专利名称：聚合物光栅核酸适体生物传感器及检测装置的制作方法
技术领域：
本发明属于检测与传感技术领域，具体涉及一种核酸适体生物传感器及检测装置。
背景技术：
近年来，生物传感器在科学研究、生物医学和工业领域的研究与应用方兴未艾，例如医学诊断、流程控制和环境监测等。生物传感器是以生物学组件作为主要功能性元件，能够感受特定的被测量并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。发明高速度、高特异性、高灵敏的蛋白质检测技术是目前生物传感器研究所面临的紧迫任务。传统蛋白质的检测主要利用抗体-抗原的特异相互作用，而利用寡核苷酸间严格的识别和亲合力而设计的人工合成寡核苷酸-适体的出现，使抗体抗原反应发生新的革命性变化。筛选出来的核酸适体能特异性地结合蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体，并且核酸适体具有易合成、易存储、易修饰等优点，它在核酸结构的多样性、蛋白质/DNA相互作用等方面的研究日益受到重视。生物活性单元的固定化技术是生物传感器制作的核心，现有的生物传感器的固定化技术主要有吸附法、共价键合法、物理包埋法等。吸附法一般是通过含酶缓冲液的挥发来进行，但吸附过程具有可逆性，生物活性单元易从电极表面脱离，寿命较短；共价键合法是将生物活性单元通过共价键与电极表面结合而固定，酶稳定性较好，但电极表面的共价键合较困难。物理包埋法采用凝胶、聚合物包埋，将生物分子包埋并固定在高分子聚合物的空间网状结构中，稳定性好，过程简单。但采用物理方法将凝胶/聚合物限制在电极表面，使传感器难以微型化。目前使用的生物活性单元固定化载体、方法和技术并未达到完善的程度，因此更简单、实用的新型固定化技术仍然是该领域研究的重要方向之一。现有的核酸适体生物传感器主要有光学适体生物传感器、压电晶体适体传感器和电化学适体传感器。现有的光学适体生物传感器有光纤适体传感器、消失波光纤适体传感器、表面等离子共振适体传感器和荧光适体传感器。现有光纤适体生物传感器的基体传感器为石英光纤，作用机理是利用石英表面先接上一层连接物，然后将适体连在光纤端面上，与目的物进行生化反应。反应后产生的特征光学信号(荧光、颜色等)通过光纤探头传递至光检测器，经光电转换进而测定目的物含量。现有消失波光纤适体传感器采用在光纤侧表面加上生物敏感膜(核酸适体)实现对目的物的测量。原理是当光线在光纤纤芯中以全反射方式传播时，会在纤芯侧表面外的其它介质中存在一个光波场，这种波随向外传播距离而快速衰减，称为消失波。当消失波穿过生物敏感膜时，或产生光信号，或导致消失波与光纤内传播光线的强度、相位或频率改变，测量这些变化，即可获得生物敏感膜上变化的信息，即适体与分析物相互作用的信息。上述光纤适体生物传感器和消失波光纤适体传感器的缺点是生物活性单元的固定困难，基体传感器不能重复使用且更换不方便。
现有表面等离子共振适体传感器是将适体分子固化在以石英或玻璃为载体的金属(通常为金)膜表面，加入待测目的物，两者的结合使金属膜与溶液界面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。如果固定入射光角度，就能根据共振角的改变程度对待测目的物进行定量分析，该方法无需标记，十分方便。但由于需要贵金属膜，传感器成本较高。现有荧光适体生物传感器主要是用荧光基团标记核酸适体，基于目标分子和核酸适体作用后产生的荧光偏振或者荧光强度的改变来检测目标分子，或者将荧光基团和猝灭基团分别标于核酸适体上，通过将目标分子引入到体系中后荧光信号的改变来实现对待测物的定量分析。荧光适体生物传感器结构简单，但检测准确度相对较低。光学聚合物具有易加工、重量轻以及适于批量生产等优点，因此聚合物光栅被广泛应用于光学测量、集成光学、光信息处理等领域中。