专利名称：以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法
技术领域：
本发明涉及以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速含量测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术：
金纳米粒子由于其易于制备和生物功能化、优良的生物稳定性和独特的光谱特性已受到广泛的关注。金纳米粒子的表面等离子吸收带位于电磁波谱的可见光区，并受纳米聚集体的形貌的影响。典型的胶体纳米金粒子为酒红色，而它们的聚集体则呈现紫色或蓝色，这是由于纳米金的表面等离子吸收带向长波长移动所致。基于这一原理的方法可用于细胞、蛋白质、DNA、金属离子等各种分析物的检测。三聚氰胺(1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，C3H6N6)是一种常见的化学物质，主要用于生产三聚氰胺甲醛树脂。由于其氮含量高(66.6%)、成本低，三聚氰胺常被非法添加入食物中，以在传统的凯氏或杜马斯法测定中产生蛋白质含量高的假象。长期膳食摄入过量三聚氰胺可导致婴儿和宠物的肾功能衰竭和死亡。因此，需要建立可以提供现场实时检测食品中三聚氰胺的可靠和高灵敏度方法。目前，三聚氰胺的检测方法主要包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、串联质谱法(MS/ MS)、毛细管电泳法(CE)、化学发光法(CL)、红外光谱法(IR)、拉曼光谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核磁共振法(NMR)等。然而，这些方法由于需要复杂的样品预处理过程，相对费时。此外，这些分析技术需要昂贵和先进的检测仪器，并由受过专业训练的人员操作，因此难以广泛应用。近来，I- (2-巯基)-I, 3，5-三嗪-2，4，6_三酮、冠醚、3 -巯基-I-丙烷磺酸钠、核黄素、半胱胺、单链寡核苷酸修饰的金纳米粒子均被作为显色探针用于原料奶和婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺检测。这些方法大多表现出相当高的灵敏度，但金纳米粒子复杂的修饰过程在一定程度上限制了它们的应用。在金纳米粒子的形成过程中比色法检测三聚氰胺的技术也有报道，但非常费时。使用未改性的金纳米粒子(实际上为柠檬酸覆盖的金纳米粒子)作为显色探针已建立了更简单的三聚氰胺检测方法，但均灵敏度欠佳。本发明直接以硼氢化钠还原法制备的裸纳米金作为显色探针，所得到的裸纳米金表面吸附有 AuCI4VAuCI2-离子(文献A. Kumar, S. Mandal, P. R. Selvakannan, R.Pasricha， A. B. Mandale， and M. Sastry, Investigation into the Interactionbetween Surface-Bound Alkylamines and Gold Nanoparticles, Langmuir 2003， 19，6277-6282)，利用三聚氰胺的环外氨基与裸纳米金表面吸附的AuC147AuC12_离子的静电作用与共价作用，提供了一种快速、简便、灵敏的三聚氰胺检测新方法。
发明内容
本发明的目的是以硼氢化钠还原法制备的裸纳米金为显色探针，提供了一种快速、简便、灵敏的三聚氰胺检测新方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
本发明所述的一种以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用三聚氰胺的环外氨基与裸纳米金表面吸附的AuC147AuC12_离子的作用，导致纳米金聚集而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，来测定三聚氰胺浓度。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用目视观察溶液颜色特征以判断三聚氰胺的浓度。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用吸光度比 值A65tZA518以判断三聚氰胺的浓度。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是所使用的裸纳米金采用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备，将500 UL浓度为0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入0. 8毫升浓度为0. I g/L的硼氢化钠水溶液，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌而形成裸纳米金。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，40-50°C反应5-10分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65(i/A518，当目视观察颜色特征时，随着三聚氰胺浓度的增大，纳米金的颜色逐渐由酒红色变为紫红色-紫色-蓝紫色-蓝色，目视观察的检测限为0.05 mg/L;当测定吸光度比值A65tlA518时，随着三聚氰胺浓度的增大而吸光度比值a65(i/a518逐渐增大,在5^200 u g/L范围内吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系，检测限为0.2 yg/L。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是所使用的裸纳米金平均粒径为8. I nm,最大吸收波长为518 nm。所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比I: I混合，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0. 01 mol/L、pH=3. 0，在40°C下反应5分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65tlA518以判断三聚氰胺的浓度；裸纳米金溶液和含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液的体积分别为0. 2 mL。本发明所述的以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，包括如下步骤1)将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，40-50°C反应5-10分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65(i/A518，当测定吸光度比值A65ciA518时，随着三聚氰胺浓度的增大而吸光度比值A65tlA518逐渐增大，获得在5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系值；2)奶粉样品的预处理在奶粉中加入三氯乙酸和甲醇，振摇后取适量上清液，氮气吹干，加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得样品溶液，测定吸光度比值A65tlA518，从5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度的线性关系值中获得奶粉中的三聚氰胺含量。所述的以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是奶粉样品的预处理为在2. 0 g奶粉中加入0.2 mL浓度为lwt%三氯乙酸和2.0 mL甲醇，振摇2分钟后取其I. 0 mL的上清液，氮气吹干，加入I. 0 mL浓度为0. 01 mol/L、pH=3的磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得样品溶液。
