专利名称：一种电致化学发光细菌传感方法及多功能探针的制作方法
技术领域：
本发明属于电致化学发光技术领域，特别涉及一种电致化学发光细菌传感方法及多功能探针。
背景技术：
细菌在自然界中分布极为广泛，是地球物质循环的重要参与者，与人类的生活息息相关。然而一些致病菌的存在严重影响着食品安全、水安全，使人类产生各种疾病，危害人类的健康。比如2011年在欧洲爆发的食物中毒疫情就是由肠致病性大肠杆菌引起的，它能够使人产生严重腹泻和败血症，甚至死亡。此外，广泛存在的铜绿假单胞菌能够使得医院中的许多病人伤口感染，造成脓肿、肺部感染、菌血症和败血症，危害极大。因此，细菌的检测、鉴别和定量对于疾病的预防与诊断具有非常重要的意义。随着科技的进步，各种各样的新技术被用于细菌的检测，从早期的显微镜观察与计数、酶联免疫法，到现在的差分脉冲伏安法、质谱、聚合酶链反应、表面增强拉曼散射、阻抗、石英晶体微天平、表面等离子体共振等，每种方法都展现出了独特优势，不过依然存在缺点，比如多数技术操作过程繁琐、复杂，使用的仪器、药品较为昂贵，测过程耗时较长等。因此，急需发展快速、简便、可靠、廉价、灵敏度高的方法用于细菌的检测。电致化学发光，简称ECL，是一种可靠灵敏的检测方法，在分析化学中得到越来越多的关注。它是将电化学技术与化学发光检测相结合，具有灵敏度好、仪器简单、反应可控性好、检测限低、发光物质可循环再生等特点，是较好的细菌检测技术。如果将具有识别与催化功能的糖蛋白酶与具有催化和富集作用的纳米粒子相结合，构建多功能探针，将使该检测方法更加简便、廉价，灵敏度更高。糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子，在生物体中广泛存在，许多酶、激素、凝集素、抗体等都是糖蛋白，这些糖蛋白在生物体内发挥着重要的作用，参与免疫、物质转运、分泌、凝血、细胞迁移、细胞归巢等过程。在糖蛋白中，寡糖链由唾液酸、甘露糖、葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、半乳糖胺等组成，以氧-糖苷键或氮-糖苷键的方式与氨基酸相连。这些寡糖链携带着蛋白质的代谢去向信息，能够作为识别单元，使糖蛋白与一些其他蛋白相互作用，发挥其生理功能。比如细胞表面唾液酸能够帮助淋巴细胞正常地归巢到脾脏，而切除了唾液酸之后，其则归巢到肝脏。此外，糖蛋白上的寡糖链还能起到提高蛋白稳定性，保持蛋白生物活性，并赋予蛋白质特定性质，如抗蛋白酶水解、抗热失活、抗冻性、润滑性等。葡萄糖氧化酶是一种糖蛋白，表面含有丰富的糖基，可以与一些凝集素产生特异性结合，同时葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，而过氧化氢可以催化一些化学发光物质的发光，如鲁米诺，因此，可以利用葡萄糖氧化酶的识别与催化功能构建生物传感器。另外，这几年来，金纳米粒子在生物传感领域得到广泛的应用。一方面，纳米金具有催化活性，能够促进一些反应的发生；另一方面，其具有较大的比表面积和非常好的生物相容性，可以大大提升酶的负载量且不影响酶的活性。同时，金纳米粒子具有优良的电子传递性能，能促进体系中酶活性中心与电极表面间的电子传递。因此，将具有识别与催化功能的糖蛋白酶与纳米金进行结合，对于构建简便、可靠、廉价、灵敏度高的传感器具有重要的意义
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种电致化学发光细菌传感方法及多功能探针。本发明构建了一种葡萄糖氧化酶与纳米金结合的多功能探针。在金电极表面修饰了能与细菌表面和葡糖糖氧化酶等糖蛋白酶中广泛存在的甘露糖或葡萄糖进行特异性结合的凝集素——伴刀豆蛋白A凝集素，细菌和探针能够竞争性地与金电极上的伴刀豆蛋白A凝集素进行结合，最后通过高灵敏的电致化学发光方法进行检测。—种电致化学发光细菌传感方法，其具体步骤如下a.探针的制备取3毫升纳米金溶液，浓度为I. 87 X 10_9摩尔每升，然后加入O. 05飞毫克葡萄糖氧化酶，室温下搅拌24小时；然后在10000转每分钟的转速下离心1(Γ20分钟并用去离子水洗涤，最后用O. Γ6毫升，pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散，即可得表面修饰葡萄糖氧化酶的金纳米粒子探针溶液；b.金电极的处理与组装金电极用O. 3微米的氧化铝抛光打磨，并分别在乙醇和水中超声洗涤；然后在浓度为O. 5摩尔每升的硫酸溶液中,用循环伏安法在-O. 2 I. 65伏电位、O. I伏每秒的扫描速度下扫40圈以活化金电极；然后去离子水洗净后用氮气吹干；用pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液将伴刀豆蛋白A凝集素配制成浓度为O. 5 2毫克每毫升的溶液；取50 100微升配制好的伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分别加入各5微升浓度为1(Γ20毫摩尔每升的氯化钙和氯化锰溶液，二者的物质的量比为1:1，将活化处理好后的金电极表面浸泡在伴刀豆蛋白凝集素溶液中，静置修饰14小时；然后将金电极取出，用PH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后再放入5(Γ100微升浓度为O. 