专利名称：一种再改良Sihler's肌内神经染色的方法
技术领域：
本发明涉及医学解剖学领域，是一种更省时，更经济，神经染色效果更好的改良方法。
背景技术：
关于Sihler’s肌内神经染色法，Sihler’s肌内神经染色法是由Sihler’s在19世纪提出的(C Sihler Ober muskelspindeln und intramuskulare nervenendigungenbei schlangen und froschen[J ]Archiv fiir Mikroskopische Anatomie, 1895,46:709-723.) ο此后各国学者对此方法进行了多次改良，并且命名为Sihler’s染色技术以纪念发明者。Sihler s染色法能够在保持肌肉大体形态，在标本透明或者半透明状态下肉眼看到肌内神经的分支，神经主干及其分支被染成紫蓝色，X线阅片箱上可见，肌纤维和 结缔组织呈淡紫色。Sihler’ S肌内神经染色方法的具体步骤以Liu、Kumar等(Liu J,KumarVP,Shcn Y,etal. Modified Sihler’s technique for studying the distributionof intramuscular nerve branches in mammalian skeletal muscle[J]. AnatRec,1997,247(1) 137-144.)改良后的Sihler’ S肌内神经染色例介绍Sihler’ S染色的步骤:
(I)固定将新鲜标本立即以10%的甲醛固定，时间约4周，液体浑浊时更换液体。人体的大块肌肉固定时间相应延长至两个月。(2)浸软和除色素固定后组织流水冲洗24h，置于3%的氢氧化钾(每100毫升氢氧化钾加O. 2毫升3%的过氧化氢)除色素，液体变浑浊后予以更换(一般2 3天)，并随时通过X线阅片箱观察肌内神经，至肌肉发白半透明神经分支可见终止，此过程约需3 4周。(3)脱钙将肌肉流水冲洗半小时，浸入Sihler’ S1(由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)溶液中脱钙，每周换液I次，至肌肉透明，此过程约需4周。(4)染色脱钙后的肌肉流水冲洗30分钟后，浸入Sihler’ SII (由I份Ehrlich’ S苏木素液,2份甘油和12份I %的水合三氯乙醒配制而成)溶液中，每周换液I次，直到肌内神经，此过程约需21周。(5)脱色染色后，肌肉重入Sihler’S I溶液中，使肌纤维脱色，液体颜色发黄后予以更换，观察肌内神经与肌肉颜色的对比度，直到肌内神经显示紫黑色，肌肉呈淡蓝色为止。此过程约需20小时。(6)中和流水冲洗30min，入O. 05%碳酸锂溶液中浸泡f 2小时。(7)透明将肌肉的筋膜剔除，依次放入40%、60%、80%、100%梯度甘油中透明，每种浓度的甘油作用3天。此过程约需12d。最后标本避光保存于100%甘油中。虽然Sihler’s染色法可以整体观察肌内的神经分布，但是整个染色过程时间比较长，步骤多，每一步的终止都没有固定的时间要凭借经验，都需要有丰富的经验才能达到预期的实验结果。肌内神经细小分支以及分支间的联系不能清晰观察到，神经纤维髓鞘在末端越来越少(Stevens , A. ; Lowe, J. Human Histology. 2nd.C V Mosby; London: 1997. p. 1-408)，吸收的苏木素染料也越少，尤其脱色部分更需要紧密的观察，容易褪色过度，观察不到。中和的过程不好把握，中和时间长会导致肌肉淡蓝色过深，造成肌肉和神经细小分支的色差不明显影响观察。透明时间长，整个染色过程时间长且是水化的过程标本形态有些变形，实验药品试剂消耗量大。
发明内容
本发明提供一种再改良Sihler’s肌内神经染色的方法。本发明具体方法如下
按Sihler’s肌内神经染色法，肌肉标本经固定，浸软和除色素，脱钙，染色，脱色步骤不采用传统的Sihler’S I液(由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)溶液脱色，而采用酸性分化液(由I份盐酸，100份70%酒精溶液配制而成)进行脱色，液体变红更换液体。采用此分化液脱色速度快，传统方法约需20小时，改良后约2 4小时即可，节约且在脱色的过程中有透明的效果，在脱色过程中细小神经分以及分之间的联系可以清晰看到。使用再改良的脱色方法可以节约脱色时间和透明时间。标本脱色后且不需要用O. 05%碳酸锂浸泡中和，流水冲洗15分钟后，置于40%的甘油透明剂中，在40%的甘油透明剂中，标本会缓慢继续退去多余的颜色，便于控制脱色时间。再依次放入60%、80%、100%甘油各一天，以此方法脱色后可缩短透明时间，透明效果好，神经纤维呈现紫蓝色，肌肉透明略呈棕色，肌肉和神经纤维色差明显更易观察，肌肉标本不呈流动的胶冻状，支撑度 好更接近真实；
最后标本用100%甘油玻璃标本瓶密封避光保存；
本发明方法制作的肌内神经标本形态完整，结构清晰，神经细小分支清晰以及分之间的联系清晰可见，标本的支撑度好，标本形态颜色更接近真实。整个实验过程缩短，更省时，更经济，效果更好。
权利要求
1.一种再改良Sihler’s肌内神经染色的方法，步骤如下 1)在新鲜尸体上，按照常规解剖暴露相关组织，观察该组织血管神经来源，将该组织分离，注意保留完整的血管神经蒂； 2)按Sihler’s肌内神经染色法对所取肌肉组织进行固定、浸软和除色素、脱钙、染色，脱色步骤不采用传统的Sihler’ s I (由I份冰醋酸、2份甘油和12份I %的水合三氯乙醛配制而成)采用酸性分化液进行脱色，不需中和用O. 05%d的碳酸锂浸泡中和，直接进行各级梯度甘油透明，肌肉呈透明状，呈浅棕色，肌内神经被染成紫蓝色； 3)上述肌肉标本浸入100%甘油用玻璃标本瓶避光封存。
2.按权利要求I所述的肌内神经方法的改良，其特征在于所说的酸性分化液是按I份盐酸，100份70%酒精溶液配制而成。
3.按权利要求I所述的肌内神经方法的改良，其特征在于所说的各级梯度甘油浓度分别为 40%、60%、80%、100% ο
全文摘要
本发明涉及医学解剖学技术领域，是一种更省时，更经济，神经染色效果更好的改良方法。取新鲜肌标本，10%甲醛固定﹑浸软和除色素﹑脱钙﹑染色，采用酸性分化液(由1份盐酸，100份70%酒精溶液配制)进行脱色。脱色快，脱色的过程中有透明效果，神经纤维﹑细小神经分支以及分支之间的联系均可清晰看到。不需用0.05%的碳酸锂溶液浸泡中和，直接各级梯度甘油中透明，透明时间缩短。本发明方法制作的肌肉标本形态完整，支撑度好，结构清晰，神经被染成紫蓝色，细小神经分支以及分支间联系均清晰可见。标本形态，颜色更接近真实。整个实验过程缩短，更省时，更经济，效果更好，更适用于解剖学和外科整形学对肌内神经分布的研究。
文档编号G01N1/30GK102944459SQ201210443768
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者李艳, 陈道邦, 董立华 申请人:四川大学