采用微电子工艺制作的微结构光栅是新型光栅发展的一个重要方向，其最小线宽可以做到小于100纳米。为此国内外进行了各种复制技术的研究，主要包括热压、注射成型、浇铸和溶胶-凝胶法、压印法等。利用这些方法进行微结构光栅的复制，使用同一块母光栅可大批量生产出光栅参数相同的复制光栅，复制成本低。无论哪种科学仪器，其发展趋势总是朝着小型化、智能化、高精度和低价格方向发展。生物传感器种类很多，新的方法不断替代传统方法，因此国内外在该领域的研究工作从不间断，研究可用于免疫检测和核酸检测以及作为其它生命科学研究中各种生物反应过程的低成本、方便、快捷生物分子检测方法，对于医院、生物制药部门、检疫检验部门和生命科学研究单位，特别是用于家庭免疫、卫生监护等都有重要意义，应用前景良好。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种聚合物光栅核酸适体生物传感器及检测装置，设备简单、检测容易、稳定性好、过程简单、制作成本低、实现完全非接触测量，对被测样本无损伤，从而克服现有技术的不足。为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案一种聚合物光栅核酸适体生物传感器，包括一片用光学塑料制作的基体，该基体的下表面为光学平面，上表面为聚合物凹凸光栅，该聚合物凹凸光栅是由多条等间距设置的平行凹槽构成，且凹槽内沉积有一层核酸适体。优选的，所述基体为长方体状，其长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，所述聚合物凹凸光栅的光栅常数为I至2微米，光栅凹槽深度为I至2微米，核酸适体的沉积厚度为10-100纳米。优选的，所述基体为聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯材料。一种聚合物光栅核酸适体生物检测装置，包括金属样品盒、半导体激光器、分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CCD传感器、数据处理模块以及前述的生物传感器，该生物传感器固定在金属样品盒上，该光衰减器和线阵CCD传感器依次位于生物传感器的上方，该数据处理模块与线阵CCD传感器连接，该柱面透镜和分光镜依次位于生物传感器的下方，所述半导体激光器包括红光半导体激光器和绿光半导体激光器，该红光半导体激光器和绿光半导体激光器互成90度角安装在分光镜的底部和右侧，该分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CXD传感器中心在同一光轴上。
优选的，所述金属样品盒的中心设有一矩形凹陷区域，该矩形凹陷区域的长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，且矩形凹陷区域的中心位置有一个圆形通光小孔，且金属样品盒的上表面四个方向各有一个用作放置和取出生物传感器的槽形缺口，各槽形缺口的宽度为1. 5毫米，深度为I毫米。优选的，所述红光半导体激光器的功率为3 5毫瓦、波长为650纳米、输出光束直径为I 2毫米，所述绿光半导体激光器的功率为5 10毫瓦、波长为532纳米、输出光束直径为I 2毫米，该红光、绿光半导体激光器的出光面距离分光镜的表面10 20毫米，且红光、绿光半导体激光器的中心轴线与分光镜的两个互相垂直的轴线重合。优选的，所述分光镜为立方体玻璃分光棱镜，边长为10 15毫米；所述柱面透镜为长10毫米、宽5毫米、焦距10毫米的玻璃柱面透镜，该柱面透镜安装在分光镜的正上方5毫米处；所述金属样品盒放置于柱面透镜的正上方10毫米 处，柱面透镜的焦点与金属样品盒之圆形通光小孔的中心重合。优选的，所述光衰减器放置于金属样品盒的上方30毫米处，该光衰减器是由两个薄膜偏振片组成的，两个薄膜偏振片的直径都是30毫米，其中一个薄膜偏振片固定不动，另一个薄膜偏振片可以绕中心轴线自由旋转以改变激光透过衰减量。