专利名称：一种用于过敏原检测的l半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于电化学L半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用，本发明属于C48/80等具有致敏性质的致敏原检测技术领域。
背景技术：
近年来，伴随人们饮食面的快速拓宽，食物过敏的发病率和流行情况日益增加，特 别是随着转基因食品的出现，食物过敏将更趋于多样化、复杂化和严重化。因此，对食品过敏原的安全性评价已经成为食品安全研究领域中一个重要的课题。目前，已确定的过敏性食物多达180种以上，联合国粮农组织报告了 90%以上食物过敏原存在于牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类水产品、花生、大豆、坚果类及小麦8大类食物中。食品的过敏原是国内外检测、监控的一个重点、难点。根据检测目标物的不同，食物过敏原(Food allergen)检测技术主要有以下几种分析全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的质谱技术、检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)技术、分析过敏原性的免疫学检测技术。实验动物作为食物过敏原的体外评价模型已见报道，但是目前国际上尚未建立起利用肥大细胞作为体外评价模型的方法。肥大细胞是诱发食物过敏的中心枢纽，它在受抗原刺激后脱颗粒直接导致一系列过敏症状的产生，如能建立起肥大细胞体外评价模型并构建传感器，将会比研究动物模型和常规检测手段更直接、更快捷。检测肥大细胞在体外的脱颗粒时，常用的检测成分是组胺、β -己糖胺酶、类胰蛋白酶，但这三者检测手段落后、没有统一的实验方法、所用指标各异，再加上操作繁琐，检测灵敏度低下，容易造成很大的测量误差，限制了这些方法在分析致敏原的普及型。为了克服传统检测方法的弊端以及对致敏原检测模型构建的抽象简化，采用致敏原标准物C48/80作为检测对象。C48/80是N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物，具有促进组胺释放的作用。在生化研究中常被作为致敏原的标准物用于促肥大细胞脱颗粒。利用C4/80的致敏性这一特征，以Ρ815肥大细胞细胞为检测介质，通过电化学信号检测C48/80为代表的致敏原对细胞生长状况的影响，并进行定量分析，从而达到快速检测过敏原的目的。此外为了保持细胞在检测过程中的活性以及克服传统方法的弊端，采用鼠尾I型胶原包裹细胞形成3D培养机构，模拟细胞生存环境，提高了细胞粘附力和生命力，为延长传感器的使用寿命打下了坚实基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于电化学L-半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
通过电沉积和自组装方法将纳米金和L-半胱氨酸材料修饰到金电极上；采用P815肥大细胞作为传感介质，利用鼠尾I型胶原包裹细胞形成胶原/细胞3D培养，并将细胞胶原复合物接种到L-半胱氨酸/纳米金修饰电极完成细胞传感器的构建，最后将制备的传感器应用于致敏原标准物C48/80的检测.具体步骤为(I)金电极上纳米金的电沉积和L-半胱氨酸的自组装修饰；(2)肥大细胞的培养和鼠尾I型胶原的制备；(3)胶原/细胞3D复合物的制备以及在电极上孵育；(4)过敏原标准物C48/80的检测。 本发明制备的肥大细胞细胞电化学传感器检测致敏原相比传统方法具有如下优势作为传感介质的肥大细胞本身就属于免疫系统，当细胞接触志敏物质时会发生强烈的免疫反应，表现为形态上发生脱颗粒现象，细胞释放其内容物如组胺、β -己糖胺酶、类胰蛋白酶等，因此将肥大细胞作为检测过敏原的介质来构建传感器将会大大提高检测的灵敏度和反应速度；其次通过将细胞和胶原混合形成3D结构固定在电极上，胶原不仅提高了细胞在电极上的粘附力而且可以形成网孔结构将细胞保护在其中，使细胞在后续的测试中既能保持活性又防止脱落；最后采用电化学测定阻抗来作为检测的信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，克服了传统方法的弊端，真真正正实现了对过敏原的快速检测。