所述的以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0. 01 mol/L、pH=3. 0，40°C反应5分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65(l/A518，获得在5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系值；裸纳米金溶液和含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液的体积分别为0. 2 mL。具体步骤为
(一)裸纳米金的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。裸纳米金的制备首先，500 u L浓度为0. I g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入0. 8毫升浓度为0. I g/L的硼氢化钠水溶液(加入时间控制在5分钟内)，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌I小时。所得的裸纳米金平均粒径为8. I ±1.1 nm，最大吸收波长为518 nm, 4 °C保存，能保持至少两个月的相对稳定。(二)三聚氰胺的测定
0.2毫升三聚氰胺样品溶液中加入0. 2毫升步骤(一)制备的裸纳米金溶液，混合后在40°C反应5分钟，目视观察颜色的变化或测定650 nm与518 nm波长处的吸光度比值(A65tl/A518)。根据溶液颜色与比色标准系列比较或通过吸光度比值标准曲线进行定量。目视观察的检测限为50 Ug/L，吸光度比值测定的检测限为0.2 yg/L。本发明的优点
(I)本发明基于三聚氰胺的环外氨基与裸纳米金表面吸附的AuC147AuC12-离子的静电作用与共价作用，导致纳米金聚集，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，通过奶粉样品简单的预处理，可以直接用于三聚氰胺的含量检测。2)本方法所使用的纳米金直接由硼氢化钠还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。3)本发明对样品的处理要求低，奶粉样品仅需加入三氯乙酸和甲醇，沉淀蛋白并提取三聚氰胺，上清液除去甲醇用缓冲液溶解后即可测定。4)本发明的检测速度快，可以在10分钟内完成实际奶粉样品的预处理和检测。5)本发明的检测灵敏度高，通过肉眼观察颜色变化的检测限为50 U g/L,吸光度比值测定的检测限为0.2 yg/L。
图I为裸纳米金的透射电镜图。图1-1纳米金的粒径分布图。图2为裸纳米金的紫外吸收光谱图。图3为裸纳米金与三聚氰胺作用后的紫外吸收光谱图。图4为裸纳米金与三聚氰胺作用后的透射电镜图。 图5为不同pH条件下裸纳米金与三聚氰胺作用后的吸光度比值图。图6为不同温度条件下裸纳米金与三聚氰胺作用后的吸光度比值图。图7为裸纳米金与三聚氰胺作用后的吸光度比值随时间的变化图。
图8为裸纳米金与不同浓度三聚氰胺作用后的颜色变化图，图中从左到右依次是酒红色、紫红色、紫色、蓝紫色及蓝色。图9为裸纳米金与不同浓度三聚氰胺作用后的吸光度比值变化图。
具体实施例方式实施例I :
裸纳米金的制备首先，500 UL浓度为0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入0. 8毫升浓度为0. I g/L的硼氢化钠水溶液(加入时间控制在5分钟内)，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌I小时。所得的裸纳米金平均粒径为8. 1±1. I nm (见图1，图1-1)波长为518 nm (见图2)，4 °C保存，裸纳米金能保持至少两个月、相对稳定。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
实施例2
三聚氰胺与裸纳米金相互作用在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金中加入0. 2毫升含0.1 mg/L三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01 mol/L，pH=3)，40摄氏度反应5分钟。裸纳米金颜色由酒红色变为蓝色，最大吸收波长红移(见图3)，从透射电镜图中可明显看到聚集的纳米金(见图4)。实施例3
三聚氰胺与裸纳米金相互作用在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金中加入0. 2毫升含有0. I mg/L三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01 mol/L,pH=3-12),40摄氏度反应5分钟，测定吸光度比值A65Q/A518。如图5所示，吸光度比值A65tlA518在pH=3时达到最大。实施例4
三聚氰胺与裸纳米金相互作用在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金中加入0. 2毫升含有0. I mg/L三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0. 01 mol/L, pH=3),20-60摄氏度反应5分钟，测定吸光度比值A65(i/A518。如图6所示，扣除空白后吸光度比值A65tZA518在40-50 °C时达到最大。实施例5
三聚氰胺与裸纳米金相互作用在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金中加入0. 2毫升含有0.1 mg/L三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01 mol/L,pH=3), 40摄氏度反应1-10分钟，测定吸光度比值A65(i/A518。如图7所示，吸光度比值A65tlA518在5分钟后达到最大。实施例6
三聚氰胺的测定在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金溶液中加入0. 2毫升含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01 mol/L, pH=3)，混合后在40°C反应5分钟，目视观察颜色的变化，结果如图8所示。当不含三聚氰胺时，溶液显酒红色；三聚氰胺浓度为50 U g/L时，溶液显紫红色；三聚氰胺浓度为80 U g/L时，溶液显紫色；三聚氰胺浓度为100 u g/L时，溶液显蓝紫色；三聚氰胺浓度为500 u g/L时，溶液显蓝色。实施例I 三聚氰胺的测定在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金溶液中加入0. 2毫升含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01 mol/L, pH=3)，混合后在40°C反应5分钟，测定吸光度比值A65(i/A518。如图9所示，吸光度比值随三聚氰胺浓度的增大而增大，在5 200 u g/L范围内吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系，检测限为0.2 Ug/L0实施例8:
