Current Opin Tmmunol. 14 :117-122)。通过IL-18 α β复合体的IL-18信号传导类似于IL-1R和Toll样受体(TLR)系统。IL-18R信号传导利用信号传导分子，例如MyD88，IRAK, TRAF6，并且产生和IL-I产生的相似的响应(例如，NIK, IkB激酶，NF-kB, JNK和p38MAP激酶的激活)。介导IL-18生物活性对IL-18R α和信号传导分子的需要已经分别使用IL-18R α -亚基(Hoshino K.，等(1999) J. Immunol. 162 :5041-5044 ；) ,MyD88 (Adachi O.，等(1998) Immunity 9 :143-150)或IRAK(Kanakaraj P.，(1999) J. Exp. Med. 189 :1129-1138)敲除证实了。结合IL-18的抗体是本领域公知的。EP 0974600公开了能中和IL-18的小鼠抗体。抗IL-18人抗体在PCT公开WO 0158956中公开，这里引作參考。本发明提供了能以高亲合力结合IL-18，结合并中和IL-18的结合蛋白质的新的家族，人抗体，及其片段。发明概述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是人IL-18的抗体，以及制备和使用这样的蛋白质的方法。本发明的ー个方面是提供使用IL-18调谐子调节基因表达的方法。 本发明的ー个方面是提供包括能结合人IL-18的抗原结合结构域的结合蛋白质。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括至少ー个包括选自下面的氨基酸序列的⑶R CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:42)，其中X1 是5，N，H，R，或 Y;X2iY，G，R，S，_C;X3 是 W，G，Y，D，S，V，或 I ;X4il，H，W，Y，M，L，_D;X5 是6，Y，S，N，或 H;X6是W，或者不存在；和X7是T，S，G，或者不存在；CDR-H2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 43),其中；X1 是 F，Y，H，S，或 V;X2il，_F;X3 是 Y，S，或 W ;X4 是 P，Y，或 S ;X5iG，S，R，_D;X6 是 D，或 G;X7 是 S，T，G，或 R;X8iE，T，I，或 N;X9 是 T，Y，N，I，K，或 H;X10 是 R，Y，或 S ;X11 是 Y，N，或 S ;X12 是 S，P，A，或 V ;X13 是 P，S，或 D ;X14iT，L，_S;X15 是 F，K，或 V ;X16 是0，S，或 K;和X17是6，或者不存在；CDR-H3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO:44)，其中；XiiV7DiEiSi-C;X2 是6，R，D，S，K，L，Y，或 A ;X3 是 S，G，Y，或 R ;X4 是 G，S，Y，N，T，或 D;父5是胃，S，A，G，Y，或T ;X6 是 Y，G，S，F，W，或 N;X7 是 P，S，F，Y，V，G，W，或 V;X8iY，F，D，P，M，I，或 N;X9iT，W，D，L，Y，E，P，F，_G;Xltl 是 F，D，Y，H，V，Y，或者不存在;X11是0，Y，F，L，或者不存在；X12是I，D，Y，或者不存在；X13是Y，或者不存在；X14是Y，或者不存在；X15是G，或者不存在；X16是M,或者不存在；X17是D，或者不存在；和X18是V，或者不存；CDR-L1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 45),其中；X1 是 R，或 K ;X2 是 A，G，或 S ;X3 是 S ;X4 是 E，R，Q，或 H;X5 是5，I，T，或 N;X6 是 I，V，L，或 F ;X7 是 S，G，L，N，或 R;X8 和 S，G，Y，R，N，H，或 D ;X9 是 N，G，Y，R，或 S;X1。是 L，Y，S 或 D ;X11 是 A，L，N，V，G，或 D ;X12是八，N，E，K，G，或者不存在；X13是K，T，N，或者不存在；X14是N，Y，T，或者不存在；X15是Y，L，或者不存在；X16是L，C，Y,或者不存在；和X17iA，D，或者不存在；CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQID NO 46)，其中
X1 是1\ G，S，W，或 E ;X2iA，V，T，I，或 L;X3 是 S，或 F;X4 是 T，I，N，S，R，或 Y;X5 是 R，或 L ;X6 是 A，Q，E，或 F ;和X7 是 T，或 S;和CDR-L3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:47)，其中X1 是 Q，或 M ;X2 是 Q，H，或 Y ;X3 是 Y，N，G，S，或 R ;X4iN，H，Y，D，G，V，L，_I;X5iN，G，I，Y，S，Q，F，_E;X6 是 W，S，T，L，I，或 F ;X7 是 P，L，T，D，或 I ;X8 是 S，L，P，C，W，I，或 F ;X9是I，T，S，或者不存在；和Xltl是T，或者不存在。优选地，抗原结合结构域包括至少ー个包括选自由下面的残基构成的组的氨基酸序列的 CDR SEQ ID NO. 6 的残基 31-35 ；SEQ IDN0. 6 的残基 50-66 ；SEQ ID NO. 6 的残基 99-110 ；SEQ ID NO. 7 的残基 24-34 ；SEQ ID NO. 7 的残基 50-56 ；SEQ ID NO. 7 的残基 89-98;SEQ ID NO. :8 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :8 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :8 的残基 100-110 ;SEQ ID NO. :9 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :9 的残基 21-27 ;SEQ ID NO. :9 的残基 90-98 ；SEQ ID NO. :10 的残基 31-35 ；SEQ ID NO. :10 的残基 50-65 ；SEQ ID NO. :10 的残基 98-107 ；SEQ ID NO. 11 的残基 24-34 ；SEQ ID NO. 11 的残基 50-56 ；SEQ ED NO. 11的残基 89-97;SEQ ED NO. : 12 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. : 12 的残基 52-67 ;SEQ ID NO.12 的残基 100-108 ；SEQ ID NO. :13 的残基 24-35 ；SEQ ID NO. :13 的残基 51-57 ；SEQ EDNO. :13 的残基 90-98 ;SEQ ID NO. : 14 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :14 的残基 50-66 ;SEQ IDNO. :14 的残基 99-111 ;SEQ ID NO. : 15 的残基 24-40 ;SEQ ID NO. : 15 的残基 56-62 ;SEQID NO. :15 的残基 95-103 ;SEQ ID NO. :16 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :16 的残基 52-67;SEQ ID NO. :16 的残基 100-109 ;SEQ ID NO. : 17 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :17 的残基51-57 ；SEQ ID NO . : 17 的残基90-98 ;SEQ ID NO. :18 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :18 的残基20-36 ；SEQ ID NO. : 18 的残基 99-108 ;SEQ ID NO. : 19 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. :19 的残基 50-56 ；SEQ ID NO. :19 的残基 89-97 ；SEQ ID NO. :20 的残基 31-35 ；SEQ ID NO. :20 的残基52-67 ;SEQ ID NO. :20 的残基 100-108 ;SEQ ID NO. :21 的残基24-35 ;SEQ ID NO. 21的残基51-57;SEQ ID NO. :21 的残基90-98 ;SEQ ID NO. :22 的残基31-35 ;SEQ ID NO. :22的残基 50-66;SEQ ID NO. :22 的残基 99-116 ;SEQ ID NO. :23 的残基 24-39 ;SEQ ID NO.23 的残基 55-61 ;SEQ ID NO. :23 的残基 94-102 ;SEQ ID NO. :24 的残基 31-37 ;SEQ IDNO. 24 的残基 52-67 ；SEQ ID NO. :24 的残基 100-109 ；SEQ ID NO. :25 的残基 24-35 ；SEQID NO. :25 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :25 的残基 90-98 ;SEQ ID NO. :26 的残基 31-37 ;SEQID NO. 26 的残基 52-67 ；SEQ ID NO. :26 的残基 100-109 ；SEQ ID NO. :27 的残基 24-35 ；SEQ ID NO. :27 的残基51-57 ;SEQ ID NO. :27 的残基90-98 ;SEQ ID NO. :28 的残基31-37;SEQ ID N O. 28 的残基 52-67 ；SEQ ID NO. :28 的残基 100-108 ；SEQ ID NO. :29 的残基24-35 ；SEQ ID NO. :29 的残基 51-57 ；SEQ BD NO. :29 的残基 90-98 ；SEQ ID NO. :30 的残基 31-37;SEQ ID NO. :30 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :30 的残基 99-109 ;SEQ ID NO. 31的残基 24-35;SEQ ID NO. :31 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :31 的残基 90-98 ;SEQ ID NO.32 的残基 31-37 ；SEQ ID NO. :32 的残基 52-67 ；SEQ ID NO. :32 的残基 100-109 ；SEQ IDNO. :33 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :33 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :33 的残基 90-98 ;SEQ IDNO. :34 的残基 31-37SEQ ID NO. :34 的残基52-67 ;SEQ ID NO. :34 的残基 100-108 ;SEQ IDNO. :35 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :35 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :35 的残基90-98 ;SEQ IDNO. :36 的残基31-35 ;SEQ ID NO. :36 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :36 的残基99-116 ;SEQ ID、NO. :37 的残基24-39 ;SEQ ID NO. :37 的残基 55-61 ;SEQ ID NO. :37 的残基94-102 ;SEQ IDNO. :38 的残基31-35 ;SEQ ID NO. :38 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :38 的残基99-108 ;SEQ IDNO. :39 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :39 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :39 的残基 90-98 ;SEQ IDNO. :40 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :40 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :40 的残基 97-109 ;SEQID NO. 41 的残基 24-40 ；SEQ ID NO. 41 的残基 56-62 ；SEQ ID NO. 41 的残基 95-103。优选地，结合蛋白包括至少3个⑶Rs。在另个优选实施方案中，结合蛋白包括一个Vh结构域。优选地，Vh结构域包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO :10 ；SEQ ID NO :12 ；SEQ IDNO 14 ；SEQ ID NO :16 ；SEQ ID NO :18 ；SEQ ID NO :20 ；SEQ ID NO :22 ；SEQ ID NO :24 ；SEQIDNO 26 ；SEQ ID NO :28 ；SEQ ID NO :30 ；SEQ ID NO :32 ；SEQ ID NO :34 ；SEQ ID NO :36 ；SEQID NO :38;和SEQ ID NO :40。在另ー个实施方案中，结合蛋白包括ー个九结构域。优选地，^结构域包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ IDNO :13 ；SEQ ID NO :15 ；SEQ ID NO :17 ；SEQ ID NO :19 ；SEQID NO :21 ；SEQ ID NO :23 ；SEQ IDNO 25 ；SEQ ID NO :27 ；SET M NO :29 ；SEQ ID NO :31 ；SEQ ID NO :33 ；SEQ ID NO :35 ；SEQ IDNO 37 ；SEQ ID NO :39 ;和 SEQ ID NO :41。在一个优选的实施方案中，结合蛋白包括一个Vh和ー个ん结构域。更优选地，结合蛋白包括包括选自下面的氨基酸序列的Vh结构域SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ IDNO 10 ；SEQ ID NO :12 ；SEQ ID NO :14 ；SEQ ID NO :16 ；SEQ ID NO :18 ；SEQ ID NO :20 ；SEQID NO 22 ；SEQ ID NO :24 ；SEQ ID NO :26 ；SEQ ID NO :28 ；SEQ ID NO :30 ；SEQ ID NO :32 ；SEQ ID NO 34 ；SEQ ID NO :36 ；SEQ ID NO :38 ;和 SEQ ID NO :40 和包括选自下面的氨基酸序列的 Vl 结构域SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQID NO 11 ；SEQ ID NO :13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO :17 ；SEQ ID NO :19 ；SEQID NO :21 ；SEQ ID NO :23 ；SEQID NO :25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO :29 ；SEQID NO :31 ；SEQ ID NO :33 ；SEQID NO :35 ；SEQ ID NO :37 ；SEQ ID NO 39;和SEQ ID NO 410最优选地，结合蛋白包括包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的\结构域和包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Vh结构域。在另ー个实施方案中，结合蛋白进ー步包括选自人IgM恒定区；人IgGl恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。优选地，重链免疫球蛋白恒定区是人IgGl恒定区。优选地，重链恒定区中至少ー个氨基酸残基被置換，使得抗体的效应子功能被改变。更优选地，人IgGl恒定区包括选自SEQ ID NO. :2 JPSEQ ID NO. 3的氨基酸序列。在另ー个实施方案中，结合蛋白进ー步包括选自人IgK恒定区，和人Ig λ恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。优选地，人IgK恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4，人IgX恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO. 5ο在另ー个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO :3的氨基酸序列的I g重链恒定区；具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。 在另ー个实施方案中，结合蛋白包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。在另ー个实施方案中，结合选自免疫球蛋白分子或者本领域公知的其功能变体，所述变体保持结合蛋白的特征结合性质。具体免疫球蛋白实施方案的例子包括但不限于scFv ;单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab'片段；F(ab' )2;Fv;ニ硫键连接的Fv，和双特异性或双重特异性抗体。最优选地，结合蛋白是人抗体。本发明的另一方面提供了中和结合蛋白，其包括上文公开的结合蛋白的任ー种，其中中和结合蛋白能中和IL-18。优选地，中和结合蛋白能结合中和人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18中的任何ー种。在另ー个实施方案中，中和结合蛋白减小了IL-18结合其受体的能力。优选地，中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
