专利名称：生物荧光显微检测仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及显微检测仪器设计及制造领域，尤其是涉及ー种生物荧光显微检测仪器。
背景技术：
全内反射显微成像技术和共聚焦显微成像技术各有优缺点全内反射显微成像具有很高的轴向分辨率，但其横向分辨率较低；共聚焦显微成像具有很高的横向分辨率，但其轴向分辨率较差。如何在一台显微镜中同时利用全内反射显微成像高的轴向分辨率和共聚焦显微成像高的横向分辨率尤为重要。发明专利申请CN201080024155.9中提出了将全内反射荧光图像和共焦图像简单且正确地重合的图像处理装置、程序和显微镜，该发明中包含了两套显微镜，一套是全内反射显微镜，另ー套是共聚焦显微镜，但两套显微镜是分开工作的，通过光路切換的方法先获得一套显微镜的图像，再获得另一套显微镜的图像，最后计算机再利用两套图像中的基准点将两套图像进行了重合。该方法虽然生成了全内反射荧光图像和共焦图像的重合图像，由于两种显微镜是先后工作的，在物理上并不能同时得到三维高分辨率图像；另外该发明要先后操作两个显微镜拍摄图像，并要对图像进行重合，显微镜结构比较复杂，控制系统的构成也比较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供ー种集成全内反射显微成像技术和共聚焦显微成像技术的生物荧光显微检测仪器，该生物荧光显微检测仪器在横向及轴向上具有很高的分辨率。本发明的技术方案是生物荧光显微检测仪器包括激发光照明単元、激发光和荧光隔离单元、反射单元、显微成像单元、突光探测单元及控制单元；所述激发光照明単元包括激光光源、第一扩束镜、第二扩束镜；所述第一扩束镜及第二扩束镜之间设有照明针孔，且所述照明针孔位于所述第一扩束镜的焦点处；所述激发光和荧光隔离单元包括激发光滤色片、二色镜、荧光滤色片；所述反射单元为平面反射镜；所述显微成像単元包括中继透镜、筒镜、环形光束整形组件、显微物镜，所述环形光束整形组件包括设于所述筒镜及显微物镜之间的环形滤光片，所述环形滤光片具有将激光截止的内环区域和透射激光的环带区域，该内环区域和环带区域均可透射荧光；所述内环区域的半径不小于刚好能发生全内反射时所述显微物镜入瞳位置的临界半径；所述荧光探测单元包括成像镜头、光电倍增管，该成像镜头与所述光电倍増管之间设有成像探测针孔，所述成像探测针孔位于所述成像镜头的焦点处；待观察对象与所述照明针孔和成像探测针孔处于共轭位置上；所述光电倍増管可探测荧光，并将所述荧光转换成电信号；所述第一扩束镜、照明针孔、第二扩束镜、激发光滤色片、二色镜、反射単元、中继透镜、筒镜、环形滤光片及显微物镜依次沿始于所述激光光源的光轴线设置，且所述显微物镜、环形滤光片、筒镜、中继透镜、反射単元、二色镜、荧光滤色片、成像镜头、成像探测针孔及光电倍增管依次沿始于由待观察对象激发的荧光光轴线设置；所述控制単元，与所述光电倍増管电性连接，用于采集所述电信号并生成待观察物质中ー个点图像。下面对上述技术方案进ー步解释所述环带区域的宽度可调节。所述显微物镜为无穷远消像差型大数值孔径的浸油物镜。所述控制单元还与所述激光光源电性连接，用于控制激光的波长和功率。本发明的优点是I.本发明提供的生物荧光显微检测仪器在第一扩束镜及第ニ扩束镜之间且位于 第一扩束镜的焦点处设有照明针孔，在成像镜头和光电倍增管之间且位于成像镜头的焦点处设有成像探测针孔，有效提高了该仪器的横向分辨率；同时，在筒镜及显微物镜之间设置环形滤光片，提高了该生物荧光显微检测仪器在轴向的分辨率。2.本发明提供的生物荧光显微检测仪器由于入射激光光束经显微成像单元聚焦在区域面积约为艾利斑大小的点状区域内，即只有一个面积很小厚度很薄区域内的荧光物质能够被激发，而其它区域内的荧光物质不会被激发，即从源头上消除了杂散光的来源，因而具有很高的成像信噪比。
图I为本发明实施例提供的生物荧光显微检测仪器结构示意图。图2为本发明实施例提供的环形滤光片的结构示意图。图3为本发明实施例提供的环形光束通过显微物镜的光路传播示意图。其中激发光照明単元110、激光光源111、第一扩束镜112、第二扩束镜113、照明针孔114、激发光和荧光隔离单元120、激发光滤色片121、二色镜122、荧光滤色片123、反射単元130、显微成像単元140、中继透镜141、筒镜142、环形光束整形组件143、显微物镜144、环形滤光片1432、荧光探测单元150、成像镜头151、光电倍增管152、成像探测针孔153、控制单元160。