5^2毫克每毫升的牛血清蛋白组分五溶液中封闭，静置I小时；接着将金电极取出，用PH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的磷酸盐缓冲液洗涤；取5 10微升的细菌分散液滴加在金电极表面，室温下浸泡广2小时；用pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，再将金电极浸泡在5(Γ100微升配制好的金纳米粒子探针溶液中，在室温下反应O. 5 2小时；c.电致化学发光检测用pH为6. (Til. 0，浓度为O. I摩尔每升的磷酸盐缓冲液缓冲溶液配制含10(Γ500微摩尔每升的鲁米诺和O. 05^1摩尔每升的葡萄糖的电解质溶液；往小烧杯中加入2毫升所配置电解质溶液，将组装好的金电极与钼对电极和银-氯化银参比电极构建成三电极体系，然后用电致化学发光的方法进行检测；扫描电压范围为(Γ0. 6伏，扫速为100毫伏每秒，光电倍增管电压为600伏；或按照上述用料比例、步骤的制备及检测方法。所述纳米金溶液中纳米金粒子的平均粒径为1(Γ50纳米。所述细菌分散液为用pH为7. 2 7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散而成的浓度为4. 17 X IO4 ^4. 17 X IO8个菌落每毫升的大肠杆菌或铜绿假单胞菌溶液。一种多功能探针，其在纳米金粒子表面固定多个葡萄糖氧化酶，能够放大检测信号。所述纳米金粒子的平均粒径为1(Γ50纳米，并具有催化鲁米诺发光的能力。所述葡萄糖氧化酶具有识别与催化双重功能，葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖氧化产生过氧化氢，其表面的糖链能够与伴刀豆蛋白A凝集素特异性识别结合。本发明的有益效果为结果表明，基于伴刀豆蛋白A凝集素的电化学传感器对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的定量测定线性范围为4. 17 X IO2 4. 17 X IO6个菌落，检出限为263个菌落。操作过程简便，灵敏度较好。本发明采用表面修饰有葡萄糖氧化酶的金纳米子探针进行检测，该探针具有多重功能。整个组装过程简便，对鲁米诺发光的催化作用大，使得检测的灵敏度较好。
图I为不同含量的铜绿假单胞菌的电致化学发光信号图，其中a、b、c、d、e和f曲线分别表示菌落数为0、417、4. 17Χ103、4· 17Χ104、4· 17Χ105和4. 17X IO6时铜绿假单胞菌的电致化学发光信号图；图2为图I所示不同含量的铜绿假单胞菌的电致化学发光响应线性图；图3为一种由本发明所制备的多功能探针在电致化学发光传感器中的应用示意图。
具体实施例方式本发明提供了一种电致化学发光细菌传感方法及多功能探针，下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明。实施例I构建基于多功能探针的用于检测大肠杆菌ATCC11775的电致化学发光方法a.探针的制备所有用于制备金纳米粒子的玻璃仪器先用王水浸泡24小时，然后用去离子水洗净。往250晕升三口烧瓶中加入92. 5晕升去尚子水和2. 5晕升浓度为4克每晕升的氯金酸，搅拌加热至冷凝管有液滴均匀地回流至烧瓶。加入5毫升浓度为10毫克每毫升的二水合柠檬酸三钠，加热15分钟后停止，然后搅拌冷却至室温，于4摄氏度温度下保存。每次实验前取3毫升浓度为I. 87X 10_9摩尔每升的纳米金溶液，加入3毫克葡萄糖氧化酶，室温下搅拌24小时。在10000转每分钟的转速下离心10分钟，并用去离子水洗涤，再用I. 5毫升的pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散，即可得表面修饰了葡萄糖氧化酶的金纳米粒子探针溶液。b.细菌的培养与处理本实验所采用的大肠杆菌ATCCl 1775由中国国家纳米中心提供。细菌接种在装有肉汤培养液的玻璃试管中，于37摄氏度的摇床中振荡培养24小时。然后在8000转每分钟的转速下离心3分钟分离细菌，用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心洗涤三次后用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散。通过测细菌分散液的紫外可见吸光度值确定细菌溶度，再用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液稀释至所需的各个浓度的细菌分散液。c.金电极的处理与组装金电极用粒径为O. 3微米的氧化铝抛光打磨，分别在乙醇和水中超声洗涤；然后在浓度为O. 5摩尔每升的硫酸溶液中，用循环伏安法在-O. 2^1. 65伏的电位、O. I伏每秒的扫描速度下扫40圈以活化金电极；然后去离子水洗净后用氮气吹干。用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液将2毫克伴刀豆蛋白A凝集素配制成浓度为2毫克每毫升的溶液。