在另ー个实施方案中，中和结合蛋白能抑制选自下面的IL-18生物活性中的一种或几种Thl 调节；Th2 调节(Nakanishi K.,等(2001)Cytokine and Growth FactorRev. 12 :53-72) ;Nk调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；e嗜酸性细胞调节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。在优选的实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(Kd):最大大约KT7M ;最大大约KT8M ;最大大约KT9M ;最大大约1(Γ10Μ ;最大大约KT11M ;最大大约KT12M ；最大大约1(Γ13Μ。在另ー个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的生成速率至少大约IO2IT1S-1 ;至少大约IO3M-1S-1 ;至少大约IO4MY1 ;至少大约IO5MY1 ;至少大约IO6IT1S'在另ー个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的离解速率最大大约10 ；最大大约 ο、-1;最大大约KTiV1;最大大约ιο'Λ
本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中任何一种的标记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物结合。优选地，可检测标记物选自放射性标记物，酶，荧光标记物,发光标记物,生物发光标记物,磁性标记物和生物素。更优选地,放射性标记物是3H, 14C, 35S790Y, "Tc, 111In, 125I，131I，177Lu, 166Ho,或 153Sm0本发明的另一方面提供ー种包括上面公开的结合蛋白中任何一种的结合蛋白，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质结合。优选地，所述治疗性或细胞毒性物质选自抗-代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗-血管生成药物；抗-有丝分裂物质；蒽环霉素A ;毒素；编程性细胞死亡剂。一个实施方案允许分离编码上述公开的结合蛋白中的任何ー种的核酸。另ー个实施方案提供包括分离的上面公开的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA ；pTT (Durocher等，Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No. 2) ;pTT3 (有另外多个克隆位点的 pTT ;pEFBOS(Mizushima, S.和 Nagata, S. , (1990)Nucleic acids Research Vol 18, No. 17)；pBV ；pJV ;和 pBJ0在另ー个实施方案中，用载体转染宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地，所述真核 细胞选自原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限干，CHO和COS ;或者真菌细胞，例如啤酒糖酵母；或昆虫细胞，例如Sf9。本发明的另一方面提供结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括在足以产生结合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养上面公开的宿主细胞中的任何ー种。另ー个实施方案提供根据上面公开的方法制备的结合蛋白。本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中的任何一种的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。优选地，所述晶体是没有载体的药学控制释放晶体。在一个实施方案中，作为晶体存在的结合蛋白具有比结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。在另ー个实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留其生物活性。一个实施方案提供用于释放结合蛋白的成分，其中所述成分包括含有上面公开的结晶结合蛋白和成分；和至少ー种聚合物载体的组合物。优选地，所述聚合物载体选自下面的ー种或几种 聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酷)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)，聚(酷)，聚(乳酸)，聚(乳酸-共-羟基こ酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚U-己内酷)，聚(ニ氧六环酮) ’聚(こニ醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有机)磷臆]，聚(原酷)，聚(こ烯醇)，聚(こ烯吡咯烷酮)，马来酸酐-烷基こ烯基醚共聚物，多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖，glycaminoglycans,硫酸多糖,它们的混合物和共聚物。优选地,所述成分选自白蛋白，鹿糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基-β -环糊精，甲氧基聚こニ醇和聚こニ醇。另ー个实施方案提供对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动物施用有效量的上述组合物的步骤。本发明的另一方面提供一种感兴趣的基因的基因表达的调节方法，包括下面的步骤提供I L-18多肽或I L-18调节剂；和多肽或调节剂接触细胞，其中感兴趣的基因选自下面 Genbank 鉴定号确定的基因ΝΜ_000389，ΝΜ_002198, ΝΜ_002163, ΝΜ_006144,ΝΜ_006515, ΝΜ_007185, ΝΜ_002288, ΝΜ_003661, ΝΜ_021958, ΝΜ_001335, Hs. 382006，ΝΜ_020125， ΝΜ_007210， ΝΜ_021798， ΝΜ_013324， Μ11313, D88152, ΝΜ_001103， U37519,ΝΜ000697, J03600, ΝΜ_014578, S66793, U47054, L19871, Μ81181, NM 001188， U15460,匪014417， Ζ23115, ΝΜ_001713, U45878, U37546, U72649, U49187, J 03507， U50360,ΧΜ_071866, ΝΜ_005623, Ζ32765, Ζ11697, ΧΜ071866, U51096, Μ83667, D87469, L07765,U66468, X14830, L29217, X15880, NM_001851, M27691, M37435, X13589, X16866, X59131,Nu004393, U73328, L19267, U53445, X68277, U48807, NM001950, U87269, M57730, X52541,J04076, X63741, L07077, M62831, M60830, U53786, NM_001988, NM_000141, M23668,U60062, NM_000141, U49973, U89995, U27326, A28102, M25667, L4357, U19523, LO1406,U03486, X68285, Z18859, D49958, D43772, AC000099, M57731, X53800, M91036, D16583,X64877, X58431, M16937, NM014468, X92814, L19314, M26665, D10995, L41147, M24283,S81914, J03171, J00219, NM_000619, NM_000585, U31628, X04500, M27492, X01057,M26062, Y00081, Y00787, Z31695, X06256, X57206, U20734, NM014879, D31762, D42038,NM_005551, NM_014846, X06182, Nu005551, X07730, M13955, M57710, S83362, NM_002314,NM_005569, U49957, U89922, X14008, U59914, D14497, X59727, NM000429, U43944, X72755,NM021230, NM005951, X78710, X70991, M32011, S77763, M58603, S76638, M69043, U91616,D86425, L13740, U44848, U79251, M27288, AF000234, D50640, L20971, L10343, U77735, NM003579, U17034, AB000584, X63131, D11428, NM_032940, NM_005035, NM_003579, M18255,L01087, D38128, Y10375, D15049, M31166, U59877, NM_003579, U64675, S57153, NM_00903,NG_000013, X75042, M83221, NM_000537, U22314, S59049, U70426, U22377, U38480, L10338,M23178, M69203, NM_005409, D79206, NM_005065, NM_004186, J03764, NM_006802, D89077,NM_003037, M91463, D82326, L05568, U96094, X83301, D21267, L31529, M62800, NM_021014,Z35093, NM_005816, L25444, M95787,匪005421， L47345, M57732, NM_003205, M96956,U19878, M92357, M59465, X83490, U37518, NM_003294, U19261, U78798, S69790, U53476,L15309, U78722, X57809, U79249, AB000464, X77744, U79248, AI420129, HG2981-HT3127，HG3548-HT3749, HG870-HT870, HG4333-HT4603, HG3111-HT3287，HG4593-HT4998，HG961-HT961, HG1877-HT1917, HG3115-HT3291, HG4115-HT4385,和 HG3925-HT4195。优选地，调节剂是拮抗剂。更优选地，调节剂是结合蛋白或中和结合蛋白。本发明还提供含有上述结合蛋白或中和结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。在另ー个实施方案中，药物组合物含有至少ー种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的另外的治疗药物。优选地，所述另外的药物选自血管生成抑制剂(包括但不限于抗-VEGF抗体或VEGF-诱捕剂)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)；共同-刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7. 1，抗-B7. 2，CTLA4-I g，抗-⑶20);粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-IAbs，杭-E/L选择蛋白Abs，小分子抑制剂)；杭-细胞因子抗体或者其功能片段(包括但不限于抗-IL-12，抗-TNF，抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;和非留类抗炎药物。另ー方面，本发明提供ー种抑制人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接触上述结合蛋白，使得人IL-18活性被抑制。在相关方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有 害的疾病的人患者抑制人IL-18活性的方法，包括对人患者施用上述结合蛋白使得人患者中的人IL-18活性被抑制，从而实现治疗。优选地，所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状 腺炎，哮喘，变态反应疾病，牛皮癣，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排异(包括但不限于骨髓和实体器官排异)，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾病，肉状瘤病，动脉粥样硬化，传播性血管凝固，Kaw阿司匹林ki' s病，Grave' s病，肾病综合征，慢性疲劳综合征，Wegener' s肉芽肿病，Henoch-Schoenlein紫癜,肾微结节性脉管炎,慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染病，由寄生虫引起的疾病，后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髄炎，Huntington/ s舞蹈病，帕金森病，早老性痴呆，中风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞，Addison' s病,散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏,Schmidt' s综合征,成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节病，关节病，Reiter' s病,牛皮癣关节病，溃疡性结肠关节病，肠滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙门氏菌相关关节病，脊椎关节病，动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱病，寻常性天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮，线性IgA病，自身免疫溶血性贫血，Coombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free病，慢性粘膜皮肤念珠菌病，巨细胞关节炎，原发硬化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾病，こ肝，丙肝，普通各式各样的免疫缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白減少)，膨胀心肌病，女性不孕症，卵巣衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺病，起因不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后
