专利名称：鉴别纯化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法
技术领域：
本发明涉及胸腺肽a I的质量检测方法，尤其涉及一种鉴别纯化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法，属于胸腺肽a I的固相合成和检测领域。
背景技术：
胸腺肽a I是从胸腺素组分5 (TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽a I的含量为0.6%，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽a I可调节T淋巴细胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽a I能修复受损的T淋巴细胞。虽然从TF-5中分离的胸腺肽a I无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸腺肽a I可因不纯而造成不良反应。目前，人工固相合成胸腺肽aI的操作规程于篇律，几乎没有优化空间。市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽a I。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽a I是否纯，取决于它含的缺失肽的状况。与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽a I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽a I的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外即没有披露人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽a I的临床地位。为了改善这种状况，保障胸腺肽a I的临床用药安全性，形成了本发明。
发明内容
本发明的主要目的是提供种能够准确、灵敏的检测鉴别纯化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法；本发明的另一个目的是提供纯化后的胸腺肽a I的缺失肽谱并将该缺失肽谱作为胸腺肽a I固相合成中的质量控制物。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种鉴别胸腺肽a I纯品是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤:(1)将固相合成的胸腺肽a I进行纯化；(2)将纯化后的胸腺肽a I纯品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在20.78min时出现峰面积为0.36%的峰或在
27.19min时出现峰面积分别为0.47%的峰，则说明纯化后的胸腺肽a I中含有缺失肽。其中，所述缺失肽的氨基酸序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。本发明中所述的胸腺肽a I纯品可以是采用本领域的常规纯化方法进行纯化后所得到的纯品；作为参考，本发明中所述的胸腺肽a I纯品可以采用以下所述的方法进行两次纯化，其中，第一次纯化胸腺肽a I的方法优选为:采用配备Waters 2487检测器、Waters 600泵和迪马C 18制备柱的制备型HPLC进行纯化；紫外检测波长为215nm，用A和 B 梯度洗脱，流速为 10ml/min,梯度为 0_5min，10 % A/90 % B ；5-10min, 15 % A/85 % B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中 A 为含 0.09% TFA 的乙腈，B 为含0.1% TFA 的水。所述的第二次纯化胸腺肽α I的方法优选为:采用配备Waters 2487检测器、Waters 600泵和迪马C18制备柱的制备型HPLC进行纯化；紫外检测波长为215nm，用乙腈/醋酸/水梯度洗脱，流速为10ml/min，梯度为0_5min，10 %乙腈/I %醋酸/90 %水；5-10min,由10 %乙腈/I %醋酸/90 %水变至15 %乙腈/I %醋酸/85 %水；10_20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水变至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20_70min，由18%乙腈/I %醋酸/82%水变至25%乙腈/1%醋酸/75%水。其中，所述纯化方法中的迪马C 18制备柱的规格优选为10μπι、250Χ21.2mm。步骤(2)中所述的梯度洗脱条件优选为:用0.1 %甲酸/乙腈进行梯度洗脱，流速为0.4ml/min ;梯度为:0_30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10变至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由 0.1 % 甲酸 / 乙腈=80/20 变至 0.1 % 甲酸 / 乙腈=75/25。本发明方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样,Waters XterraRP 18分析柱的规格为5μπι，3.0X 150mm ;LC/MS联用仪中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，离子流检测器。本发明进一步提供了胸腺肽α I纯品的缺失肽谱，其氨基酸序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示；可将所述的缺失肽作为胸腺肽α I固相合成中的质量控制物。本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出胸腺肽α I纯品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α I中有重要应用价值。
图1胸腺肽α I纯品的离子流.
图2胸腺肽α I纯品的质谱.