具体实施例方式请參考图I至图3。图I中标有单向箭头的光路为激光传播光路；标有双向箭头的光路表不为突光传播光路。实施例生物荧光显微检测仪器100包括激发光照明単元110、激发光和荧光隔离单元120、反射单元130、显微成像单元140、突光探测单元150及控制单元160。激发光照明单元110包括激光光源111、第一扩束镜112、第二扩束镜113。在第一扩束镜112和第二扩束镜113之间且位于第一扩束镜112的焦点处设有照明针孔114。激发光和荧光隔离单元120包括激发光滤色片121、二色镜122、荧光滤色片123。激发光滤色121片用于接收激光，滤除激光中偏离中心波长的光束，并透射激光中中心波长处的光束。二色镜122接收并反射经激发光滤色片121透射的激光，并透射荧光。荧光滤色片123接收并透射经二色镜122透射的荧光，并截止激光。反射単元130为平面反射镜，用于反射激光和荧光。
显微成像单元140包括中继透镜141、筒镜142、环形光束整形组件143、显微物镜144。环形光束整形组件143包括环形滤光片1432。该环形滤光片1432设置于筒镜142及显微物镜144之间，具有将激光截止的内环区域A和透射激光的环带区域B。内环区域A和环带区域B均可透射荧光。荧光探测单元150包括成像镜头151、光电倍增管152。在成像镜头151与光电倍增管152之间且位于成像镜头151的焦点处设有成像探测针孔153。待观察对象与照明针孔114和成像探测针孔153处于共轭位置上。光电倍增管152可探测荧光，并将荧光转换成电信号。其中，第一扩束镜112、照明针孔114、第二扩束镜113、激发光滤色片121、二色镜
122、反射单元130、中继透镜141、筒镜142、环形滤光片1432、显微物镜144依次沿始于激光光源111的光轴线设置；显微物镜144、环形滤光片1432、筒镜142、中继透镜141、反射单元130、二色镜122、荧光滤色片123、成像镜头151、成像探测针孔153、光电倍增管152依次沿始于由待观察对象激发的荧光光轴线设置。 激光光源111发射的准直激光依次经第一扩束镜112、照明针孔114、第二扩束镜113扩束后形成平行的激光束；该平行激光束依次经激发光滤色片121、二色镜122、反射单元130、中继透镜141、筒镜142后经环形光束整形组件143整形为环形光束，该环形光束经显微物镜144聚集于待观察对象处，并激发待观察对象产生荧光；该荧光光束依次经显微物镜144、环形滤光片1432、筒镜142、中继透镜141、反射单元130、二色镜122、荧光滤色片
123、成像镜头151后聚焦于成像探测针孔153处，光电倍增管152探测该荧光束并将其转换成电信号。控制单元160将光电倍増管152输出的微弱电信号进行放大，并对放大后的电信号进行实时采样。由于任意时刻，光电倍增管152只能收集ー个点位置荧光物质的光信息，并将光信号转换成电信号，控制单元160将采集到的电信号生成ー个定点位置的待观察对象图像。控制单元160还电性连接于激光光源111，用于控制入射激光波长选取和功率设置。在该生物荧光显微检测仪器100中，显微物镜144为无穷远消像差型大数值孔径的浸油物镜，由于环形光束的内环半径(图2中A区域的半径)不小于显微物镜144刚好能发生全内反射时入瞳位置处光束的临界半径，且盖玻片200和油300的折射率大致相同，这样进入显微物镜144的环形光束在盖玻片200和待观察对象所在的组织溶液400的交界处发生全反射，不能透过盖玻片200进行传播，但会在盖玻片200和组织溶液400的交界处形成隐失场(图3中C区)，隐失波能够激发界面附近的荧光分子，产生荧光。调整环形滤光片1432环带区域B的宽度可以改变穿出盖玻片200的隐失场的分布深度，从而可以改变荧光物质在Z轴方向的激发深度，可以实现Z轴方向不同分辨率的调节。隐失波的频率与入射光频率相同，其強度(単位面积和单位时间的能量)随离开界面的垂直距离呈指数衰减I (z) = I (O) e_z/d可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度z减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近ー薄层内。d是理论滲透深度，等于从界面处到隐失波強度衰减到界面处数值Ι/e的距离，d可表示为