间质肺病，间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾病，与肺病相关的混合缔结组织疾病，与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性关节炎，与肺病相关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的Sjogren' s病，与肺病相关的僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺病，与肺病相关的含鉄血黄素沉着病，药物引起的间质肺病，辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸润性肺病，传染病后间质肺病，痛风关节炎，自身免疫肝炎，I-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2_型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免疫疾病，骨关节炎，原发硬化胆管炎，I型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞減少，自身免疫中性白细胞減少，肾病NOS,肾小球肾炎，肾microscopic vasulitis,莱姆病,盘形红斑狼疮,特发性男性不孕症或N0S，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture' s综合征,结节性多动脉炎肺动,急性风湿性发烧,类风湿性脊椎炎，Still' s病,全身硬化，Sjogren' s综合征，Takayasu' s病/动脉炎，自身免疫血小板減少，特发性血小板減少，自身免疫甲状腺病，甲状腺机能亢进，甲状腺肿自身免疫甲状腺机能允进(Hashimoto ' s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机能允进,原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的肝损伤，choleosatatis,特应性肝病，药物引起的肝炎，非酒精性脂肪性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Thl型介导的疾病，和癌症，例如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，结肠癌，胰腺癌，卵巣癌，前列腺癌和直肠癌，和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)。另ー方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者治疗的方法，包括在施用上述第二种药物之前，同时，或之后对患者施用上述结合蛋白中的任何ー种的步骤。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2. 5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
在优选的实施方案中，结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。在另ー个实施方案中，结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。在另ー个实施方案中，结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。在另ー个实施方案中，结合蛋白不能与选自2. 5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。在优选的实施方案中，结合蛋白包括包括SEQ ID NO :9的氨基酸序列的ん，和包括SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Vh。在另ー个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO :3的氨基酸序列的I g重链恒定区；具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。在另ー个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。本发明的详细描述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是抗-11-18抗体，或者与其结合的其抗原-结合部分。本发明的各方面涉及抗体和抗体片段，及其药物组合物，以及制备这样的抗体和片段的核酸，重组表达载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体体外或体内检测人IL-18，抑制人IL-18活性，和调节基因表达的方法。本发明还提供截短的IL-18。在相关方面，本发明还提供用于制备截短的IL-18的核酸，重组表达载体和宿主细胞。除非在这里另有定义，与本发明相关使用的科学和技术定义应该具有本领域技术人员通常理解的定义。此外，除非上下文必需说明，単数应该包括复数，而复数应当包括单数。在本说明书中，除非另有说明"或"的意思是"和/或"。此外，术语"包括"，以及其他形式，例如，第三人称的和过去式的"包括"的使用，是非限制性的。还有，除非另有说明，术语，例如"元素"或"成分"包括包括ー个成分的元素和成分以及包括ー个以上子単位的元素和成分。一般情况下，与这里描述的细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的术语是本领域公知的和通常使用的。本发明的方法和技术一般根据本领域公知的常规方法和本说明书引述的和讨论的各种概述性的和更专业的參考文献来进行，除非另有说明。根据厂商说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域常规实现的或者如这里描述的。与这里描述的实验步骤，分析化学，合成有机化学和药物化学技术相关的术语是本领域公知的和通常使用的。化学合成，化学分析，药物制备，制剂和送药和对患者的治疗是标准技木。下面定义选择的术语，可以更容易理解本发明。这里使用的术语"多肽"指任何氨基酸的聚合链。术语"肽"和"蛋白质"与术语多肽互換使用，也指氨基酸的聚合链。术语"多肽"包括天然或人造蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。术语"分离的蛋白质"或"分离的多肽"是由于其来源或产生来源不与其天然态下伴随它的天然相关成分相关；基本上没有来自相同物种的其他蛋白质；由不同物种的细胞表达；或者在自然中不存在的蛋白质或多肽。因此，化学合成或在不同于其天然起源细胞不同的细胞系中合成的多肽是与其天然相关成分"分离的"。利用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，可以使得蛋白质基本上没有天然相关成分。这里使用的术语"回收"指，例如，利用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分 离，使得化学物质例如多肽基本上没有天然相关成分的方法。这里使用的术语"IL-18"，指也已知为干扰素-Y的细胞因子，包括因子(IGIF)，那是ー种促炎性细胞因子，除了诱导扰素-Y的能力外还具有各种功能。与术语"hIL-18"互换使用的术语"人IL-18"包括SEQ ID NO :I的多肽及其片段，包括但不限于，人IL-18原，成熟人IL-18原，和保留这里描述的IL-18的生物活性的任何截短的人IL-18。这里使用的术语"人IL-18原"指SEQ ID NO :1的多肽。这里使用的术语"成熟人IL-18"，指SEQ ID NO :1的残基37-193，这里使用的术语"截短的人"，指SEQ ID N0:1的残基59-193。优选地，IL-18，及其片段是生物活性的。这里使用的术语"重组人IL-18"或"rhlL-18"指利用重组DNA技术体外制备的人IL-18。这里使用的"IL-18的生物活性"指细胞因子IL-18的所有固有的生物学性质。IL-18的生物学性质包括但不限于结合IL-18受体；促进Thl和Tcl细胞的成熟和激活；通过几种细胞型促进细胞因子例如TNF，IFNy和IL-I β的产生；促进巨噬细胞释放细胞因子例如TNF和IFN Y，产生NO ;促进FasL表达，细胞毒性和细胞因子从NK细胞释放(IFN Y )；促进细胞因子/趋化因子释放，突发性呼吸，颗粒释放，嗜中性白细胞中粘着分子表达；促进内皮细胞迁移从而促血管生成；促进GAG释放，软骨细胞中MMP和NO产生；促进某些细胞中C0X2表达；和在某些细胞中减少细胞増殖。关于抗体，蛋白质，或肽与第二化学物质相互作用的这里使用的术语"特异性结合"或"特异地结合"，意思是相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对于表位"Α"是特异性的，含有标记的"Α"和抗体的反应中，含有表位A(或者游离的，没有标记的Α)，的分子的存在，会减少与抗体结合的标记的A的量。这里使用的木"抗体"，广义上指由四个多肽链构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子两个重链(H)和两个轻链(L)，或者保留Ig分子的基本表位结合特征的其任何功能片段，突变体，变体，或衍生物。这样的突变体，变体，或衍生物抗体形式是本领域公知的。下面讨论非限制性实施方案。在全长抗体中，每条重链由ー个重链可变区(这里缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3构成。每条轻链由ー个轻链可变区(这里缩写为LCVR或VL)和一条轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。VH和VL区能进ー步分为高变区，称作互补性决定区(CDR)，期间散布着更保守的称作构架区(FR)的区。每条VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列FR1, CDRl，FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。这里使用的术语，抗体的"抗原-結合部分"(或者简单地"抗体部分")，指保留特异性结合抗原(例如，hIL-18)能力的抗体的ー个或几个片段。已经证明通过全长抗体的片段能完成抗体的抗原-结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的，双重特异性的，或多特异性的形式；特异性结合两个或多个不同的抗原。术语抗体的"抗原-结合部分"所包括的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL，VH, CL和CHl结构域构成的ー价片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在铰链区通过ニ硫桥连接的两个Fab片段的ニ价片段；(iii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv 片段，(v)dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341 :544-546)，其包括一个可变区；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码，利用重组方法，通过使它们制备成其中VL和VH区对形成ー价分子(已知是单链Fv(ScFv)；參见，例如，Bird 等(1988) Science 242 :423-426 ;和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85 =5879-5883)的蛋白质单链的合成接头，能将它们连接。这样的单链抗体也包括在术语，抗体的"抗原-結合部分"中。也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是ニ价，双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单链多肽上表达，但是使用太短不能在相同链上两个结构域之间配对的接头，从而使结构域与另ー个链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(參见，例如，Holliger, P.,等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.，等(1994) Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域公知的(Kontermann 和 Dubel 编著，Antibody EnRineerinR (2001) SprinRer-VerlaR.New York. 790pp. (ISBN 3-540-41354-5)。此外，抗体或其抗原-結合部分可以是更大的免疫粘着分子，是通过抗体或抗体部分与一个或几个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。这样的免疫粘着分子的；例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区形成四聚体scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.,等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6 :93-101),标记妝和 C-末端多组氨酸标签形成ニ价的和生物素化 scFv 分子(Kipriyanov, S. Μ·,等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗体部分，例如Fab和F(ab' )2片段，能应用常规技术，例如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而从全抗体制备。此外，应用这里描述的标准重组DNAa技术能获得抗体，抗体部分和免疫粘着分子。这里使用的术语"分离的抗体"，意指基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗 体的抗体(例如，特异性结合hIL-18的分离的抗体基本上没有特异性结合hIL-18以外抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-18的分离的抗体具有与其他抗原例如来自其他物种的IL-18分子的交叉反应性。此外，分离的抗体基本上没有其他细胞材料和/或化学品。这里使用的术语"人抗体"意指包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点诱变或通过体内体突变诱导的突变)，例如在CDRs中，特别是在CDR3中。然而，这里使用的术语"人抗体"不包括其中CDR序列来自另ー个哺乳动物种系例如小鼠的种系的抗体接枝到人构架序列上。这里使用的术语"重组人抗体"意在包括通过重组方法制备，表达，产生或分离的所有的人抗体，例如利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下面IlC章节进ー步描述)，从重组组合人抗体库分离的抗体(Hoogenboom H. R. , (1997)TIB Tech. 15 :62-70 ；AzzazyH.，和 Highsmith ff. E.，(2002)Clin. Biochem. 35 :425-445 ；Gavilondo J. V.,和 Larrick J. ff. (2002)BioTechniques 29 :128-145 ;Hoogenboom Η·，和Chames P. (2000) Immunology Today 21 :371-378),从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(參见，例如，Taylor, L. D.,等(1992) Nucl. Acids Res. 20 6287—6295 ;Kellermann S—A.,矛ロ Green L. L. (2002)Current Opinion in Biotechno logy13 :593-597 ；Little M.等(2000) Immunology Today 21 :364-370)或者通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备，表达，产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。但是在一些实施方案中，对这样的重组人抗体体外诱变(或者，当体内体诱变使用人Ig序列的转基因动物时)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来自体内人抗体种系全部中天然并不存在的人种系VH和VL序列或者与人种系VH和VL序列相关的序列。