图3胸腺肽α I纯品中的缺失肽
Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1 Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.1)的质谱。 图4胸腺肽α I纯品中的缺失肽Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.2)的质谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1固相合成胸腺肽α I1.制备 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin称取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反应合成柱中。加入60ml DCM溶胀树脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。于磨口三角瓶中称取 5.5g(9.3mmoI)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷却下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。将活化后的氨基酸加入用DMF洗好的树脂中，然后加入0.23g(l.86mmol)DMP，用氮气吹气进行搅拌，室温反应2_4h。反应结束后用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽干溶剂。取少量树脂，用甲醇收缩三次，真空干燥至恒重，测替代值，如替代值达到预期，将树脂用乙酸酐封闭未反应的羟基，封闭反应2-4h后，用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。用甲醇收缩树脂三次，每次50ml，吹气5min，抽走溶剂，真空干燥至恒重，测替代值。如替代值达到预期。2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶胀和脱 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反应合成柱中，加60ml DCM溶胀lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗涤树脂，每次用50mlDMF，每次洗2min，共洗三次。用浓度为20 %的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，一次脱3min，另一次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗搽Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。3.制备 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin称取2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g(5.5mmol)H0Bt 于干燥磨口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷却。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后将活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反应2h。抽走反应液。用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。树脂对茚三酮不显色。用浓度为20%的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，第一次脱3min，第二次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤树脂，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。4.制备Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-GIu-(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin按照制备Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 的方法依次将 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，2.12g (4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，
2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,3.17g (7.47mmoI)Fmoc-Glu (OtBu)，3.50g (7.47mmoI)Fmoc-Lys (Boc)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，4.23g (9.96mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-Leu，4.09g(9.96mmoI) Fmoc-Asp(OtBu)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-1le，3.17g(7.47mmol)Fmoc-GIu(OtBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser (tBu)，
2.86g (7.47mmol) Fmoc-Ser (tBu)，2.97g (7.47mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.07g (7.47mmol)Fmoc-Asp (OtBu),2.53g (7.47mmol)Fmoc_Val，2.32g (7.47mmoI)Fmoc-Ala，
3.1Og(9.96mmol) Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.8Ig(9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶联到 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin 上并脱 Fmoc。5.制备Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin0°C下将1.18ml (12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中与50mlDMF混合，然后加
0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。将活化后的乙酸酐与 Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Va
1-Val-Glu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 反应 2h。抽走反应液。树脂用DMF洗涤4次，每次50ml DMF,每次洗2min。树脂用DCM洗涤2次，每次用50mlDCM，每次洗3min。抽走溶剂。树脂对茚三酮不显色。树脂用MeOH收缩3次，每次用50mlMeOH，每次收缩5min，抽干。得18.5g干燥肽树脂。低温保存。6.从Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin切害胸腺肽α I0°C下将18.5g干燥的肽树脂与180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反应0.5h，室温反应2.5h。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。树脂用少量TFA洗涤三次。合并的滤液用0°C的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。离心分离出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用0°C的乙醚洗涤粗肽三次，用N2吹走残余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率为81%，含量为68 %。实施例2固相合成胸腺肽α I的纯化1.固相合成胸腺肽α I的一次纯化Waters 2487 检测器，Waters 600 泵，迪马 C 18 制备柱(10 μ m，250X21.2mm)，紫外检测器，波长215nm，TFA/乙腈/水梯度洗脱，洗脱梯度列入表I。表I胸腺肽α I粗品一次纯化的洗脱梯度
权利要求
1.一种鉴别纯化后的胸腺肽α I是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤:(1)将固相合成的胸腺肽α I进行纯化；(2)将纯化后的胸腺肽α I纯品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在20.78min时出现峰面积为0.36%的峰或在27.19min时出现峰面积分别为0.47%的峰，则说明纯化后的胸腺肽α I中含有缺失肽。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列为SEQID N0.1或 SEQ ID N0.2 所示。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:(I)将固相合成的胸腺肽αI进行第一次纯化和第二次纯化。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一次纯化胸腺肽αI的方法包括:采用配备Waters 2487检测器、Waters 600泵和迪马C18制备柱的制备型HPLC进行纯化；紫外检测波长为215nm，用A和B梯度洗脱，流速为10ml/min，梯度为0_5min，10%A/90% B ；5-10min, 15% A/85% B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中A为含0.09% TFA的乙腈，B为含0.1% TFA的水。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第二次纯化胸腺肽αI的方法包括:采用配备Waters 2487检测器、Waters 600泵和迪马C18制备柱的制备型HPLC进行纯化；紫外检测波长为215nm,用乙腈/醋酸/水梯度洗脱，流速为10ml/min,梯度为0_5min,10%乙腈/I %醋酸/90%水；5-10min，由10%乙腈/I %醋酸/90%水变至15%乙腈/I %醋酸/85%水；10-20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水变至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20-70min,由18%乙腈/I %醋酸/82%水变至25%乙腈/I %醋酸/75%水。
6.按照权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述迪马C18制备柱的规格为10μ m、250 X 21.2mm。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱条件为用0.1%甲酸/乙腈进行梯度洗脱，流速为0.4ml/min ;梯度为:0-30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10变至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由0.1 %甲酸/乙腈=80/20变至0.1 %甲酸/乙腈=75/25。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，LC/MS联用仪中的LC采用Agilent1200自动进样，Waters Xterra RP18分析柱的规格为5 μ m，3.0 X 150mm ;LC/MS联用仪中的MS采用Bruker Solatix FT-1CR-MS,离子流检测器。
9.SEQ ID N0.1所示的寡肽作为胸腺肽α I固相合成中的质量控制物中的应用。
10.SEQ ID N0.2所示的寡肽作为胸腺肽α I固相合成中的质量控制物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别纯化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤(1)将固相合成的胸腺肽α1进行第一次纯化和第二次纯化；(2)将两次纯化后的胸腺肽α1纯品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在20.78min时出现峰面积为0.36％的峰或在27.19min时出现峰面积分别为0.47％的峰，则说明纯化后的胸腺肽α1中含有缺失肽。本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出胸腺肽α1纯品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1中有重要应用价值。
文档编号G01N30/02GK103163236SQ20121023953
公开日2013年6月19日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者朱正兵, 彭涛, 王玲, 张金花 申请人:海南合瑞制药股份有限公司