图1 :电化学细胞传感器构建的流程2 :金电极表面修饰表征循环伏安图(A)和交流阻抗图(B)a裸电极；b纳米金修饰后金电极；c L-半胱氨酸/纳米金修饰后金电极；d细胞胶原复合物/L-半胱氨酸/纳米金修饰后金电极图3 :修饰电极表面细胞SEM扫描电镜4 C48/80标准物的检测交流阻抗图
具体实施例方式实施例1电化学细胞传感器的制备1、纳米金、L-半胱氨酸修饰金电极将金电极(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15min后，分别用O. 3 μ m, O. 05 μ m的Al2O3抛光粉末，将电极表面打磨抛成镜面，再用1:1(V:V)的硝酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4°C备用。将ImM HAuCl4溶解于O. 5M H2SO4中，配置O. 05mM的HAuCl4溶液，将氮气吹干后金电极置于该HAuCl4溶液，电解电位为-O. 5，电解时间为100s，氮气吹干，4°C备用。再将O. 121g的L-半胱氨酸，用醋酸PB缓冲液配置成O. 5mg mL—1的L-半胱氨酸溶液清洗。37°C下将纳米金修饰的金电极浸泡其中5h，用超纯水反复清洗，吹干。2、细胞的培养与固定肥大细胞按IO6Hir1接种于六孔板中，每孔3ml培养基，置于37°C 5% CO2的培养箱中培养，每七天将悬浮细胞按照IO6Hir1转移到新的培养板中继续培养，细胞分化成熟后，收集细胞进行鉴定，密度控制在IO7Hir1左右，采用鼠尾I型胶原(浓度为1.5M)与获得的肥大细胞(密度1. 5 X IO7Hir1)进行混合，调整pH至中性，室温下静止20min形成凝胶，取10 μ I滴加电极，37 °C下孵育30min。3、细胞传感器电化学鉴定对制备好的细胞电化学传感器进行循环伏安和交流阻抗测试，SEM扫描电镜进行表征。微分脉冲伏安法条件为扫描范围-0. 2 O. 6V，振幅0. 05V ;交流阻抗法条件为初始电位0. 2V，振幅0. 05V，频率范围1-1OOkHz。实施例2电化学细胞传感器的应用1、标准物的检测 称取不同质量的C48/80标准品，用RPMI1640培养液配制获得终浓度分别为O. 5、1.O、1. 5,2. 0,2. 5、3 μ g mL—1的C48/80溶液。将胶原-细胞混合液以每孔100 μ L量接种到96孔板中，每孔依次添加50 μ L不同浓度C48/80溶液，2孔一个平行，37°C孵育过夜。取出已修饰完成的细胞传感电极，依次滴加 ο μ L不同浓度的C48/80标准品刺激后的细胞-胶原培养液，37°C孵育30min后，超纯水冲洗后将电极插电解池中进行测量。2、分析条件与方法分析方法如下电化学工作站ATUO LAB在初幅O. 05V,频率为I IOOkHz的条件下，在反应介质液为2. 5mmol Fe (CN)63_/4_溶液中进行测量，采用EIS法，并通过最佳等效电路计算，以工作电极经修饰后滴加了 0μ g ^^48/80的细胞悬液的阻抗值作为空白交流阻抗值Ret(Ab)，以此电极与含有不同浓度C48/80标准品刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为Ret(Ab-Ag)，求出在不同C48/80标准品浓度中Ret的变化值ARet Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)Ret (Ab)空白交流阻抗值；Ret (Ab-Ag) 与C48/80刺激后的细胞的电极电子传递电阻值；ARet :反应前后极电子传递电阻的变化值；以电子传递电阻的变化值和C48/80标准溶液浓度的关系作图，即得C48/80细胞传感器的检测标准曲线。3、结果判断通过配制一系列的C48/80标准溶液，测量用以得到不同浓度C48/80溶液的阻抗值，做标准曲线。其测定阻抗值与C48/80浓度在O. 5 3 μ g/mL范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为y = 4. 046x-0. 368 (R2 = O. 9962)，检出限为 O. 13μ g/mL(S/N = 3)。所示将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到C48/80的检测结果，可以通过检测数据结果和比较C48/80的含量来确定致敏程度的多少。使用本方法可以在10分钟内快速测定微量级别的C48/80，灵敏度高、准确性好，因此可以为快速定量检测与鉴定食品中存在的过敏原进行提供技术支持。