术语"嵌合抗体"指包括来自ー个物种的重链和轻链可变区序列和来自另ー个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。术语"⑶R-接枝抗体"指包括来自ー个物种的重链和轻链可变区，但是其中序列中VH和/或VL中ー个或几个CDR区被另ー个物种的CDR序列置換，例如具有其中ー个或几个鼠⑶Rs (例如，⑶R3)被人⑶R序列置换的鼠重链和轻链可变区的抗体。术语"人源化抗体"指包含来自非人物种(例如小鼠)但是其中VH和/或VL序列中至少一部分被变为更“人-样”，即人种系可变序列更相似的重链和轻链可变区序列的抗体。人源化抗体的ー种类型是CDR-接枝抗体，其中人CDR序列导入非人VH和VL序列置换相应的非人CDR序列。如这里使用的，术语"IL-18中和结合蛋白"指特异性结合hIL-18并且中和hIL-18的生物活性的蛋白质。优选地，中和结合蛋白是其与hIL-18的结合导致hIL_18的生物活性被抑制的中和抗体。优选地，中和结合蛋白结合hIL-18并且将hIL-18的生物活性减小至少大约20%，40%，60%，80%，85%或更多。中和结合蛋白对hIL_18的生物活性的这种抑制作用能通过测定hIL-18生物活性的一个或几个指标来评定。hIL-18生物活性的这些指标能通过本领域公知的体外或体内分析的几种标准方法中的ー种或几种来评定。术语"表位"包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基这样的分子的化学活性表面基团，并且在一些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗体结合的抗原的区。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子复合混合物中其靶物抗原时，抗体特异性结合抗原。如这里使用的术语"表面等离振子共振"指ー种光学现象，它使得通过检测生物传感器基体中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)。为 J*进一步描述，參见Jonsson, U·,等(1993)Ann. Biol. Cl in. 51:19-26 ; Jonsson, U.,等(1991)Biotechniques11 :620-627 Johnsson, B.，等(1995)J. Mol. Recognit. 8 :125-131 ；和 Johnnson, B.，等(1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。如这里使用的术语"K。/，意指本领域公知的抗体与抗原缔合生成抗体/抗原复合体的生成速率常数。如这里使用的术语"Ktjff"，意指本领域公知的抗体从抗体/抗原复合体离解的离解速率常数。如这里使用的术语"Kd"，意指本领域公知的特定抗体-抗原相互作用的离解常数。如这里使用的术语"标记的结合蛋白"，指带有插入的标记物提供结合蛋白鉴定的蛋白质。优选地，标记物是可检测标记，例如插入放射性标记的氨基酸或连接标记的抗生物素蛋白能检测的生物素基部分的多肽(例如，包含荧光标记物或者光学或比色方法能 检测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记物的例子包括但不限于下面的放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C, 35S799Y, "Tc, 111In, 125I，131I，177Lu, 166Ho,或 153Sm);突光标记物(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光剂)，酶学标记(例如，辣根过氧化物酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；预先确定的第二报告基团识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二次抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)；和有吸引力的试剂，例如钆螯合剤。术语"缀合结合蛋白"指与第二化学部分，例如治疗性药物或细胞毒性试剂，化学连接的结合蛋白。术语"试剂"在这里用来指化合物，化合物的混合物，生物大分子，或者从生物材料制备的提取物。优选地，治疗性药物或细胞毒性试剂包括但不限干，百日咳毒素，紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化こ錠，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide,长春新碱,长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，ニ轻基炭疽菌素ニ酮，ニ轻蒽ニ酮，光辉霉素，放线菌素D，I-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素，和它们的类似物或同系物。这里使用的术语"结晶结合蛋白"指以晶体形式存在的多肽。晶体是一种固态形式，它与其他形式例如无定形固态或液晶态截然不同。晶体由原子，离子，分子(例如蛋白质，象抗体)，或分子集合体(例如抗原/抗体复合体)有序的重复的三维排列组成。这些三维排列根据本领域公知的特殊数学关系排列。晶体中重复的基础单元，或者构件，称作不对称単元。证实给出确定的結晶学对称性的排列中重复的不对称单元提供晶体的"晶胞"。所有三个方向规则转换的晶胞的重复得到晶体。參见Giege, R.和Ducruix, A. Barrett,しrystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practica丄 Approach，2nd ea.，pp. 201-16，Oxford University Press, New York, New York, (1999)"。这里称作"多核苷酸"的术语在这里指两个或多个核苷酸，核糖核酸或脱氧核糖核酸或任何类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的DNA，但是优选双链DNA。这里使用的术语"分离的多核苷酸"意思是多核苷酸(例如基因组的，cDNA，或者合成来源，或者它们的组合)，其由于其来源，"分离的多核苷酸"与自然界发现"分离的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分不相缔合；与自然界不连接的多核苷酸操作连接；或者在自然界不作为更大序列的部分而存在。
这里使用的术语"载体"意指能将它所连接的另ー个核酸转运的核酸分子。载体的ー种类型是"质粒"，它指其中可以连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。载体的另ー种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段连接到病毒基因组中。一些载体能在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，有细菌复制起点的细菌载体和游离基因哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能指导它们操作连接的基因的表达。这样的载体在这里称作"重组表达载体"(或者简单地，"表达载体")。一般情况下，重组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书中，"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意在包括这样的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺-相关病毒，它们起着同等的功倉^:。术语"操作连接"指其中将描述的成分相关联使得它们以期望的方式发挥功能的连接。与编码序列"操作连接"的调控序列以这样的方式连接使得在与调控序列相匹配的条件下实现编码序列的表达。"操作连接"序列包括与感兴趣的基因邻接的表达调控序列和以反式起作用或者与感兴趣的调控基因有距离的表达调控序列。这里使用的"表达调控序列"指进行表达和加工它们连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序列，中止序列，启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(剂，Kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；如果期望，增强蛋白质分泌的序列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中,这样的调控序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，一般情况下，这样的调控序列包括启动子和转录终止序列。术语"调控序列"意在包括其存在对于表达和加工是必须的成分，并且还包括其存在是有利的附加成分，例如前导序列和融合配对物序列。这里定义的"转化"指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。利用本领域公知的各种各样的方法在天然或人为条件下可以发生转化。转化可以依赖公知的方法将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞。根据转化的宿主细胞选择方法并且包括但不限于，病毒感染，电穿孔，脂质转染，和粒子轰击。这样的"转化"细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能作为自身复制质粒或者作为宿主染色体的部分复制。它们还可以包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间的细胞。这里使用的"重组宿主细胞"(或者简单地"宿主细胞")意指其中已经导入外源DNA的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定受体细胞，而且还有这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生ー些改变，这样的后代事实上可能与母本细胞不同，但是它仍然包括在这里使用的术语"宿主细胞"的范围内。优选地，宿主细胞包括选自生命界任何原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物，真菌，植物和动物细 胞。最优选地，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO和COS ；昆虫细胞系Sf9 ;和真菌细胞啤酒糖酵母。标准技术可以用于重组DNA，寡核苷酸合成，和组织培养和转化(例如，电穿孔，脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据厂商说明书进行或者以本领域常规做法或者根据这里的描述进行。上述技术和方法一般根据本领域公知的常规方法和各种概述和更具体说明的參考文献的描述进行，这些參考文献在本说明书中引述并讨论。參见，例如，Sambrook 等 Molecular Cloning A Laboratory Manual (第二版,冷泉港出版社,冷泉港，纽约(1989))，这里为了所有的目的引作參考。正如本领域公知的和这里使用的，"转基因生物"，指有包含转基因的细胞的生物，其中导入生物体中的转基因(生物体的祖先)表达在生物体中天然并不表达的多肽。"转基因"是DNA构建体，其稳定操作整合导产生转基因生物体的细胞的基因组中，在转基因生物的ー种或几种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。术语"调控"和"调节"互換使用，如这里使用的，指感兴趣的分子活性(例如， hIL-18的生物活性)的变化或改变。调控可以是感兴趣的分子的某些活性或功能大小的增加或减小。举例的分子的活性和功能包括但不限干，结合特征，酶活性，细胞受体激活，和信号转导。相应地，这里使用的术语"调节剂"是能改变或变化感兴趣的分子的活性或功能(例如，hIL-18的生物活性)的化合物。例如，调节剂可以引起分子的某些活性或功能的大小与不存在调节剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大或降低。在一些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少ー种活性或功能大小。举例的抑制剂包括但不限于蛋白质，肽，抗体，，peptibodies,碳水化合物或小有机分子。Peptibodies描述于,例如，W001/83525。这里使用的术语"激动剂"指ー种调节剂，其当与感兴趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在激动剂所发现的活性或功能的大小相比有所増大。特别感兴趣的激动剂包括但不限干，IL-18多肽，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其他分子。这里使用的术语"拮抗剂"或"抑制剂"指ー种调节剂，其当与感兴趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在拮抗剂所发现的活性或功能的大小相比有所増大。特别感兴趣的拮抗剂包括阻断或调节hIL-18的生物学或免疫学活性的那些。hIL-18的拮抗剂和抑制剂包括但不限于，蛋白质，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其他分子。这里使用的术语"样品"以其广义使用。这里使用的"生物样品"包括但不限于,来自活体或活体前的一定量物质。这样的活体包括但不限于，人，小鼠，大鼠，猴，狗，兔和其他动物。这样的物质包括但不限于，血液，血清，尿液，滑液，细胞，器官，组织，骨髄，淋巴结和脾。这里使用的，一般公知的，本领域技术人员使用的，术语"竞争"，指ー种蛋白质与第二种结合蛋白结合这两种结合蛋白共同的配体(例如，IL-18)的相互干扰或者阻碍的能力。用于测定结合蛋白的竞争特征的试验是本领域公知的。这里描述优选的竞争试验。I.结合人IL-18的人抗体本发明的ー个方面提供以高亲合力，低解离速率和高中和能力，结合IL-18分离的人抗体，其抗原结合部分。优选地，抗体，或者其部分是分离的抗体。优选地，本发明的人抗体是中和人抗-IL-18抗体。A.抗IL-18抗体的制备方法通过本领域公知的多种技术可以制备本发明的抗体。制备本发明的抗-IL-18抗体的特别优选的方法包括使用XENOMOUSE转基因小鼠，并且使用本领域公知的用于制备抗体的杂交瘤和SLAM细胞操作技术(Abgenix，Inc.，Fremont, CA)，并且使用包括实施例3. 2描述的IL-18肽的抗原，S卩，包括SEQ ID NO. I的氨基酸序列和其片段的人IL-18。在本发明的一个实施方案中，通过用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座全部或部分的非人动物制备人抗体。在优选的实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体产生中缺乏的基因工程小鼠品系。參见，例如，Green等Nature Genetics 7 :13-21(1994)和美国专利 5，916，771，5，939，598，5，985，615,5, 998，209,6, 075，181,6, 091，001,6, 114，598 和 6，130，364。还參见 1991 年 7月25日公开的W091/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31日公开的WO 96/34096 和TO 96/33735，1998 年 4 月 23 日公开的TO98/16654，1998年 6 月 11 日公开的WO 98/24893，1998 年 11 月 12 日公开的 WO 98/50433，1999 年 9 月 10 日公开的TO99/45031，1999年10月21日公开的W 99/53049，2000年2月24日公开的W 0009560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成人-样人抗体库， 并且产生抗原-特异性人Mabs。XENOMOUSE转基因小鼠通过导入兆碱基大小的，人重链基因座和X轻链基因座的种系构型YA片段而包含大约80%人抗体库。參见Mendez等,NatureGenetics 15 146-156(1997)，Green 和 Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495 (1998)，其公开内容引作參考。本发明还提供了通过免疫包括人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物从非人非小鼠动物制备抗-IL-18抗体的方法。人们可以利用上面刚描述的方法制备这样的动物。这些专利文献中公开的方法可以根据美国专利5，994，619的描述改进。在优选实施方案中，非人动物可以是大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。在另ー个实施方案中，包括人免疫球蛋白基因座的非人动物是人免疫球蛋白“小基因座”的动物。在小基因座研究中，通过从Ig基因座包含各个基因来模拟外源Ig基因座。这样，一个或几个Vh基因，一个或几个Dh基因，一个或几个Jh基因，ー个μ恒定区，和ー个第二恒定区(优选Y恒定区)形成用于插入动物中的构建体。这项研究具体描述于美国专利 No. 5，545，807，5，545，806，5，625，825，5，625，126，5，633，425，5，661，016，5，770，429，5，789，650，5，814，318，5，591，669，5，612，205，5，721，367，5，789，215，和 5，643，763，这里引作參考。小基因座研究的好处是快捷，能产生包括Ig基因座的部分的构建体并且导入动物中。然而，小基因座研究的潜在的缺点是可能没有足够的免疫球蛋白多祥性来支持全B-细胞发育，使得抗体产生较少。为了制备人抗-IL-18抗体，用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座的ー些或全部的非人动物，并且从动物分离抗体或产生抗体的细胞。IL-18抗原可以是分离的和/或纯化的IL-18，并且优选是人IL-18。在另ー个实施方案中，IL-18抗原是IL-18的片段，优选成熟IL-18。在另ー个实施方案中，IL-18抗原是包括至少ー个IL-18的表位的片段。对动物的免疫可以通过本领域公知的任何方法来进行。參见，例如，Harlow和Lane, Antibodies A Laboratory Manual,纽约冷泉港出版社，1990。对非人动物例如小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛和马进行免疫的方法是本领域公知的。參见，例如，Harlow和Lane，美国专利5，994，619。在优选的实施方案中，IL-18抗原与辅助剂一起施用刺激免疫应答。这样的辅助剂包括完全或不完全福氏佐剂，RIBI (胞壁酰ニ肽)或ISCOM(免疫刺激复合体)。这样的辅助剂通过局部沉积分离它而可以保护多肽不快速散播，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他成分有趋化性的物质。优选地，如果施用多肽，免疫程序包括施用两次或多次多肽，延续几周。实施例2. 2. A提供用磷酸盐缓冲盐水中人IL-18免疫XENOMOUSE转基因小鼠的方