取100微升伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分别加入各5微升浓度为1(Γ20毫摩尔每升的氯化钙和氯化锰溶液，二者的物质的量比为1:1，将活化后的金电极表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，静置反应14小时。然后将金电极取出，用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后放入100微升2毫克每毫升的牛血清蛋白组分五溶液中封闭，静置I小时。接着将金电极取出，用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤。取10微升所需浓度的待测大肠杆菌分散液滴加在金电极表面，室温下浸泡2小时。用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，再将金电极浸泡在100微升的所配制的金纳米粒子探针溶液中于室温下反应I小时。最后用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤，以便用于电化学检测分析。d.电致化学发光检测用pH为7. 86，浓度为O. I摩尔每毫升的磷酸盐缓冲液配制含100微摩尔每升的鲁米诺和O. I摩尔每升的葡萄糖的电解质溶液。往小烧杯中加入2毫升电解质溶液，将组装好的金电极与钼对电极和银-氯化银参比电极构建成三电极体系，然后用电致化学发光的方法进行检测。扫描电压范围为(Γ0. 6伏，扫描速度为100毫伏每秒，光电倍增管电压为600伏。结果表明，基于伴刀豆蛋白A凝集素的电化学传感器对大肠杆菌ATCC11775的响应线性范围为4. 17 X IO2 4. 17 X IO6个菌落。实施例2构建基于多功能探针的用于检测铜绿假单胞菌ATCC27853的电致化学发光方法a.探针的制备所有用于制备金纳米粒子的玻璃仪器先用王水浸泡24小时，然后用去离子水洗净。往250晕升三口烧瓶中加入92. 5晕升去尚子水和2. 5晕升浓度为4克每晕升的氯金酸，搅拌加热至冷凝管有液滴均匀地回流至烧瓶。加入5毫升浓度为10毫克每毫升的二水合柠檬酸三钠，加热15分钟后停止，然后搅拌冷却至室温，于4摄氏度温度下保存。每次实验前取3毫升浓度为I. 87X 10_9摩尔每升的纳米金溶液，加入3毫克葡萄糖氧化酶，室温下搅拌24小时。在10000转每分钟的转速下离心10分钟，并用去离子水洗涤，再用I. 5毫升的pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散，即可得表面修饰了葡萄糖氧化酶的金纳米粒子探针溶液。b.细菌的培养与处理本实验所采用的铜绿假单胞菌ATCC27853由中国国家纳米中心提供。细菌接种在装有肉汤培养液的玻璃试管中，于37摄氏度的摇床中振荡培养24小时。然后在8000转每分钟的转速下离心3分钟分离细菌，用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心洗涤三次后用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散。通过测细菌分散液的紫外可见吸光度值确定细菌溶度，再用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液稀释至所需的各个浓度的细菌分散液。
c.金电极的处理与组装金电极用粒径为O. 3微米的氧化铝抛光打磨，分别在乙醇和水中超声洗涤；然后在浓度为O. 5摩尔每升的硫酸溶液中，用循环伏安法在-O. 2^1. 65伏的电位、O. I伏每秒的扫描速度下扫40圈以活化金电极；然后去离子水洗净后用氮气吹干。用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液将2毫克伴刀豆蛋白A凝集素配制成浓度为2毫克每毫升的溶液。取100微升伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分别加入各5微升浓度为1(Γ20毫摩尔每升的氯化钙和氯化锰溶液，二者的物质的量比为1:1，将活化后的金电极表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，静置反应14小时。然后将金电极取出，用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后放入100微升2毫克每毫升的牛血清蛋白组分五溶液中封闭，静置I小时。接着将金电极取出，用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤。取10微升所需浓度的待测铜绿假单胞菌分散液滴加在金电极表面，室温下浸泡2小时。用pH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，再将金电极浸泡在100微升的所配制的金纳米粒子探针溶液中于室温下反应I小时。最后用PH为7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤，以便用于电化学检测分析。d.电致化学发光检测用pH为7. 86，浓度为O. I摩尔每毫升的磷酸盐缓冲液配制含100微摩尔每升的鲁米诺和O. I摩尔每升的葡萄糖的电解质溶液。往小烧杯中加入2毫升电解质溶液，将组装好的金电极与钼对电极和银-氯化银参比电极构建成三电极体系，然后用电致化学发光的方法进行检测。扫描电压范围为(Γ0. 6伏，扫描速度为100毫伏每秒，光电倍增管电压为600伏。结果表明，基于伴刀豆蛋白A凝集素的电化学传感器对铜绿假单胞菌ATCC27853的响应线性范围为4. 17 XlO2I. 17 X IO6个菌落。