优选的，所述线阵CXD传感器放置于光衰减器的上方10毫米处，该线阵CXD传感器的CCD长度不小于25毫米，光敏元素为2700个，光敏元素尺寸为11X11微米，光谱响应范围0. 3 0. 9微米；所述光衰减器和线阵CCD传感器同轴安装在同一个可以左右移动的盒子中，当测量生物传感器的衍射光强度时，盒子位于金属样品盒的正上方；当放置和取出生物传感器时，盒子位于金属样品盒的左上方。优选的，所述数据处理模块包括12位A/D转换器和单片机。本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知(1)采用微结构聚合物凹凸光栅包埋生物分子，稳定性好，过程简单，属于新型固定化技术。(2)采用衍射光强比测量方法，检测容易，设备简单。(3)采用微结构聚合物凹凸光栅作为生物传感器，制作成本低。(4)完全非接触测量，对被测样本无损伤。为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
图1为本发明的核酸适体生物传感器结构的主视图。图2为图1的俯视图。图3为本发明的检测装置结构示意图。图4为本发明的检测光路原理图。图5为图4的左视图。图6为金属样品盒结构示意图。图7为(XD探测面光斑分布示意图。附图标识说明1、核酸适体生物传感器11、聚合物凹凸光栅12、核酸适体13、光学平面
2、金属样品盒21、圆形通光小孔22、矩形凹陷区域23、槽形缺口3、半导体激光器31、红光半导体激光器32、绿光半导体激光器4、分光镜5、柱面透镜6、光衰减器7、线阵CXD传感器8、数据处理模块9、盒子。
具体实施例方式请参照图1和图6所示，本发明的聚合物光栅核酸适体光学生物传感器I是一块由光学塑料薄片做出的长方体形状的基体，于基体上表面设置了聚合物凹凸光栅11，基体的底面为光学平面13。所述基体材料为聚碳酸酯，俗称PC，也可以采用聚甲基丙烯酸甲酯，俗称PMMA，后者性能稍差。所述聚合物凹凸光栅11的制作可采用热压印技术将光栅模板上的凹凸光栅复制到聚合物基片上。该聚合物凹凸光栅11是由一组截面为矩形的平行凹槽构成，平行凹槽的方向与长方形基体的长边或短边平行。本实施例中，该基体的长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，聚合物凹凸光栅11的光栅常数为I至2微米，光栅刻槽深度为I至2微米。在聚合物凹凸光栅11的凹槽内，沉积了一层核酸适体12，该核酸适体12为与配体高效、专一结合的DNA或RNA寡核苷酸，核酸适体12厚度10-100纳米，可通过挥发沉积和离心技术将核酸适体12沉积到聚合物凹凸光栅11的凹槽内。请参照图3，本发明的聚合物光栅核酸适体生物检测装置包括金属样品盒2、半导体激光器3、分光镜4、柱面透镜5、光衰减器6、线阵CCD传感器7、数据处理模块8以及前述光学生物传感器I。该光学生物传感器I固定在金属样品盒2上，该光衰减器6和线阵CCD传感器7依次位于光学生物传感器I的正上方，该数据处理模块8与线阵CXD传感器7连接，该柱面透镜5和分光镜4依次位于光学生物传感器I的正下方，所述半导体激光器3包括红光半导体激光器31和绿光半导体激光器32，该红光半导体激光器31和绿光半导体激光器32互成90度角安装在分光镜4的底部和右侧，该分光镜4、柱面透镜5、光衰减器6、线阵CXD传感器7中心在同一光轴上。具体而言，请参照图6，所述金属样品盒2为一内“凹”形的长方体结构，底面中心位置有一个圆形通光小孔21，用作光栅衍射测量的通光光阑孔。该金属样品盒2的中心矩形凹陷区域22的长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，该矩形凹陷区域22的尺寸与光学生物传感器I的尺寸大小相匹配，用于放置光学生物传感器I。