专利名称：用于检测CBFβ/MYH11融合基因相对表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时突光定量PCR技术,用于检测人类急性髓细胞性白血病(acute myelognous leukemia,AML)患者体内CBFP /MYHll融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提闻检测精度。
背景技术：
Acute myelocytic leukemia即急性髓细胞白血病,其病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月，目前还没有找到真正的致病因，一般认为遗传、辐射、化学物质(如苯)、药物及其他职业上的暴露(如浓烟、颜料、杀虫剂等)可能与AML的发生有关。临床上，根据血象、骨髓象、细胞化学染色、免疫学染色的检测结果将急性骨髓系白血病分为M(TM7，8种亚 型。M■是M4型白血病中的一种特殊类型。患者骨髓中粒系和单核系原始细胞同时恶性增生，嗜酸粒细胞占5% -30%。Inv(16) (pl3 ；q22)/t(16 ；16) (pl3 ；q22)为急性髓系白血病(AML)-M■的非随机染色体异常，是由16号染色体长臂上的CBFP基因与短臂上的平滑肌肌球蛋白重链基因(MYHll)产生融合所致，形成CBFP/MYHll和MYHl 1/CBFP两种融合基因。其中CBFP/MYHll融合基因易促使白血病发病。迄今已发现10种CBFP/MYHll融合基因转录本，最为常见的是A型，即CBFP 47Vmyh1921，占88%，其次为D型(CBFe 474/MYH12ci1)和E型(CBFP 474/ MYH994)，这两型检出率均为5%，其他类型均只有个案报道。与其他AML亚型相比，(AML)-M4ro患者多为中青年，常有外周血白细胞计数升高、器官肿大、对化疗药物有良好反应。大多数研究认为，有较好的预后，有inv(t6)者完全缓解率可达90% 100%，近50%能够获得5年无病生存(DFS)，但中枢神经系统复发较常见。CBF^/MYHlI的致白血病机制尚不清楚，在CBF@ /MYHll基因敲除小鼠中，CBF3 /MYHll显性负抑制CBF对其靶基因的转录调控活性。间接免疫荧光染色证实CBF ^ /MYHll基因表达产物CBF ^ /SMHHC与野生型CBF ^ 一样定位于胞浆，当CBF ^ SMHHC与AMLl共表达时，CBF P / SMHHC可将AMLl蛋白部分扣留于胞浆，CBF ^ /SMHHC融合蛋白的AMLl胞浆扣留是CBF ^ /SMHHC显性负抑制CBF对其靶基因的转录激活的主要机制。有研究发现，CBF ^/SMHHC与野生型CBFP相比，其与AMLl具有更高的亲和性，当二者共表达时大部分CBF ^ /SMHHC融合蛋白已从胞浆进入胞核，而CBF ^ /SMHHC、AML1与mSin3A可形成转录抑制复合物，因此，CBF 3 /SMHHC显性抑制CBF对其靶基因的转录激活的另一机制是通过CBF ^ /SMHHC与野生型CBFP竞争性结合AMLl，在胞核内与AMLl及一些转录抑制辅助因子(如mSin3A等)形成转录抑制复合物所致。目前临床上已经将CBFP/MYHll融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对CBFP /MYHll融合基因mRNA残留进行检测。RQ-PCR米用Taqman探针突光定量技术,综合生物学、酶学和突光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足CBFP /MYHll融合基因mRNA微量残留的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于CBFP /MYHll的基因检测。
发明内容
鉴于现有技术中检测CBFP /MYHll融合基因的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测CBFP/MYHll融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测CBFP /MYHll融合基因相对表达量的试剂盒。用于检测CBFP/MYHll融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、扩增目的基因用引物CBF 3 /MYH11-F、CBFP /MYH11-A-R、CBFP /MYH11-D-R、CBFP /MYH11-E-R，探针 CBF P /MYHll-Prob，扩增内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl_Probe ;其中，
CBF^ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAG
CBF^ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTC
CBF^ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACT
CBF^ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCC
CBF3 /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。所述阳性对照品为含有CBFP /MYHll基因的溶液；所述阴性对照品为无CBF3 /MYHll基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为T0Y0B0公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。THUNDERBIRD qPCR MIX为T0Y0B0公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。本发明的有益效果本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因CBFP /MYHll的定量标准曲线，检测受测者体内CBFP/MYHll的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的A A CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性髓细胞性白血病(acute myelognous leukemia, AML)患者体内CBF 0/MYHlI融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
图I :样品I检测结果示意图(CBF 3 /MYHll A型阳性)。图2 :样品2检测结果示意图(CBF P /MYHll A型阴性)。
图3 :样品3检测结果示意图(CBF P /MYHll D型阳性)。图4 :样品4检测结果示意图(CBF P /MYHll D型阴性)。图5 :样品5检测结果示意图(CBF P/MYHll E型阳性)。图6 :样品6检测结果示意图(CBF P /MYHll E型阴性)。
具体实施例方式实施例I
本发明的用于检测CBFP /MYHll融合基因相对表达量的试剂盒，包括