权利要求
1.一种电致化学发光细菌传感方法，其特征在于，具体步骤如下a.探针的制备取3毫升浓度为I. 87 X 10_9摩尔每升的纳米金溶液，然后加入O. 05^5毫克葡萄糖氧化酶，室温下搅拌24小时；然后在10000转每分钟的转速下离心1(Γ20分钟并用去离子水洗涤，最后用O. Γ6毫升，pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散，即可得表面修饰葡萄糖氧化酶的金纳米粒子探针溶液；b.金电极的处理与组装用pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液将伴刀豆蛋白A凝集素配制成浓度为O. 5^2毫克每毫升的溶液；取5(Γ100微升配制好的伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分别加入各5微升浓度为1(Γ20毫摩尔每升的氯化钙和氯化锰溶液，二者的物质的量比为1:1，将活化处理好后的金电极表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，静置修饰14小时；然后将金电极取出，用PH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后再放入5(Γ100微升浓度为O. 5^2毫克每毫升的牛血清蛋白组分五溶液中封闭，静置I小时；接着将金电极取出，用PH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的磷酸盐缓冲液洗涤；取5 10微升的细菌分散液滴加在金电极表面，室温下浸泡广2小时；用pH为7. 2 . 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，再将金电极浸泡在5(Γ100微升配制好的金纳米粒子探针溶液中，在室温下反应O. 5 2小时；c.电致化学发光检测用pH为6. (Til. 0，浓度为O. I摩尔每升的磷酸盐缓冲液缓冲溶液配制含10(Γ500微摩尔每升的鲁米诺和O. 05 1摩尔每升的葡萄糖的电解质溶液；往小烧杯中加入2毫升所配置电解质溶液，将组装好的金电极与钼对电极和银-氯化银参比电极构建成三电极体系，然后用电致化学发光的方法进行检测；扫描电压范围为(Γ0. 6伏，扫速为100毫伏每秒，光电倍增管电压为600伏；或按照上述用料比例、步骤的制备及检测方法。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述纳米金溶液中纳米金粒子的平均粒径为10 50纳米。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述细菌分散液为用PH为7.2^7. 4，浓度为O. 01摩尔每升的无菌磷酸盐缓冲液分散而成的浓度为4. 17X IO4 4. 17X IO8个菌落每毫升的大肠杆菌或铜绿假单胞菌溶液。
4.一种多功能探针,其特征在于在纳米金粒子表面固定多个葡萄糖氧化酶，能够放大检测信号。
5.根据权利要求4所述的一种多功能探针，其特征在于所述纳米金粒子的平均粒径为1(Γ50纳米，并具有催化鲁米诺发光的能力。
6.根据权利要求4所述的一种多功能探针，其特征在于所述葡萄糖氧化酶具有识别与催化双重功能，葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖氧化产生过氧化氢，其表面的糖链能够与伴刀豆蛋白A凝集素特异性识别结合。
全文摘要
本发明属于电致化学发光技术领域，特别涉及一种电致化学发光细菌传感方法及多功能探针。本发明在纳米金粒子上富集修饰葡萄糖氧化酶，构建一种多功能探针，利用电致化学发光的方法检测细菌。该探针上的葡萄糖氧化酶具有识别与催化双重功能，首先，葡萄糖氧化酶是一种糖蛋白，其携带的寡糖链可以与凝集素特异性识别结合，而且葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖氧化产生过氧化氢，过氧化氢能够促进鲁米诺的电致化学发光；另外，比表面积较大的金纳米粒子一方面起到了富集酶的作用，另一方面其自身也能催化鲁米诺发光。因此，利用本发明可以构建一种快速、简便、可靠、廉价且灵敏度高的方法用于细菌的检测。
文档编号G01N21/76GK102944549SQ20121048471
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者汪阳忠, 刘洋, 李景虹 申请人:清华大学