所述金属样品盒2的上表面四个边各有一个槽形缺口 23，方便放置和取出聚合物凹凸光栅11，槽形缺口 23的宽度为1. 5毫米，深度为I毫米。金属样品盒2的作用是固定和保护光学生物传感器1，当放置光学生物传感器I时，应将聚合物凹凸光栅11的光学平面13紧贴金属样品盒2带有圆形通光小孔21的底面。请参照图3、4、5，所述红光半导体激光器31的功率为3 5毫瓦、波长650纳米、输出光束直径为I 2毫米，所述绿光半导体激光器32的功率为5 10毫瓦、波长532纳米、输出光束直径为I 2毫米，该红光、绿光半导体激光器31、32互成90度角安装在分光镜4的底部和右侧，且红光、绿光半导体激光器31、32的出光面距离分光镜4的表面10 20毫米，红光、绿光半导体激光器31、32的中心轴线与分光镜4的两个互相垂直的轴线重
口 O所述分光镜4为立方体玻璃分光棱镜,边长为10 15毫米,上述半导体激光器3输出光束通过分光镜4合并在向上传输的同一光路中，所述红光半导体激光器31和绿光半导体激光器32测量时采用轮流工作方式，分时输出激光。所述柱面透镜5为长10毫米、宽5毫米、焦距10毫米的玻璃柱面透镜，该柱面透镜5安装在上述分光镜4的正上方5毫米处，激光束通过柱面透镜5的中心。在柱面透镜5的正上方10毫米处放置金属样品盒2，激光束通过金属样品盒2的底面圆形通光小孔21。金属样品盒2的矩形凹陷区域22内放置光学生物传感器1，激光束通过光学生物传感器I的中心。金属样品盒2的上方30毫米处放置光衰减器6。光衰减器6是由两个薄膜偏振片组成的，通过旋转两个光学偏振片的相对光轴角度来改变衰减系数。两个薄膜偏振片的直径都是30毫米，其中一个薄膜偏振片固定不动，另一个薄膜偏振片可以绕中心轴线自由旋转，以改变激光透过衰减量。光衰减器6的上方10毫米处放置线阵CXD传感器7，线阵CXD传感器7的光敏元素为2700个，光敏元素尺寸不大于11X11微米，光谱响应范围0. 3 0. 9微米，CXD长度不小于25毫米，CCD长度方向平行于上述柱面透镜5圆柱轴方向。该光衰减器6和上述线阵CCD传感器7同轴安装在同一个盒子9中，盒子9可以左右移动。当测量光学生物传感器I的衍射光强度时，盒子9位于金属样品盒2的正上方；当放置和取出光学生物传感器I时，盒子9位于金属样品盒2的左上方。与线阵CXD传感器7连接的是数据处理模块8，主要由12位A/D转换器和单片机组成，完成光信号强度的采集、存储和数据计算。请参照图3，本发明的工作原理如下红光半导体激光器31发出的红色(波长650纳米)激光束，经分光镜4无转折地进入柱面透镜5，绿光半导体激光器32发出的绿色(波长532纳米)激光束，经分光镜4转折90度后进入柱面透镜5。如图4至图7所示，在YZ平面看，激光束经柱面透镜5后仍保留原来光束宽度不变，而透过金属样品盒2的下表面通光小孔后，激光束宽度变为与小孔直径相同，再经过光学生物传感器I上的光栅衍射，产生±1级和0级衍射光，分解成三个不同角度的细光束，最后经过光衰减器6到达线阵CCD传感器7探测面。在XZ平面看，柱面透镜5将激光束会聚于金属样品盒2的下表面圆形通光小孔21上，透过圆形通光小孔21后成为扇形激光束进入光学生物传感器1，由于激光束扇形平面与光学生物传感器I上的光栅方向平行，所以扇形激光束透过光学生物传感器I后仍保留原来扇形形状不变。上述扇形激光束经光衰减器6后到达线阵CCD传感器7探测面，在探测面上(XY平面)形成长条状光斑，因此尽管线阵CCD传感器7光敏元素尺寸只有