权利要求
1.一种基于电化学L-半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法，其特征在于，将电极置于氯金酸溶液中电镀沉积，L-半胱氨酸经自组装富集在已修饰有纳米金颗粒的电极表面，清洗氮气吹干后，获得电化学L-半光氨酸/金纳米粒子修饰的金电极。在修饰好的电极表面上滴加细胞-胶原混合悬浮液，培养孵育，以达到细胞固定的目的，制得基于L-半胱氨酸金/纳米粒子修饰的自组装电化学细胞传感器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电化学L-半光氨酸金纳米粒子修饰的金电极制备方法如下将ImM HAuCl4溶解于O. 5M H2SO4中，配置O. 05mM的HAuCl4溶液， 将O. 121g的L-半胱氨酸，用醋酸PB缓冲液配置成O. 5mg mL—1的L-半胱氨酸溶液。通过电沉积和自组装将L-半胱氨酸和纳米金沉积到金电极表面。在修饰好的金电极表面，滴加细胞-胶原混合悬浊液，在CO2细胞培养箱中，37°C孵育，制备得到自组装电化学细胞传感器。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，控制电位电解库伦法进行电镀沉积具体条件如下将彻底清洁的金电极氮气吹干后，置于O. 5mM的HAuCl4溶液，电解电位为-O. 5，电解时间为100s。清洗，氮气吹干，4°C备用。再置于O. 5%的L-半胱氨酸醋酸溶液中，37°C下浸泡5h，用超纯水反复清洗，吹干。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，金电极清洁方法如下将金电极(Φ= 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15min后，分别用O. 3 μ m, O. 05 μ m的Al2O3抛光粉末,将电极表面打磨抛成镜面，再用1:1(V V)的硝酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4°C备用。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，购买的肥大细胞按照IO6Hir1接种于六孔板中，每孔3ml培养基，置于37°C 5% CO2的培养箱中培养，每七天将悬浮细胞按照IO6Hir1 转移到新的培养板中继续培养，细胞分化成熟后，收集细胞进行鉴定，密度控制在IO7— ΚΑιΓ1，采用鼠尾I型胶原(浓度为1. 5Μ)与获得的肥大细胞(密度1. 5 X IO7Hir1)进行混合，调整pH至中性，取10 μ I滴加电极，在37°C孵育30min。
6.一种权利要求1所述方法构建的检测电极的应用，其特征在于，步骤如下取出已修饰完成的细胞传感电极，依次滴加 ο μ L不同浓度的C48/80标准品刺激后的细胞PBS悬浊液，37°C孵育20 IOOmin后，采用微分脉冲伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极表进行表征。
7.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，离心转速为800r/min，离心时间为 5min ;微分脉冲伏安法条件为扫描范围-0. 2 O. 6V，振幅0. 05V ;交流阻抗法条件为 初始电位0. 2V，振幅0. 05V，频率范围1-1OOkHz。
全文摘要
本发明公开一种细胞电化学传感器的制备方法，并对致敏原标准物进行定量精确检测，为检测过敏原提供技术基础。采用本发明中使用的制备方法通过电沉积和自组装方法将纳米金和L-半胱氨酸材料修饰到金电极上；采用P815肥大细胞作为传感介质，利用鼠尾I型胶原构建胶原/细胞3D培养模式，并将其接种到修饰电极完成细胞传感器的构建；最后应用于致敏原标准物C48/80的检测，在浓度范围在0.5～3μg/mL内呈良好的线性关系，检出限为0.13μg/mL。本发明方法精准、高效、快速地实现了对过敏原标准物的识别、传导与检测，克服了传统检测方法的缺陷，所得传感器制作简单，成本低，在检测过敏原方面有良好的应用前景。
文档编号G01N27/30GK103018298SQ201210495430
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者孙秀兰, 蒋栋磊, 纪剑, 张银志 申请人:江南大学