案。 B.抗体和产生抗体的细胞系的产生用IL-18抗原免疫动物之后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过从动物取血或杀死动物而从动物获得含有抗-IL-18抗体的血清。可以使用从动物获得的血清，从血清获得的免疫球蛋白级分，或者从血清纯化的抗-IL-18抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此带有一系列异源性质。在另ー个实施方案中，可以从受免疫动物制备产生抗体的无限繁殖杂交瘤。免疫之后杀死动物，并且根结本领域公知的，将B脾细胞与无限繁殖骨髄瘤细胞融合。參见，例如，Harlow和Lane，上文。在优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。融合抗生素选择之后，使用IL-18，或者其部分，或表达IL-18的细胞筛选杂交瘤。在优选实施方案中，利用酶联免疫分析(ELISA)或者放射免疫分析(RIA)进行最初的筛选，优选ELISA。WO 00/37504中提供了 ELISA筛选的实施例，这里引作參考。选择产生抗-IL-18抗体的杂交瘤，克隆，并且进一步筛选期望的特征，包括強健杂交瘤生长,高抗体产生和期望的抗体特征,下面进ー步讨论。培养杂交瘤并且在同源动物体内，在没有免疫系统的动物，例如，裸鼠，中展开，或者在培养基中体外培养。筛选，克隆和扩展杂交瘤的方法是本领域技术人员公知的。优选地，免疫动物是表达人免疫球蛋白基因并且B脾细胞与来自和非人动物相同物种的骨髓瘤融合的非人动物。更优选地，免疫动物是XENOMOUSE转基因小鼠，骨髓瘤细胞系是非-分泌小鼠骨髓瘤，例如骨髓瘤细胞系是P3X63Ag8. 653(參见，例如，实施例2. 2. B)。一方面，本发明提供产生人抗-IL-18抗体的杂交瘤。在优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另ー个优选的实施方案中，杂交瘤是在非人非小鼠物种中产生的，例如大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。在另ー个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌骨髄瘤与表达抗-IL-18抗体的人细胞融合。在本发明的另ー个方面，利用本领域称作筛选淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法从单ー的分离的淋巴细胞制备重组抗体，如美国专利No. 5，627，052，PCT公开WO92/02551，和 Babcock，J. S.等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7843-7848 所述。在该方法中，应用抗原特异性溶血血小板测试来筛选I(A)章节中描述的任何ー种免疫动物得到的分泌感兴趣的抗体的単一细胞，例如淋巴细胞，在抗原特异性溶血血小板测试中，抗原IL-18，或者其片段，利用接头，例如生物素，与绵羊红细胞偶联，并且用来鉴定分泌对IL-18有特异性的抗体的単一细胞。鉴定感兴趣的分泌抗体的细胞之后，通过逆转录酶-PCR从细胞获得重链和轻链可变区cDNAs，然后在哺乳动物细胞例如COS或CHO细胞中，在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)的上下游表达这些可变区。用来自体内筛选的淋巴细胞的扩增的免疫球蛋白序列转染宿主细胞，然后进ー步分析并体外筛选，例如通过使转染细胞分离表达抗IL-18抗体的细胞。进ー步体外操作扩增的免疫球蛋白序列，例如通过体外亲和性成熟方法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。也可以利用体外方法来制备本发明的抗体，其中筛选抗体库来鉴定具有期望的结合特异性的抗体。这样筛选重组抗体库的方法是本领域公知的并且包括例如下面文献中描述的方法=Ladner 等，美国专利 No. 5，223，409 ；Kang 等，PCT 公开 No. W092/18619 ；Dower等，PCT 公开 No. WO 91/17271 ；ffinter 等，PCT 公开 No. WO 92/20791 ；Markland 等，PCT 公开 No. WO 92/15679 ；Breitling 等，PCT 公开 No. WO 93/01288 ；McCafferty 等，PCT 公开No. WO 92/01047 ;Garrard 等，PCT 公开 No. WO 92/09690 ;Fuchs 等(1991) Biol Technology9 :1370-1372 ;Hay 等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3 :81-85 ;Huse 等(1989)Science246 :1275-1281 ；McCafferty 等，Nature (1990)348 :552-554 !Griffiths 等，(1993)EMBOJ12 :725-734 ；Hawkins 等(1992) J Mol Biol 226 :889-896 ;Clackson 等(1991) Nature352 :624-628 ;Gram 等(1992)PNAS89 :3576-3580 ;Garrad 等(1991)Bio/Technology 9 1373-1377 ;Hoogenboom 等(1991) Nucl Acid Res 19 :4133-4137 ;和 Barbas 等(1991) PNAS88 :7978-7982,美国专利申请公开20030186374，和PCT公开No. WO 97/29131，这些文献的内容在此引作參考。
重组抗体库可以来自用IL-18，或IL-18的部分免疫的受试者。或者，重组抗体库可以来自裸受试者，即，没有用IL-18免疫的受试者，例如从没有用人IL-18免疫的人受试者获得的人抗体库。通过用包括人IL-18的肽(例如，相应于hIL-18的部分的肽)筛选重组抗体库来筛选本发明的抗体，从而筛选识别IL-18的那些抗体。实施这样的筛选和选择的方法是本领域公知的，例如上一段中的參考文献中描述的的。为了筛选对hIL-18具有特定的结合亲和性的本发明的抗体，例如以特定解离速率常数从人IL-18离解的那些，能利用本领域公知的表面等离振子共振的方法来筛选具有期望的解离速率常数的抗体。为了筛选对hIL-18具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特殊IC5tl的那些，可以利用本领域公知的评价hIL-18活性的抑制作用的本领域公知的标准方法。一方面，本发明提供分离的抗体，或者结合人IL-18的其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。优选地，抗体是人抗体。在很多实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本发明最优选的中和抗体在这里称作2. 5(E)，并且具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列的VL和SEQ IDNO 6的氨基酸序列的VH0最优选地，2. 5 (E)抗体结合人IL-18，Kd小于5xl01QM (參见实施例2. 2. F)。优选地，本发明的抗-IL-18抗体，例如2. 5(E)抗体和相关抗体，具有减小或中和IL-18活性的能力，例如，根据本领域公知的几种体外和体内测试所測定的(例如，參见实施例3. 2. F)。例如，这些抗体中和KG-I细胞中人Y干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值的范围至少大约1(Γ8Μ，大约1(Γ9Μ，或者大约ΙΟ,Μ。此外，这些抗体还中和全血细胞中人Y干扰素的IL-18-诱导的产生，IC5tl值的范围至少大约10_8Μ，大约10_9Μ，或者大约ΙΟ,Μ。在特别优选的实施方案中，抗-IL-18抗体2. 5(E)结合各种形式的人IL-18，包括IL-18原，成熟IL-18和截短的IL-18。抗体2. 5 (E)不特异性结合其他细胞因子，例如IL-2, IL-3, IL-4, IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10, IL-11，IL-12，IL-13, IL-15，IL-16,IL-17，IL-21，TNF，LT (淋巴毒素)，LTa 1β2，和LTa2@ I。但是，抗体2.5(E)与来自其他物种的IL-18没有交叉反应性。例如，抗体中和来自cynomolgus猴的IL-18的活性(IC5tlfor cyno IL-18 = 9. EX 1(Γη ;參见实施例 2. 2. Jl)。
一方面，本发明提供2. 5(E)抗体和功能抗体部分，2. 5 (E)-相关抗体和功能抗体部分，与2. 5(E)等同性质的其他人抗体和功能抗体部分，例如以低离解动力学和高中和能カ结合IL-18的高亲和性。在优选的实施方案中，分离的抗体，或者其抗原-结合部分，结合人IL-18，根据表面等离振子共振所測定的，其中抗体，或者其抗原-結合部分，其中抗体，或者其抗原-结合部分，以大约O. Is-1或更小的Ktjff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1χ10_6Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所測定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约IxlO-2S-1或更小的Ktjff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1χ10_7Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所測定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约IxlO-3S-1或更小的Ktjff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1χ10_8Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所測定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约I X ΙΟ、—1或更小的Ktjff速率常数从 人IL-18离解，或者其以大约IxlO-9M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所測定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约IxlO-5S-1或更小的Ktjff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约ΙχΙΟ,Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所測定的，抗体，或者其抗原-結合部分，可以以大约IxlO-5S-1或更小的Ktjff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1χ10_ηΜ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。在另ー个实施方案中，本发明提供分离的人抗体，或其抗原结合部分，具有包括SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO :13 ；SEQ ID NO :15 ；SEQ ID NO :17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO :21 ；SEQ ID NO :23 ；SEQ ID NO :25 ；SEQ ID NO :27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ ID NO :31 ；SEQ ID NO :33 ；SEQ ID NO :35 ；SEQ ID NO :37 ；SEQ ID NO :39 ;或 SEQID NO :41的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，和包括SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ IDNO 10 ；SEQ ID NO :12 ；SEQ ID NO :14 ；SEQ ID NO :16 ；SEQ BD NO :18 ；SEQ ID NO :20 ；SEQID NO 22 ；SEQ ID NO :24 ；SEQ ID NO :26 ；SEQ ID NO :28 ；SEQ ID NO :30 ；SEQ ID NO :32 ；SEQ ID NO 34 ；SEQID NO :36 ；SEQID NO :38 ;或 SEQ ID NO :40 的氨基酸序列的重链可变区(VH)0在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE,IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgGl重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体包括轻链恒定区，K轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括K轻链恒定区。或者，抗体部分可以是，例如，Fab片段或单链Fv片段。Fe部分中氨基酸残基的置换改变抗体效应子功能是本领域公知的(Winter，等，美国专利No. 5，648，260 ；5624821)。抗体的Fe部分介导几种重要效应子功能，例如细胞因子诱导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体和抗原-抗体复合体的半衰期/清除率。在一些情况下，对于治疗性抗体，这些效应子功能是所期望的，但是在另ー些情况下可能是不需要的甚至是有害的，取决于治疗目标。ー些人IgG同位型，特别是IgGl和IgG3,分别通过与Fe Y Rs和补体Clq结合而介导ADCC和CDC。新生Fe受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的关键成分。在另ー个实施方案中，抗体的恒定区例如抗体的Fe区中至少ー个氨基酸残基被置換，使得抗体的效应子功能被改变。一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分被衍生化或者连接另一个功能分子(例如，另ー个肽或蛋白质)。