奶粉中三聚氰胺的测定在2. 0 g奶粉中加入0. 2 mL lwt%三氯乙酸和2. 0 mL甲醇，振摇2分钟。取1.0 mL上清液，氮气吹干，加入1.0 mL磷酸盐缓冲溶液(浓度为0.01 mol/L, pH=3)溶解残渣，得样品溶液。在0. 2毫升实施例I制得的裸纳米金溶液中加入0. 2毫升上述的样品溶液，混合后在40°C反应5分钟，目视观察颜色变化或测定吸光度比值A65tl/A5180结合实施例7计算奶粉中三聚氰胺的含量，样品的测定回收率为97. 69^107%，相对标 准偏差为0. 8-2. 4%。
权利要求
1.一种以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用三聚氰胺的环外氨基与裸纳米金表面吸附的AuC147AuC12-离子的作用，导致纳米金聚集而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，来测定三聚氰胺浓度。
2.根据权利要求I所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用目视观察溶液颜色特征以判断三聚氰胺的浓度。
3.根据权利要求I所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是利用吸光度比值A65tlA518以判断三聚氰胺的浓度。
4.根据权利要求I所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是所使用的裸纳米金采用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备，将500 UL浓度为0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入0. 8毫升浓度为0. I g/L的硼氢化钠水溶液，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌而形成裸纳米金。
5.根据权利要求I或4所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比I: I混合，40-50°C反应5-10分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65(i/A518，当目视观察颜色特征时，随着三聚氰胺浓度的增大，纳米金的颜色逐渐由酒红色变为紫红色-紫色-蓝紫色-蓝色，目视观察的检测限为.0.05 mg/L ;当测定吸光度比值A65tlA518时，随着三聚氰胺浓度的增大而吸光度比值A65tlA518逐渐增大，在5 200 u g/L范围内吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系，检测限为0.2V- g/L。
6.根据权利要求4所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是所使用的裸纳米金平均粒径为8. I nm,最大吸收波长为518 nm。
7.根据权利要求5所述的以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速测定方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为.0.01 mol/L、pH=3. 0，在40°C下反应5分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65tlA518以判断三聚氰胺的浓度；裸纳米金溶液和含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液的体积分别为0. 2 mL。
8.一种以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，包括如下步骤I)将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，40-50°C反应5-10分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65(i/A518，当测定吸光度比值A65tlA518时，随着三聚氰胺浓度的增大而吸光度比值A65(l/A518逐渐增大，获得在5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系值；2)奶粉样品的预处理在奶粉中加入三氯乙酸和甲醇，振摇后取适量上清液，氮气吹干，加入磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得样品溶液，测定吸光度比值A65tlA518，从5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度的线性关系值中获得奶粉中的三聚氰胺含量。
9.根据权利要求8所述的以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是奶粉样品的预处理为在2.0 g奶粉中加入0.2 mL浓度为lwt%三氯乙酸和.2.0 mL甲醇，振摇2分钟后取其1.0 mL的上清液，氮气吹干，加入1.0 mL浓度为0.01 mol/L、pH=3的磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，得样品溶液。
10.根据权利要求8或9所述的以裸纳米金为显色探针的快速测定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是将裸纳米金溶液分别与含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液混合，所述的裸纳米金溶液与不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液按体积比1:1混合，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0. 01 mol/L、pH=3. 0，40°C反应5分钟，目视观察颜色特征或测定吸光度比值A65tlA518，获得在5 200 u g/L范围内的吸光度比值与三聚氰胺浓度呈线性关系值；裸纳米金溶液和含不同浓度三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液的体积分别为0. 2 mL。
全文摘要
本发明公开一种以裸纳米金为显色探针的三聚氰胺快速含量测定方法。三聚氰胺的环外氨基与裸纳米金表面吸附的AuCl4-/AuCl2-离子的静电作用与共价作用，导致纳米金聚集，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化。目视观察的检测限为0.05mg/L。吸光度比值测定的线性范围为5~200μg/L，检测限为0.2μg/L。奶粉样品可通过简单的预处理后，采用该方法测定其中的三聚氰胺含量。
文档编号G01N21/29GK102706814SQ201210145529
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者刘爱林, 洪磊, 王胜, 邓豪华, 陈伟 申请人:福建医科大学