11X 11微米，本发明采用的扇形激光束却很容易被线阵CCD传感器7探测，不存在光束对准问题(请参照图7)。线阵CCD传感器7探测到的±1级和0级衍射光强度电压信号，经A/D转换后储存在单片机系统的存储器中，然后计算光栅±1级和0级的衍射光强度比值来确定聚合物凹凸光栅11凹槽深度。测量过程如下采用挥发沉积和离心技术将核酸适体12沉积到聚合物凹凸光栅11的凹槽内，分别用波长650纳米的红色激光(由红光半导体激光器31发出)和波长532纳米的绿色激光(由绿光半导体激光器32发出)测量光学生物传感器I的±1级和O级衍射光强度，通过计算光栅± I级和O级的衍射光强度比值来确定光栅凹槽深度，采用两个激光波长的原因是一个确定的光栅±1级和O级的衍射光强度比值对应多个光栅凹槽深度值，采用两个波长就能在一定深度范围内唯一确定光栅凹槽深度。将被测蛋白质置于光学生物传感器I的光栅表面，待反应一定时间后清洗光栅表面，再一次重复上述过程测量光栅凹槽深度，通过比较光学生物传感器I上光栅凹槽深度的变化量，就能得到被测蛋白质的存在和含量。综上所述，本发明的设计重点在于，所述核酸适体的光学生物传感器的基体上具有聚合物凹凸光栅11，通过温和的物理吸附与包埋相结合的方式固定生物分子，即通过核酸适体12分子极性键、氢键、疏水键的作用，通过挥发沉积和离心技术将核酸适体12吸附于聚合物凹凸光栅11的凹槽中，由于凹槽宽度只有几百纳米到几微米，因而凹槽两壁具有包埋固定生物分子的作用。当聚合物凹凸光栅11的凹槽内的核酸适体12与特异靶分子相结合，其特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力，因而使光栅凹槽深度发生变化。上述半导体激光器3输出的单波长激光束经柱面透镜5在垂直方向会聚于金属样品盒2圆形通光光阑孔上，这样从通光光阑孔出射的光束在垂直于柱面透镜5圆柱体轴线的方向上变为扇形光束形状，在平行于柱面透镜5圆柱体轴线的方向上仍然保持平行光束形状，只是光束宽度变窄，有利于提高空间分辨率。扇形激光束经带有核酸适体12和配体的光栅衍射后形成多个衍射扇形光束，经光衰减器6后到达CCD光敏面。由于凹凸光栅±1级和0级衍射光强之比对光栅的凹槽深度敏感，因此通过比较光栅±1级和0级衍射光强比就能得到凹槽深度的变化。当光栅凹槽内发生核酸适体12和配体的结合反应时，凹槽深度就会改变。通过本检测装置中的CCD光敏面接收0级衍射和土 I级衍射光，由数据处理模块8比较光栅土 I级和0级衍射光强比的变化量，就能获得配体生物分子存在的信息。本发明相对传统技术而且具有设备简单、检测容易、稳定性好、过程简单、制作成本低、实现完全非接触测量，对被测样本无损伤的优点。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种聚合物光栅核酸适体生物传感器，其特征在于包括一片用光学塑料制作的基体，该基体的下表面为光学平面，上表面为聚合物凹凸光栅，该聚合物凹凸光栅是由多条等间距设置的平行凹槽构成，且凹槽内沉积有一层核酸适体。
2.根据权利要求1所述的聚合物光栅核酸适体生物传感器，其特征在于所述基体为长方体状，其长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，所述聚合物凹凸光栅的光栅常数为I至2微米，光栅凹槽深度为I至2微米，核酸适体的沉积厚度为10-100纳米。
3.根据权利要求1所述的聚合物光栅核酸适体生物传感器，其特征在于所述基体为聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯材料。
4.一种聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于包括金属样品盒、半导体激光器、分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CXD传感器、数据处理模块以及如权利要求1至3其中一项所述的生物传感器，该生物传感器固定在金属样品盒上，该光衰减器和线阵CCD传感器依次位于生物传感器的上方，该数据处理模块与线阵CCD传感器连接，该柱面透镜和分光镜依次位于生物传感器的下方，所述半导体激光器包括红光半导体激光器和绿光半导体激光器，该红光半导体激光器和绿光半导体激光器互成90度角安装在分光镜的底部和右侧，该分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CCD传感器中心在同一光轴上。