红细胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
无水乙醇；
检测体系 PCR 反应液ReverTra Ace qPCR RT Kit (T0Y0B0 公司);THNDERBIRD ProbeqPCR Mix (2X )、CBF3 /MYHll 上、下游引物各 0. 8uM、CBFP /MYHlI 探针 0. 4 uM ；abl 上、下游引物各0. 8uM、abl-probe (探针)0. 4uM ;其中
CBF^ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAG ；
CBF^ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTC ；
CBF^ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACT ；
CBF^ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCC ；
CBF3 /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRA ；abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
阳性对照品分别含CBFP /MYHl I基因组溶液；阴性对照品不含CBFP /MYHll基因组溶液。实施例2本发明试剂盒的使用方法
(I)抽提血液中的组织RNA:在洁净的I. 5ml的离心管中加入Iml红细胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室温静置IOmin ；5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞；再次加A 0. 5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入ImlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min ;加入0. 2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4°C离心lOmin，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混勻，室温静置IOmin ；14000rpm 4°C离心IOmin,弃上清,加入75%乙醇Iml,轻轻上下颠倒洗漆管壁；14000rpm 4°C离心5min,弃乙醇；室温干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为 cDNA。(3)试剂配置按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装X=23ul反应液X (8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳
性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA ;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。(5)检测检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500 (美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件95°C预变性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 个循环，突光信号于58°C 35 sec时米集。(6)结果判断将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。I)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准，Ct〈36，为阳性；35 ^ Ct ^ 38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct >38，为阴性。实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本。取送检的急性髓细胞性白血病(acute myelognous leukemia,AML)患者抗凝血标本共60例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表
权利要求
1.用于检测CBFi3/MYHll融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于 检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、扩增目的基因用引物CBF β /MYHl 1-F、CBFP /MYHl 1-A-R、CBFP /MYHl 1-D-R、CBFP /MYHl 1-E-R，探针 CBF β /MYHl I-Prob，扩增内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl-Probe ;其中，CBFβ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAGCBFβ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTCCBFβ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACTCBFβ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCCCBFβ /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRAabl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有CBFi3/MYHll基因的溶液；所述阴性对照品为无CBFi3 /MYHll基因的溶液。
全文摘要
本发明公开了用于检测CBFβ/MYH11融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、扩增目的基因用引物CBFβ/MYH11-F、CBFβ/MYH11-A-R、CBFβ/MYH11-D-R、CBFβ/MYH11-E-R，探针CBFβ/MYH11-Prob，扩增内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl-Probe。本发明试剂盒能够对人类急性髓细胞性白血病(acutemyelognousleukemia，AML)患者体内CBFβ/MYH11融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
文档编号G01N21/64GK102796818SQ20121025570
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者徐建成, 周晓犊, 王淑一 申请人:南昌艾迪康临床检验所有限公司