例如，通过将本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶联，基因融合，非共价结合或者其他)与一个或几个其他分子部分功能连接，能衍生本发明的标记的结合蛋白，所述其他分子部分例如另ー种抗体(例如，双特异性抗体或ニ联抗体)，可检测试剂，细胞毒性试剂，药物物质，和/或能介导抗体或抗体部分与另ー种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。本发明的抗体或抗体部分可以被衍生化的有用可检测试剂包括荧光化合物。举例的荧光可检测 试剂包括荧光素，荧光素异硫氰酸酷，罗丹明，5- ニ甲基胺-I-萘磺酰基氯，藻红蛋白等等。还可以用可检测酶将抗体衍生化，例如用碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶等等能够。当用可检测酶将抗体衍生化时，通过加入另外的试剂检测它，酶用来产生可检测反应产物。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和ニ氨基联苯胺产生有色反应产物，其是可检测的。也可以用生物素将抗体衍生物化，并且通过间接测定抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合来測定。本发明的另ー个实施方案提供结晶结合蛋白。优选地，本发明涉及这里公开的全杭-IL-18抗体及其片段的结晶，含有这样的结晶的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶配对物更长的体内半存留期。在另ー个实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留了生物活性。根据本领域公知的方法和根据中公开的，可以制备本发明的结晶结合蛋白，W02072636在此引作參考(也參见例如2. 2. M)。本发明另一个实施方案提供糖基化结合蛋白，其中抗体或抗原-結合部分包括一个或几个糖残基。最初的体内蛋白质的产生可以进一歩加工，这是翻译后修饰。特别地，糖(こニ醇)残基可以酶促加上，这个过程是糖基化作用。得到的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白质已知是糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化作用取决于感兴趣的蛋白质的氨基酸序列，以及其中表达蛋白质的宿主细胞。不同的生物体可以产生不同的糖基化作用酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的底物(核苷酸糖类)。由于这样的因素，蛋白质糖基化模式，糖基残基的成分可以根据其中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。本发明中使用的糖基残基可以包括但不限干，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，η-こ酰氨基葡萄糖和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包括糖基化残基，使得糖基化模式是人的。本领域技术人员公知不同的蛋白质糖基化作用可以产生不同的蛋白质特征。例如，与哺乳动物例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相比，微生物宿主例如使用酵母内源途径的酵母中产生的糖基化的治疗性蛋白质的功效可能被减小。这样的糖蛋白在人体中也可以是免疫原性的并且具有给药后减小的体内半存留期。人和其他动物中的特异受体可以识别特异糖基残基并且促进蛋白质在血液中的快速清除。其他副作用包括蛋白质折叠，可溶性，对蛋白酶的灵敏性，运输，转运，区室化，分泌，被其他蛋白质或因子识别，抗原性，或变应原性的改变。因此，医师可能优选具有特定糖基化作用成分和模式的治疗性蛋白质，例如与人细胞中或关注的受试者动物的物种-特异性细胞中产生的相同或至少相似的糖基化成分和模式。通过基因修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，可以实现与宿主细胞不同的糖基化蛋白质的表达。应用本领域公知的技术，医师可以获得具有人蛋白质糖基化作用的抗体或其抗原-结合部分。例如，对酵母菌株进行基因修饰来表达非天然存在的糖基化酶，使得这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)具有与动物细胞特别是人细胞产生的相同的蛋白质糖基化作用(美国专利申请20040018590和20020137134)。此外，本领域技术人员明白，使用经基因工程处理的表达各种糖基化醇的宿主细胞库，可以表达感兴趣的蛋白质，使得库中成员宿主细胞产生具有不同糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。医师可以选择并分离具有特定糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。优选地，具有特定的选择的新的糖基化作用模式的蛋白质具有改善的或改变的生物性质。C.重组IL-18抗体的产生通过本领域公知的各种技术可以制备本发明的抗体。例如,从宿主细胞表达,其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染导宿主细胞中。各种形式的术语"转染"意在包括通常用于将外源DNA导入原核或真核细胞中的各种技术，例如，电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。虽然有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞
(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能装配和分泌适当地折叠并具有免疫活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巣细胞(CH0 细胞)(包括 dhfr-CHO 细胞，描述于 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 77 =4216-4220,与 DHFR 选择标记物一起使用，例如，如 R. J. Kaufman 和P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601-621)所述，NSO 骨髓瘤细胞，COS 细胞和 SP2 细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间来制备抗体，或者，更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。利用标准蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体。宿主细胞还可以用来制备功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。理解上述方法中的变化在本发明的范围内。例如，可以预期用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的来转染宿主细胞。还可以利用重组DNA技术来去除对于与感兴趣的抗原结合不是必需的编码轻链和重链之ー的DNA的一些或部分。这样截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体内。另外，可以制备双功能抗体，其中一个重链和一个轻链是本发明的抗体，而另ー个重链和轻链对于感兴趣的抗原之外的抗原是特异性的，通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联。在本发明抗体或抗原-结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自操作连接于CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，驱动高水平基因转录。重组表达载体还带有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤筛选/扩增用载体转染的CHO细胞的筛选。培养选择的转化子宿主细胞让它表达抗体重链和轻链，并且从培养基回收完整抗体。利用标准分子生物技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞，并且从培养基回收抗体。本发明还提供通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直到合成本发明的重组抗体来合成本发明的重组抗体的方法。该方法进ー步包括从培养基分离重组抗体。表I是本发明优选的抗-hIL-18抗体的VH和VL区的氨基酸序列的表。在VH区中，氨基末端(N-末端)的位置I中天然存在的氨基酸是谷氨酸(E)或谷氨酰(Q)。但是，为了在包括VH区的蛋白质的大規模生产中产生带有同源N-末端的重组蛋白质，N-末端的位置I优选谷氨酸(E)。表I VH和VL区的氨基酸序列列表
权利要求
1.ー种包括能结合人IL-18的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括至少ー个包括选自下面的氨基酸序列的⑶R CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:42)，其中 X1 是3，N，H，R，或 Y; X2iY，G，R，S，_C; X3iW，G，Y，D，S，V，或 I ； X4iI，H，W，Y，M，L，_D;X5 是 G，Y，S，N，或 H; X6是W，或者不存在；和 X7是T，S，G，或者不存在；CDR-IE-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 43),其中； XI是 F，Y，H，S，或 V; X2是I，或F ；X3 是 Y，S，或 W ;X4 是 P，Y，或 S ; \是6，S，R，或 D ; X6iD，或 G ; X7iS，T，G，_R; X8iE，T，I，或 N; X9 是 T，Y，N，I，K，或 H;X10 是 R，Y，或 S ;XII是 Y，N，或 S ; X12 是3，P，A，或 V;X13 是 P，S，或 D ;X14 是 T，L，或 S ;X15 是 F，K，或 V ; X16是0，S，或K ;和 X17是6，或者不存在；CDR-HS-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO 44),其中； X2iG，R，D，S，K，L，Y，或 A; X3iS，G，Y，或 R; X4 是 G，S，Y，N，T，或 D; X5iW，S，A，G，Y，_T; X6 是 Y，G，S，F，W，或 N; X7 是 P，S，F，Y，V，G，W，或 V;X8iY，F，D，P，M，I，或 N;X9iT，W，D，L，Y，E，P，F，_G; X10是F，D，Y，H，V，Y，或者不存在； XniD，Y，F，L，或者不存在； X12iI，D，Y，或者不存在； X13是丫，或者不存在； X14是Y，或者不存在； X15是6，或者不存在； X16是1或者不存在； X17是0，或者不存在；和 X18是V，或者不存；CDR-L1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 45),其中； X2iA，G，_S;X3 是 S ; X4 是 E，R，Q，或 H; X5 是 S，I，T，或 N; X6是I，V，し或F ; X7iS，G，L，N，_R; X8 和 S，G，Y，R，N，H，_D; X9iN，G，Y，R，或 S ; X10 是し，Y，S，或 D ; X11是 A，L，N，V，G，_D; X12是A，N, E，K，G，或者不存在； X13是K，T，N，或者不存在； X14是N，Y，T，或者不存在； X15是Y，L，或者不存在； X16是しC，Y，或者不存在；和 X17iA，D，或者不存在；CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:46)，其中 X2iA，V，T，I，或 L; X3 iS，或 F ; X4 是 T，I，N，S，R，或 Y;X5是R，或L ; X6 是 A，Q，E，或 F;和 X7iT，或 S ; 和CDR-L3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:47)，其中X1是1或M ; X2iQ，H，或 Y; X3 是 Y，N，G，S，或 R; X4 是 N，H，Y，D，G，V，L，或 I ； X5 是 N，G，I，Y，S，Q，F，或 E ;X6 是 W，S，T，L，I，或 F ;X7 是 P，L，T，D，或 I ; X8 是 S，L，P，C，W，I，或 F; X9是I，T，S，或者不存在；和 Xltl是T，或者不存在。
2.根据权利要求I的结合蛋白，其中所述至少ー个CDR包括选自下面的氨基酸序列 SEQ ID NO. :6 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :6 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :6 的残基99-110； SEQ ID NO. :7 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. :7 的残基 50-56 ;SEQ ID NO. :7 的残基89—98； SEQ ID NO. :8 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :8 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :8 的残基100-110； SEQ ID NO. :9 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :9 的残基 21-27 ;SEQ ID NO. :9 的残基90—98； SEQ ID NO. :10 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :10 的残基 50-65 ;SEQ ID NO. :10 的残基98-107； SEQ ID NO. :11 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. :11 的残基 50-56 ;SEQ ED NO. :11 的残基89-97； SEQ ED NO. :12 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :12 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :12 的残基100-108 ； SEQ ID NO. :13 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :13 的残基 51-57 ;SEQ ED NO. :13 的残基90—98； SEQ ID NO. :14 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :14 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :14 的残基99-111； SEQ ID NO. :15 的残基 24-40 ;SEQ ID NO. :15 的残基 56-62 ;SEQ ID NO. :15 的残基95-103 ； SEQ ID NO. :16 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :16 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :16 的残基100-109； SEQ ID NO. :17 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :17 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :17 的残基90—98 ； SEQ ID NO. :18 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :18 的残基 20-36 ;SEQ ID NO. :18 的残基99-108 ； SEQ ID NO. :19 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. :19 的残基 50-56 ;SEQ ID NO. :19 的残基89-97 ；SEQID NO. :20 的残基 31-35 ;SEQID NO. :20 的残基 52-67 ;SEQID NO. :20 的残基100-108；SEQID NO. 21 的残基 24-35 ；SEQID NO. :21 的残基 51-57 ；SEQID NO. :21 