专利名称：检测纤维二糖酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测生物酶活性 的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖酶活性的方法。
背景技术：
纤维素酶是一种多组分的复合酶，它包括内切型葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4，也称Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3. 2. I. 91，也称C1、微晶纤维酶)和纤维二糖酶(EC3. 2. I. 21，也称葡萄糖苷酶)等三种主要组分。普遍认为在将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种是里氏木霉(Trichodermareesei)的优良突变株。在该菌种的纤维素酶制剂中，内切型及外切型_葡聚糖酶活力较高，但不足之处是纤维二糖酶产量很低。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的活力很低造成纤维二糖的累积，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。因此，采用纯化的纤维二糖酶、固定化酶技术等多种方法被广泛用于增强反应体系中纤维二糖酶的活力，而纤维二糖酶的活性成为衡量这些方法优越性的重要指标。目前，对于纤维二糖酶活性的测定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物，检测水解后产生的极微量的葡萄糖，反应易受干扰，且检测灵敏度不高；荧光法灵敏度高且快速，但是由于实验过程操作复杂，且重现性不好，现在应用不多；比色法是以对硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)为酶底物，检测底物水解后释放出来的对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的、危害环境的高毒性有机物。因此，研究一种灵敏度及精确度高且对环境无害的纤维二糖酶活性检测方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、灵敏、精确、且具有对环境无害、成本低廉的检测纤维二糖酶活性的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种检测纤维二糖酶活性的方法，其步骤包括将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20 I的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2 4体积的纳米金探针浓缩液(所述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液)，将检测温度控制在30°C 35°C，检测pH值控制在4. O 4. 5，待纳米金探针反应完全后(一般至少反应lOmin)，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶(定性检测)(例如，紫外可见分光光度计测定时，当620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值大于O. 2631时则可认为含有纤维二糖酶)；所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-I-醇。上述的检测方法中，所述纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，所述线性回归方程为A=O. 3642n+0. 6273，其中A优选为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值(A620/A520)，根据检测得到的吸光度比值A即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=L 5 X IOn即可定量测得待测溶液中的纤维二糖酶酶活C，C的量纲为U/mL(定量检测)。在定量检测中，所述纤维二糖酶酶活C的检测范围优选为 O. 15 U/mL 150 U/mL。上述的检测方法中，所述纳米金探针的粒径优选为30 nm 80 nm。上述的检测方法中，所述纳米金探针的Zeta电位优选为_30 mV -40 mV。上述本发明的纳米金探针主要是基于纳米金颗粒能够在不破坏生命物质结构和功能的前提下提供光电检测信号，纳米金颗粒的粒径大小以及颗粒间的相对距离会影响其 稳定性以及光学性质，从而提供可供检测的光学信号。本发明的纳米金探针表面修饰的纤 维二糖使纳米金颗粒之间增加了排斥力，从而使得纳米金颗粒之间的距离稳定而不聚集沉降，具有稳定剂的作用；而纳米金探针表面修饰的MCH则一端通过硫醇基与纳米金颗粒连接，另一端的羟基暴露在外。当本发明的纳米金探针未被用于检测纤维二糖酶时，其表面修饰的纤维二糖能保持体系的稳定，而当纳米金探针用于检测纤维二糖酶时，纤维二糖作为纤维二糖酶的底物被分解，这时MCH暴露在外的羟基之间的吸引力会促使纳米金颗粒之间距离变近、聚集沉降，从而使得纳米金探针提供相应的可供检测的光学信号。上述的检测方法中，优选的，所述纳米金探针主要由以下方法制备得到在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-I-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀(含少量水，即上述的纳米金探针浓缩液)重溶于超纯水中，得到含有可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。上述的检测方法中，所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比优选为I :(16. 3 18. 4) (I. 2 6)。更优选的，所述氯金酸与6-巯基己-I-醇的摩尔用量比为
I (O. 002 O. 004)。上述原料摩尔用量的确定是通过以下各组反复的优化实验进行确定的。I.纤维二糖用量的优化于20mL不同质量浓度的纤维二糖溶液中加入O. 2mL、质量浓度为1%的氯金酸溶液，振荡混匀后加向上述反应体系中加入O. 2mL、质量浓度为I. 5%的硼氢化钠溶液充分反应O. 5h ;低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同纤维二糖用量对所制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zata电位的影响，检测结果如下表I所示。表I :纤维二糖用量对纳米金-纤维二糖复合物的影响_
权利要求
1.一种检测纤维二糖酶活性的方法，该方法包括以下步骤将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20 I的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2 4体积的纳米金探针浓缩液，将检测温度控制在30°C 35°C，检测pH值控制在4. 0 4. 5,待纳米金探针反应完全后，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶；所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-I-醇。
2.根据权利要求I所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，所述线性回归方程为A=O. 3642n+0. 6273，其中A为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值，根据检测得到的吸光度比值A即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=L 5X IOn即可定量测得待测溶液中的纤维二糖酶酶活C，C的量纲为U/mL。
3.根据权利要求2所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述纤维二糖酶酶活C的检测范围为0. 15 U/mL 150 U/mL。
4.根据权利要求I 3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述纳米金探针的粒径为30 nm 80 nm。
5.根据权利要求I 3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述纳米金探针的Zeta电位为-30 mV -40 mV。
6.根据权利要求I 3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于，所述纳米金探针主要由以下方法制备得到在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-I-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀重溶于超纯水中，得到含有可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。
7.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比为I : (16. 3 18. 4) (I. 2 6)。
8.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述氯金酸与6-巯基己-I-醇的摩尔用量比为I : (0.002 0.004)。
9.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于所述低速离心时的转速为1200rpm 1500rpm,所述高速离心时的转速为12000rpm 15000rpm。
10.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法所述加入6-巯基己-I-醇进行培养时的温度控制在30°C 37°C，培养时间为2h 2. 5h。
全文摘要
本发明公开了一种检测纤维二糖酶活性的方法，其是将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20∶1的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液，将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶；纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。本发明的方法具有快速、灵敏、精确、且对环境无害、成本低廉等优点。
文档编号G01N21/55GK102798617SQ201210274918
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者曾光明, 赖萃, 黄丹莲, 赵美花, 张辰, 危臻, 黄超, 许飘, 李宁杰, 李芳玲 申请人:湖南大学