专利名称：一种检测半胱氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及巯基氨基酸的检测方法，具体属于一种在半水溶液中检测半胱氨酸的方法，该方法可以区分同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)。
背景技术：
巯基氨基酸包括同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)，是人体必需的生物小分子，在生理过程中扮演着重要的角色。血浆中Hcy浓度的升高会导致很多疾病，如心血管疾病，老年痴呆症和骨质疏松症等。如果Cys缺乏则会导致儿童的生长减缓，肝脏损伤，肌肉和脂肪损失，皮肤损伤以及体质虚弱等疾病。通常测试巯基的方法有电化学，紫外_可见吸收光谱，高效液相色谱(HPLC)，毛细管电泳以及酶联免疫等。
荧光技术由于具有仪器操作简单、灵敏度高等优点，在分析化学和生物医学领域得到了广泛的应用。是目前公认的一种非常有前景的高效、便捷的检测方法。光纤荧光传感技术是其中最有潜力的一种实用化技术。近年来，人们已经合成了多种化合物并用于巯基氨基酸的光学检测。然而，由于同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸在结构上非常相似(Hcy 在结构上仅比Cys多一个-CH2)，大多数化合物都不能将它们区分开。因此对于各自的检测存在相互干扰，所以设计一种能区分Hcy和Cys的荧光化学传感器有重要的意义。发明内容
本发明的目的在于提供一种检测半胱氨酸的方法，应用该方法可以快速地将半胱氨酸和同型半胱氨酸区分开。
本发明提供的一种检测半胱氨酸的方法，包括以下步骤
(I)用 DMF 配制 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液；
(2)用三蒸水配制ρΗ7· O的浓度为O. 2Μ的HEPES缓冲液；
(3)用微量进样器吸取适量上述Ir2(ppy)4Cl2溶液加到荧光皿中，然后加入10-40 倍的DMF，在荧光仪上检测，505nm有发射；
(4)将步骤(2)配制的HEPES缓冲液也加入到荧光皿中，使得荧光皿中的DMF与 HEPES的体积比为9:1 I: I ;
(5)取被测溶液，用微量进样器逐渐加入到上述荧光皿中，边加样边在荧光仪上检测，随着溶液的继续加入，体系的发射峰由505nm红移至570 576nm，说明溶液中含有半胱氨酸；或用365nm波长的紫外光照射上述荧光皿，体系的发射颜色由绿色变为橘黄色，也说明溶液中含有半胱氨酸。
所述的DMF可用DMSO代替。
本发明检测半胱氨酸的方法可以应用于临床、食品和环境中半胱氨酸是否存在的检测。
本发明的检测方法对半胱氨酸的选择性相对于其他氨基酸以及阴离子是专一的， 即其他氨基酸或阴离子的存在不干扰本方法对半胱氨酸的测定。
本发明作为选择性检测半胱氨酸的荧光探针有如下优点首先检测成本低；其次检测速度快，几分钟即可完成，实现实时检测；第二，选择性好，其他的氨基酸包括同型半胱氨酸也没有干扰。
图IA实施例I的荧光发射图
图IB实施例I的发射光的颜色变化图
图2实施例2的荧光发射图
图3实施例3的荧光发射图
图4(a)本发明检测方法对半胱氨酸选择性识别的荧光信号(与其他氨基酸比较)
图4(b)本发明检测方法对半胱氨酸选择性识别的荧光信号(与阴离子比较)
实施方式
实施例I :利用该方法区分半胱氨酸和同型半胱氨酸
用DMF 配制 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，并用三蒸水配制 pH 7. O 的 HEPES(0. 2M) 缓冲液；分别取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES缓冲液加到两个荧光池中，用微量进样器吸取上述的Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到荧光皿中在荧光仪上检测，505nm有发射；分别取 4X IO-3的半胱氨酸和同型半胱氨酸溶液100 μ 1，用微量进样器逐渐加入到上述两个荧光池中，室温放置20分钟后在荧光仪上检测，加入半胱氨酸的体系发射峰由505nm红移至 576nm(图1A)。用手提式紫外灯365nm紫外光照射，发射光的颜色由绿色变为橘黄色，而加入同型半胱氨酸体系的发射光颜色没有发生明显的变化(图1B)。
实施例2
