专利名称：检测泰乐菌素和替米考星的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种同时检测泰乐菌素和替米考星的试纸条，特别是检测牛奶中泰乐菌素和替米考星的试纸条。
背景技术：
泰乐菌素和替米考星属于十六元环大环内酯类抗生素，广泛地用作兽药或饲料添加剂，预防和治疗牛、羊、猪、鸡等动物的感染性疾病，还被加入到饲料中用作生长促进剂。但该类药物随动物性食品进入人体后不仅会产生直接的毒性，还会发生过敏反应及产生耐药细菌。为保护食品安全和人类生命健康，很多国家都对该类药物设置了较低的最高残留限量，如欧盟在1999年禁止将泰乐菌素用作饲料添加剂，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定牛奶中泰乐菌素和替米考星的最高残留限量为50 μ g/L。目前，检测泰乐菌素和替米考星残留的方法主要有微生物法、仪器分析法和免疫化学分析法等。微生物法检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生；仪器分析法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。目前常用的免疫分析法主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的同时检测泰乐菌素和替米考星的试纸条。本实用新型的试纸条，包括冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有替米考星-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4-7mm处，试纸上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，微孔试剂上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。本实用新型试纸条中的试纸底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。[0008]本实用新型试纸条具有如下有益效果I、灵敏度高。检测泰乐菌素和替米考星的试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对泰乐菌素的检测灵敏度为25 μ g/L,对替米考星的检测灵敏度为50 μ g/L。2、操作简便快速。使用试纸条检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，室温(20-250C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25°C)孵育5min，观察结果。3、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸以显示红色线“I”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示被检测样本液中泰乐菌素和/或替米考星的含量高于或等于试纸条对泰乐菌素和替米考星的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示被检测样本中泰乐菌素和/或替米考星的含量低于试纸条对泰乐菌素和替米考星的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、检测泰乐菌素和替米考星试纸条的组装制备( I)试纸样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，检测线4包被有替米考星-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。[0024]底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将(I)试纸和(2)微孔试剂装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于盒体12内的固定用具11中。二、试纸条的使用滴加待检牛奶样品溶液200 μ I到微孔试剂中，混匀后，室温(20_25°C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25 0C )孵育5min，观
察结果。 三、检测结果分析泰乐菌素和/或替米考星在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物与泰乐菌素和替米考星结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与替米考星-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸以显示红色线“I”，判为阳性，如图4.a所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试纸条中用到的材料制备方法I、人工抗原的合成与鉴定(I)免疫原的制备——泰乐菌素与牛血清白蛋白偶联物合成取泰乐菌素38mg用5ml水溶解；取牛血清白蛋白(BSA) IOOmg用5ml水溶解；将泰乐菌素水溶液加入BSA水溶液中，用磁力搅拌器搅拌反应24h ;用O. 01mol/L PBS透析3天，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质。以12000r/min离心30min,收集上清,分装，于-20°C保存备用。(2)包被原的制备——替米考星与卵清蛋白偶联物合成将22mg替米考星、15mg N，N’-羰基二咪唑(CDI)用I. 5ml N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，室温搅拌反应lh，即可得到反应液A ;称取卵清蛋白(OVA) 36mg,使之充分溶解在3. 5ml 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中；室温反应24h，用
O.01mol/L PBS透析3天，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质。以12000r/min离心30min,收集上清，分装，于_20°C保存备用。(3)人工抗原的鉴定将泰乐菌素、牛血清白蛋白、泰乐菌素-牛血清白蛋白偶联物及替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶联物用PH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L pH7. 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长20(T800nm范围内扫描，得到泰乐菌素、牛血清白蛋白、泰乐菌素-牛血清白蛋白偶联物的吸收曲线和替米考星、卵清蛋白、替米考星-卵清蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明泰乐菌素及替米考星与载体蛋白偶联成功。2、泰乐菌素单克隆抗体的制备( I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌泰乐菌素单克隆抗体的泰乐菌素单克隆杂交瘤细胞株。·(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成5X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
O.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成O. 01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 2，按每毫升胶体金溶液中加入24 μ g的标准向胶体金溶液中加入上述泰乐菌素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOminJPA 10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min, 4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. 19Γ0. 3% (体积百分含量)、吐温-80 O. 05°/Γ0· 2%(质量百分含量)、ΡΗ7. 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将替米考星-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为l.Oyg/cm2;用
O.01mol/L、pH7· 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条，其特征在于试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述反应膜上具有包被有替米考星-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1、2或3所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
5.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
8.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸条盛装于具有密封盖的塑料试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料，盒体为硬纸盒。
专利摘要本实用新型提供了一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条，试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，微孔试剂上冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜上具有包被有替米考星-载体蛋白偶联物的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“|”。试纸条放置于具塞试剂桶中，12个具塞试剂桶放置于具有12个孔的固定用具的盒体中。本实用新型试纸条具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在泰乐菌素和替米考星残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK202720233SQ20122020485
公开日2013年2月6日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者万宇平, 吴鹏, 罗晓琴, 孙震, 田甜, 崔彦虎, 徐念琴, 余厚美, 付军权 申请人:北京勤邦生物技术有限公司