的残基90—98 ；SEQID NO. 22 的残基 31-35 ；SEQID NO. :22 的残基 50-66 ；SEQID NO. :22 的残基99-116；SEQID NO. 23 的残基 24-39 ；SEQID NO. :23 的残基 55-61 ；SEQID NO. :23 的残基94-102 ；SEQID NO. :24 的残基 31-37 ;SEQID NO. :24 的残基 52-67 ;SEQID NO. :24 的残基100-109；SEQID NO. :25 的残基 24-35 ;SEQID NO. :25 的残基 51-57 ;SEQID NO. :25 的残基90—98 ；SEQID NO. :26 的残基 31-37 ;SEQID NO. :26 的残基 52-67 ;SEQID NO. :26 的残基100-109；SEQID NO. :27 的残基 24-35 ;SEQID NO. :27 的残基 51-57 ;SEQID NO. :27 的残基90—98 ；SEQID NO. 28 的残基 31-37 ；SEQID NO. :28 的残基 52-67 ；SEQID NO. :28 的残基100-108；SEQID NO. 29 的残基 24-35 ；SEQID NO. :29 的残基 51-57 ；SEQBD NO. :29 的残基90—98 ；SEQID NO. :30 的残基 31-37 ;SEQID NO. :30 的残基 52-67 ;SEQID NO. :30 的残基99_109 ；SEQID NO. 31 的残基 24-35 ；SEQID NO. 31 的残基 51-57 ；SEQID NO. 31 的残基90—98 ；SEQID NO. :32 的残基 31-37 ;SEQID NO. :32 的残基 52-67 ;SEQID NO. :32 的残基100-109；SEQID NO. :33 的残基 24-35 ;SEQID NO. :33 的残基 51-57 ;SEQID NO. :33 的残基90—98 ；SEQID NO. 34 的残基 31-37 ；SEQID NO. :34 的残基 52-67 ；SEQID NO. :34 的残基100-108；SEQID NO. 35 的残基 24-35 ；SEQID NO. :35 的残基 51-57 ；SEQID NO. :35 的残基90—98 ； SEQID NO. :36 的残基 31-35 ;SEQID NO. :36 的残基 50-66 ;SEQID NO. :36 的残基99-116 ；SEQID NO. :37 的残基 24-39 ;SEQID NO. :37 的残基 55-61 ;SEQID NO. :37 的残基94-102 ；SEQID NO. :38 的残基 31-35 ;SEQID NO. :38 的残基 50-66 ;SEQID NO. :38 的残基99-108 ；SEQID NO. :39 的残基 24-35 ;SEQID NO. :39 的残基 51-57 ;SEQID NO. :39 的残基90—98 ； SEQID NO. :40 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :40 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :40 的残基97-109 ；SEQ ID NO. 41 的残基 24-40 ；SEQ ID NO. :41 的残基 56-62 ；SEQ ID NO. :41 的残基95-103。
3.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDRs。
4.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括ー个VH。
5.根据权利要求4的结合蛋白，其中所述Vh包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO :10 ;SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO :14 ;SEQ IDNO :16 ；SEQ ID NO :18 ；SEQ ID NO :20 ；SEQID NO :22 ；SEQ ID NO :24 ；SEQ ID NO :26 ；SEQ IDNO 28 ；SEQ IDNO :30 ；SEQ ID NO :32 ；SEQ ID NO :34 ；SEQ ID NO :36 ；SEQ ID NO :38 ;和SEQID NO :40。
6.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括一个ん。
7.根据权利要求6的结合蛋白，其中所述\包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQID NO 11 ；SEQ ID NO :13 ；SEQID NO :15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO :19 ；SEQ ID NO :21 ；SEQ IDNO:23 ；SEQ ID NO :25 ；SEQ ID NO :27 ；SET M NO 29 ；SEQID NO :31 ；SEQ ID NO :33 ；SEQ ID NO :35 ；SEQ ID NO :37 ；SEQ ID NO :39 ;和 SEQIDNO :41。
8.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括一个Vh和一个ん。
9.根据权利要求7的结合蛋白，进ー步包括一个Vh，其中所述Vh包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO :10 ；SEQ ID NO :12 ；SEQ ID NO :14 ；SEQ IDNO 16 ；SEQ ID NO :18 ；SEQ ID NO :20 ；SEQ ID NO :22 ；SEQ ID NO :24 ；SEQ ID NO :26 ；SEQID NO 28 ；SEQ ID NO :30 ；SEQ ID NO :32 ；SEQID NO :34 ；SEQID NO :36 ；SEQ ID NO :38 ;和SEQ ID NO 40o
10.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述ん包括SEQID NO :7的氨基酸序列，所述Vh包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
11.根据权利要求2的结合蛋白，进ー步包括选自人IgM恒定区；人IgGl恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。
12.根据权利要求11的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定区是人IgGl恒定区。
13.根据权利要求12的结合蛋白，其中所述人IgGl恒定区包括选自SEQID NO. :2，和SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。
14.根据权利要求2的结合蛋白，进ー步包括选自人IgK恒定区，和人IgX恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。
15.根据权利要求14的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区是人IgK恒定区，包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4的氨基酸序列。
16.根据权利要求14的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区是包括SEQIDNO. :5的氨基酸序列的人IgX恒定区。
17.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自免疫球蛋白分子，scFv;单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab'片段；F(ab' )2 ；Fv ; ニ硫键连接的Fv。
18.根据权利要求17的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
19.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括 具有选自SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列的Ig重链恒定区； 具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻链恒定区； 具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和 具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
20.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括 具有SEQ ID NO : 3的氨基酸序列的Ig重链恒定区； 具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的IG轻链恒定区； 具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和 具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
21.—种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白包括权利要求I- 20任ー项的结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能中和IL-18。
22.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述IL-18选自人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18。
23.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减小了IL-18结合其受体的能力。
24.根据权利要求23的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
25.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能减小选自下面的IL-18生物活性中的ー种或几种Thl调节；Th2调节；Nk调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；嗜酸性细胞调节细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。
26.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(Kd):最大大约10_7M ;最大大约10_8M ;最大大约10_9M ;最大大约ΙΟ,Μ ;最大大约10_ηΜ ；最大大约KT12M ;和最大大约10_13Μ。
27.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的生成速率至少大约IO2M-1S-1 ;至少大约IO3M-1S-1 ;至少大约IO4M-1S-1 ;至少大约10 -1 s—1 ;和至少大约 IO6IT1S'
28.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的离解速率最大大约KTY1 ;最大大约KT4Sヽ；最大大约KTiV1 ;和最大大约KT6S'
29.包括权利要求1-20任一项的结合蛋白的标记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物偶联。
30.权利要求29的标记结合蛋白，其中所述可检测标记物选自放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。
31.权利要求30的标记结合蛋白，其中所述标记物是选自3H,14C，35S,90Y,"Tc,111In,125I，131I，177Lu，166Ho，和 153Sm 的放射性标记物。
32.包括权利要求1-20任一项的结合蛋白的偶联结合蛋白，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质偶联。
33.权利要求32的偶联结合蛋白，其中所述治疗性或细胞毒性物质选自杭-代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗-血管生成药物；抗-有丝分裂物质；蒽环霉素A ;毒素；和编程性细胞死亡剂。
34.编码权利要求1-20任一项的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸。
35.包含权利要求34的分离的核酸的载体。
36.权利要求35的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT ；pTT3 ；pEFBOS ；pBV ；pJV ;和pBJ。
37.包含权利要求35或36任一项的载体的宿主细胞。
38.根据权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
39.根据权利要求38的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
40.根据权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
41.根据权利要求40的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。
42.根据权利要求41的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞，鸟类细胞，和昆虫细胞的动物细胞。
43.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述动物细胞是CHO细胞。
44.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS。
45.根据权利要求41的宿主细胞，其中所述真核细胞是啤酒糖酵母。
46.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述动物细胞是昆虫Sf9细胞。
47.结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括在足以产生结合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养权利要求37-46任ー项的宿主细胞。
48.根据权利要求47的方法制备的结合蛋白。
49.包括根据权利要求1-28任一项的结合蛋白的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。
50.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述晶体是没有载体的药学控制释放晶体。
51.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。
52.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留其生物活性。
53.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物含有 (a)一种组合物，其中所述组合物含有根据权利要求49-52任一项的结晶结合蛋白，和ー种成分；和 (b)至少ー种聚合物载体。
54.根据权利要求53的组合物，其中所述聚合物载体选自下面的ー种或几种 聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酷)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)，聚(酷)，聚(乳酸)，聚(乳酸-共-羟基こ酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚(Y-己内酷)，聚(ニ氧六环酮) ’聚(こニ醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有机)磷腈]，聚(原酷)，聚(こ烯醇)，聚(こ烯吡咯烷酮)，马来酸酐-烷基こ烯基醚共聚物，多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖，glycaminoglycans,硫酸多糖，它们的混合物和它们的共聚物。