d = ( λ 0/4 3i) Cn12Sin2 θ -η22)d与入射角(θ )、波长λ ^以及组织溶液400折射率(η2)和盖玻片200的折射率(Ii1)有夫。d随入射角増大而减小，大小与入射光波长为同一数量级或更小。由于隐失场的独特特性，使荧光激发的区域非常靠近分界面(约IOOnm)。这样不会激发距分界面更远区域的荧光，从而可实现背景噪声极小的荧光成像，使得生物荧光显微检测仪器100在轴向具有很高的分辨率。在该生物荧光显微检测仪器100中，通过照明针孔114及成像探测针孔153的联合使用，实现点对点的照明和点对点的成像。当不考虑噪声的情况下，光学上常用点扩散函数描述系统成像分辨率，对于激光扫描共焦系统来说，系统最終的点扩散函数由下式描述PSFtot (x, y, z) = PSFill (x, y, z) · PSFdet (x, y, z)
其中PSFill对应照明激光点在物方的点扩散函数，PSFdet对应成像探测光路的点扩散函数。由于照明针孔114的作用，入射激光光束通过各单元后在盖玻片200与待观察对象交界处形成一个很小的点状照明区域(照明方点扩散函数)，成像探测针孔153的使用对成像探測方点扩散函数进ー步整形，使得整个生物荧光显微检测仪器100的成像点扩散函数由照明方点扩散函数和探測方点扩散函数的乘积组成，由于乘积后的成像点扩散函数强度分布范围变窄，因而系统具有很高的横向分辨率。在该生物荧光显微检测仪器100中由于入射激光光束经显微成像単元140聚焦在区域面积约为艾利斑大小的点状区域内，即只有一个面积很小厚度很薄区域内的荧光物质能够被激发，而其它区域内的荧光物质不会被激发，即从源头上消除了杂散光的来源，因而系统具有很高的成像信噪比。当然本发明的生物荧光显微检测仪器还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。
权利要求
1.一种生物荧光显微检测仪器，其特征在于，包括激发光照明单元、激发光和荧光隔离单元、反射单元、显微成像单元、突光探测单元及控制单元； 所述激发光照明单元包括激光光源、第一扩束镜、第二扩束镜；所述第一扩束镜及第二扩束镜之间设有照明针孔，且所述照明针孔位于所述第一扩束镜的焦点处；所述激发光和荧光隔离单元包括激发光滤色片、二色镜、荧光滤色片；所述反射单元为平面反射镜；所述显微成像单元包括中继透镜、筒镜、环形光束整形组件、显微物镜，所述环形光束整形组件包括设于所述筒镜及显微物镜之间的环形滤光片，所述环形滤光片具有将激光截止的内环区域和透射激光的环带区域，该内环区域和环带区域均可透射荧光；所述内环区域的半径不小于刚好能发生全内反射时所述显微物镜入瞳位置的临界半径；所述荧光探测单元包括成像镜头、光电倍增管，该成像镜头与所述光电倍增管之间设有成像探测针孔，所述成像探测针孔位于所述成像镜头的焦点处；待观察对象与所述照明针孔和成像探测针孔处于共轭位置上；所述光电倍增管可探测荧光，并将所述荧光转换成电信号； 所述第一扩束镜、照明针孔、第二扩束镜、激发光滤色片、二色镜、反射单元、中继透镜、筒镜、环形滤光片及显微物镜依次沿始于所述激光光源的光轴线设置，且所述显微物镜、环形滤光片、筒镜、中继透镜、反射单元、二色镜、荧光滤色片、成像镜头、成像探测针孔及光电倍增管依次沿始于由待观察对象激发的荧光光轴线设置； 所述控制单元与所述光电倍增管电性连接，用于采集所述电信号并生成待观察物质中一个点图像。
2.根据权利要求I所述的生物荧光显微检测仪器，其特征在于，所述环带区域的宽度可调节。
3.根据权利要求I所述的生物荧光显微检测仪器，其特征在于，所述显微物镜为无穷远消像差型大数值孔径的浸油物镜。
4.根据权利要求I所述的生物荧光显微检测仪器，其特征在于，所述控制单元还与所述激光光源电性连接，用于控制激光的波长和功率。
全文摘要
本发明提供的生物荧光显微检测仪器包括激发光照明单元、激发光和荧光隔离单元、反射单元、显微成像单元、荧光探测单元及控制单元。激发光照明单元的第一扩束镜及第二扩束镜之间且位于第一扩束镜的焦点处设有照明针孔，荧光探测单元的成像镜头和光电倍增管之间且位于成像镜头的焦点处设有成像探测针孔，有效提高了该仪器的横向分辨率；同时，在显微成像单元的筒镜与显微物镜之间设置环形光束整形组件，提高了该生物荧光显微检测仪器在轴向的分辨率。
文档编号G01N21/64GK102818794SQ20121025574
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者张运海, 朱磊, 唐志豪, 肖昀, 王真, 陈瑞涛 申请人:苏州生物医学工程技术研究所