用DMF 配制 2 X ICT3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，并用三蒸水配制 pH 7. O 的 HEPES(O. 2M) 缓冲液；取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES缓冲液加到荧光池中，用微量进样器吸取上述的 Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到荧光皿中在荧光仪上检测，505nm有发射；取半胱氨酸溶液，用微量进样器逐渐加入到上述荧光池中，边加样边在荧光仪上检测，随着半胱氨酸的逐渐加入体系的发射峰由505nm红移至576nm (图2)。
实施例3
用DMF 配制 2*1(Γ3Μ 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，并用三蒸水配制 pH 7. O 的 HEPES(0. 2M) 缓冲液；取900μ1 DMFjOOyl HEPES缓冲液加到荧光池中，用微量进样器吸取上述的 Ir2 (ppy)4Cl2溶液50 μ I加到荧光皿中在荧光仪上检测，505nm有发射；取半胱氨酸溶液，用微量进样器逐渐加入到上述荧光池中，边加样边在荧光仪上检测，随着半胱氨酸的逐渐加入体系的发射峰由505nm红移至570nm (图3)。
实施例4:本发明检测方法对半胱氨酸的选择性识别
用DMF 配制 2 X ICT3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液，并用三蒸水配制 pH 7. O 的 HEPES(O. 2M) 缓冲液；取1750 μ I DMF、200l·! I HEPES缓冲液加到荧光池中，用微量进样器吸取上述的 Ir2(ppy)4Cl2溶液50 μ I加到荧光皿中，然后加入摩尔数10倍于实施例2中半胱氨酸量的苯丙氨酸，在荧光光谱仪上检测，计算体系在576nm与511nm处的荧光强度比值(1576/1511 )。 按照同样方法，将苯丙氨酸分别用等量的丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、色氨酸、天门冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、羟脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸代替，结果表明加入半胱氨酸体系的比值是加入其他氨基酸体系的10倍，是加入还原型谷胱甘肽体系的5倍。说明本发明检测方法对半胱氨酸有较好的选择性(见图4 (a))。
按照同样方法，在上述比色皿中，将苯丙氨酸分别用常见阴离子如碳酸根、磷酸根、磷酸氢二根、磷酸二氢根、硫酸根、氯离子以及溴离子代替，在荧光光谱仪上检测，计算体系在576nm与511nm处的荧光强度比值(1576/1511 )。结果表明，加入半胱氨酸体系的荧光强度是加入其他阴离子体系的大约7倍，进一步说明本发明检测方法对半胱氨酸有较好的选择性(见图4 (b))。
权利要求
1.一种可以在半水溶液中检测半胱氨酸的方法。其特征在于，包括以下检测步骤(1)用DMF 配制 2*10_3M 的 Ir2 (ppy) 4C12 溶液； (2)用三蒸水配制ρΗ7·O的浓度为O. 2Μ的HEPES缓冲液； (3)用微量进样器吸取适量上述Ir2(PPy)4Cl2溶液加到荧光皿中，然后加入10-40倍的DMF ； (4)将步骤(2)配制的HEPES缓冲液也加入到荧光皿中，使得荧光皿中的DMF与HEPES的体积比为9:1 1:1 ; (5)取被测溶液，用微量进样器逐渐加入到上述荧光皿中，边加样边在荧光仪上检测，随着溶液的继续加入，体系的发射峰由505nm红移至570 576nm，说明溶液中含有半胱氨酸。
2.如权利要求I所述的一种可以在半水溶液中检测半胱氨酸的方法，其特征在于，步骤(5)取被测溶液，用微量进样器逐渐加入到上述荧光皿中，用365nm波长的紫外光照射上述荧光皿，体系的发射颜色由绿色变为橘黄色，说明溶液中含有半胱氨酸。
3.如权利要求I所述的一种可以在半水溶液中检测半胱氨酸的方法。其特征在于，所述的DMF用DMSO代替。
全文摘要
本发明提供了一种可以在半水溶液中检测半胱氨酸的方法。重要的是应用此方法可以将半胱氨酸与同型半胱氨酸区分开。该方法基于配合物二氯四[2-(2-吡啶基)苯基]二铱(III)[Ir2(ppy)4Cl2]，在DMF或DMSO的半水溶液中，利用荧光方法直接检测半胱氨酸。测定过程简单方便，不受溶液中其他氨基酸包括同型半胱氨酸以及阴离子的干扰，可以应用于半胱氨酸是否存在的检测。
文档编号G01N21/64GK102928392SQ201210420558
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者陈绘丽, 李晓凯 申请人:山西大学