55.根据权利要求53的组合物，其中所述成分选自白蛋白，蔗糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基-β -环糊精，甲氧基聚こニ醇和聚こニ醇。
56.对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动物施用有效量的根据权利要求53的组合物的步骤。
57.一种感兴趣的基因的基因表达的调控方法，包括下面的步骤 (a)提供IL-18调节剂；和 (b)所述调节剂接触细胞， 其中所述感兴趣的基因选自下面Genbank鉴定号确定的基因NM_000389, NM_002198, NM_002163, NM_006144, NM_006515, NM_185,NM_002288, NM_003661, NM_021958, NM_001335, Hs. 382006，NM_020125,NM_007210, NM_021798, NM_013324, M11313, D88152, NM_001103,U37519, NM_000697, J03600, NM_014578, S66793, U47054,L19871, M81181, NM_001188, U15460, NM_014417, Z23115,NM_001713, U45878, U37546, U72649, U49187, J03507,U50360, XM_071866, NM_005623, Z32765, Zl 1697，XM_071866,U51096, M83667, D87469, L07765, U66468, X14830,L29217, X15880, NM_001851, M27691, M37435, X13589,X16866, X59131, NM_004393, U73328, L19267, U53445,X68277, U48807, NM_001950, U87269, M57730, X52541,J04076, X63741, L07077, M62831, M60830, U53786,NM_001988, NM_000141, M23668, U60062, NM_141, U49973,U89995, U27326, A28102, M25667, L34357, U19523,L01406, U03486, X68285, Z18859, D49958, D43772,AC000099, M57731, X53800, M91036, D16583, X64877,X58431, M16937, NM_014468, X92814, L19314, M26665,D10995, L41147, M24283, S81914, J03171, J00219,NM_000619, NM_000585, U31628, X04500, M27492, X01057,M26062, Y00081, Y00787, Z31695, X06256, X57206,U20734, NM_014879, D31762, D42038, NM_005551, NM_014846,X06182, NM_005551, X07730, M13955, M57710, S83362,NM_002314, NM_005569, U49957, U89922, X140008, U59914,D14497, X59727, NM_000429, U43944, X72755, NM_021230,NM_005951, X78710, X70991, M32011, S77763, M58603,S76638, M69043, U91616, D86425, L13740, U44848,U79251, M27288, AF000234, D50640, L20971, L10343,U77735, NM_003579, U17034, AB000584, X63131, D11428,NM_032940, NM_005035, NM_003579, M18255, L01087, D38128,Y10375, D15049, M31166, U59877, NM_003579, U64675,S57153, NM_002903, NG_000013, X75042, M83221, NM_000537,U22314, S59049, U70426, U22377, U38480, L10338,M23178, M69203, NM_005409, D79206, NM_005065, NM_004186,J03764, NM_006802, D89077, NM_003037, M91463, D82326,L05568, U96094, X83301, D21267, L31529, M62800,NM_021014, Z35093, NM_005816, L25444, M95787, NM_005421,L47345, M57732, NM_003205, M96956, U19878, M92357,M59465, X83490, U37518, NM_003294, U19261, U78798,S69790, U53476, L15309, U78722, X57809, U79249,AB000464, X77744, U79248, AI420129,HG2981-HT3127, HG3548-HT3749, HG870-HT870, HG4333-HT4603,HG3111-HT3287, HG4593-HT4998，HG961-HT961，HG1877-HT1917，HG3115-HT3291, HG4115-HT4385，和 HG3925-HT4195。
58.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂是拮抗剂。
59.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂是IL-18。
60.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂选自根据权利要求1-28任ー项的结合蛋白。
61.含有权利要求1-28任一项的结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。
62.权利要求61的药物组合物，其进ー步含有至少ー种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的另外的治疗药物。
63.权利要求62的药物组合物，其中所述另外的药物选自血管生成抑制剂；激酶抑制齐IJ ;共同-刺激分子阻断剂；粘着分子阻断剂；抗-细胞因子抗体或者其功能片段；甲氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;和非留类抗炎药物。
64.ー种减小人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接触权利要求1_28任一项的结合蛋白，使得人IL-18活性被减小。
65.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病的人患者减小人IL-18活性的方法，包括对人受治疗者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白，使得人受治疗者中的人IL-18活性被减小。
66.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病或病症的受治疗者进行治疗的方法，包括对受治疗者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白，完成治疗。
67.权利要求66的方法，其中所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状腺炎，哮喘，变态反应疾病，牛皮癣，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排异，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾病，肉状瘤病，动脉粥样硬化，传播性血管凝固，Kaw阿司匹林ki' s病，Grave ' s病，肾病综合征,慢性疲劳综合征，Wegener' s肉芽肿病，Henoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染病，由寄生虫引起的疾病，后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髄炎，Huntington' s舞蹈病，帕金森病,早老性痴呆，中风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞，Addi son' s病，散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt' s综合征，成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节病，关节病，Reiter' s病，牛皮癣关节病，溃疡性结肠关节病，肠滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙门氏菌相关关节病，脊椎关节病，动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱病，寻常性 天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮，线性IgA病，自身免疫溶血性贫血，Coombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free病，慢性粘膜皮肤念珠菌病，巨细胞关节炎，原发硬化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾病，こ肝，丙肝，普通各式各样的免疫缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白減少)，膨胀心肌病，女性不孕症，卵巣衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺病，起因不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后间质肺病，间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾病，与肺病相关的混合缔结组织疾病，与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性关节炎，与肺病相关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的Sjogren' s病，与肺病相关的僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺病，与肺病相关的含鉄血黄素沉着病，药物引起的间质肺病，辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸润性肺病，传染病后间质肺病，痛风关节炎，自身免疫肝炎，I-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能減退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免疫疾病，骨关节炎，原发硬化胆管炎，I型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞減少，自身免疫中性白细胞減少，肾病N0S，肾小球肾炎，肾microscopicvasulitis，莱姆病，盘形红斑狼疮，特发性男性不孕症或N0S，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture' s综合征,结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Stiir s病,全身硬化，Sjogren' s综合征，Takayasu' s病/动脉炎，自身免疫血小板減少，特发性血小板減少，自身免疫甲状腺病，甲状腺机能亢进，甲状腺肿自身免疫甲状腺机能亢进(Hashimoto' s病)，萎縮性自身免疫甲状腺机能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的肝损伤，choleosatatis，特应性肝病，药物引起的肝炎，非酒精性脂肪性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Thl型介导的疾病，急性和慢性疼痛，和癌症。
68.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者进行治疗的方法，包括在施用第ニ种药物之前，同时，或之后对患者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种药物选自能结合人IL-12的抗体，或其片段；甲氨喋呤；能结合人TNF的抗体，或其片段；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;和非留类抗炎药物。
69.ー种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
70.根据权利要求I的结合蛋白，其中所述结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。
71.—种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
72.根据权利要求I的结合蛋白，其中所述结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
73.—种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
74.根据权利要求I的结合蛋白，其中所述结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
75.—种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2. 5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
76.根据权利要求I的结合蛋白，其中所述结合蛋白不能与选自2.5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
77.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述\包括SEQID NO :9的氨基酸序列，和所述Vh包括SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
78.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括 具有选自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO 3的氨基酸序列的Ig重链恒定区； 具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻链恒定区； 具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和 具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
79.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括 具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的Ig重链恒定区； 具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG轻链恒定区； 具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和 具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
全文摘要
本发明涉及IL-18结合蛋白，特别是结合人白介素-18(hIL-18)的抗体。具体地说，本发明涉及全人抗体的抗体。优选地，抗体具有体外和体内对于hIL-18的高亲和性和/或中和hIL-18的性质。本发明的抗体可以是全长抗体或者其抗原结合部分。还提供了本发明抗体的制备方法和使用方法。本发明的抗体或抗体部分用于对例如患有其中hIL-18活性是有害的疾病的人受治疗者检测hIL-18和用于抑制hIL-18活性。
文档编号G01N33/68GK102659944SQ20121012931
公开日2012年9月12日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者B·拉布科夫斯基, B·赫德伯格, J·S·康, J·W·沃斯, J·巴布库克, J·韦勒, L·格林, T·加于尔, X·-C·贾 申请人:雅培制药有限公司