5.根据权利要求4所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述金属样品盒的中心设有一矩形凹陷区域，该矩形凹陷区域的长度为5毫米，宽度为3毫米，高度为I毫米，且矩形凹陷区域的中心位置有一个圆形通光小孔，且金属样品盒的上表面四个方向各有一个用作放置和取出生物传感器的槽形缺口，各槽形缺口的宽度为1. 5毫米，深度为I毫米。
6.根据权利要求4所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述红光半导体激光器的功率为3 5毫瓦、波长为650纳米、输出光束直径为I 2毫米，所述绿光半导体激光器的功率为5 10毫瓦、波长为532纳米、输出光束直径为I 2毫米，该红光、绿光半导体激光器的出光面距离分光镜的表面10 20毫米，且红光、绿光半导体激光器的中心轴线与分光镜的两个互相垂直的轴线重合。
7.根据权利要求5所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述分光镜为立方体玻璃分光棱镜，边长为10 15晕米；所述柱面透镜为长10晕米、宽5晕米、焦距10毫米的玻璃柱面透镜，该柱面透镜安装在分光镜的正上方5毫米处；所述金属样品盒放置于柱面透镜的正上方10毫米处，柱面透镜的焦点与金属样品盒之圆形通光小孔的中心重合。
8.根据权利要求4所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述光衰减器放置于金属样品盒的上方30毫米处，该光衰减器是由两个薄膜偏振片组成的，两个薄膜偏振片的直径都是30毫米，其中一个薄膜偏振片固定不动，另一个薄膜偏振片可以绕中心轴线自由旋转以改变激光透过衰减量。
9.根据权利要求4所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述线阵CCD传感器放置于光衰减器的上方10毫米处，该线阵CCD传感器的CCD长度不小于25毫米，光敏元素为2700个，光敏元素尺寸为11X11微米，光谱响应范围O. 3 O. 9微米；所述光衰减器和线阵CCD传感器同轴安装在同一个可以左右移动的盒子中，当测量生物传感器的衍射光强度时，盒子位于金属样品盒的正上方；当放置和取出生物传感器时，盒子位于金属样品盒的左上方。
10.根据权利要求4所述的聚合物光栅核酸适体生物检测装置，其特征在于所述数据处理模块包括12位A/D转换器和单片机。
全文摘要
本发明公开一种聚合物光栅核酸适体生物传感器及检测装置，该生物传感器包括基体，该基体的下表面为光学平面，上表面为聚合物凹凸光栅，该聚合物凹凸光栅是由多条等间距设置的平行凹槽构成，且凹槽内沉积有一层核酸适体。该检测装置包括金属样品盒、半导体激光器、分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CCD传感器、数据处理模块以及前述的生物传感器，该生物传感器固定在金属样品盒上，该分光镜、柱面透镜、光衰减器、线阵CCD传感器中心在同一光轴上，所述半导体激光器包括红光半导体激光器和绿光半导体激光器，该红光半导体激光器和绿光半导体激光器互成90度角安装在分光镜的底部和右侧。该检测装置实现完全非接触测量，对被测样本无损伤。
文档编号G01N21/47GK103018172SQ201210528258
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者庄其仁, 龚冬梅, 王加贤, 赖丽萍 申请人:华侨大学