专利名称：检测氯霉素的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测氯霉素的试剂盒，特别是检测动物源性食品中氯霉素的试剂盒。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种高效广谱抗生素,能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，广泛应用于各类家禽、家畜、水产品生产过程中的传染性疾病控制。但氯霉素在食品中的残留会对人体健康构成潜在危害，能引起人的骨髓造血机能紊乱，造成再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症及新生儿、早产儿灰色综合症等疾病。动物源性食品中氯霉素残留对人类健康构成潜在的危害已越来越被人们所认识，美国仅允许氯霉素用于非食用动物，规定在动物源性食品中不得检出氯霉素；欧盟不允许氯霉素用于产奶母牛和产蛋鸡，在其他动物的使用上也有限制，并严格规定肉中的氯霉素残留量不得超过10μ g/kg ；我国农业部公告第235号文件也规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素的抑菌效果好、价格低，仍有人将其用于家禽、畜类、水产品中。为了保障人民的身体健康以及扩大食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、快速、经济的氯霉素残留检测方法是很有必要的。目前，用来检测氯霉素的最常用方法主要有微生物法、理化分析法及免疫分析法三大类。微生物法操作简便、样品用量少、检测成本低，但易受组织中其它抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高；理化分析法包括液相色谱法、色谱/质谱联用技术、气相色谱法等，是目前检测氯霉素的主要方法，具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但其存在检测成本高、所需设备复杂、对检测人员的要求较高、检测耗时长等缺点；目前常用的免疫分析法主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，但需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测氯
霉素的试剂盒。本实用新型的试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括微孔试剂条和8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞，其中冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物。试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4-7mm处，试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。[0006]本实用新型试剂盒中的试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果I、灵敏度闻。氣霉素检测试剂盒以I父体金标记闻未和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对氯霉素的检测灵敏度为O. I μ g/L。2、操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，室温(20-250C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入鮮育后的微孔试剂后计时，IOmin后观察结果。3、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸条以显示红色线“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示被检测样本液中氯霉素的含量高于等于试剂盒对氯霉素的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示被检测样本中氯霉素的含量低于试剂盒对氯霉素的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、氯霉素检测试剂盒的组装制备(I)试纸条样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，检测线4包被有氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂条微孔试剂条8具有胶塞9，板孔中冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将(I)试纸条和(2)微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。二、试剂盒的使用(I)样品前处理动物组织(猪肉、鸡肉、鱼、虾)样本称取5g±0. 05g均质过的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙酸乙酯，用振荡器振荡5min，3000g以上室温(20_25°C )离心5min ;移取全部上层有机相至IOml干净的玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动lmin，再加Iml O. 02mol/L PBS缓冲液，用涡旋仪涡动30s，3000g以上室温(20-25°C)离心5min ;除去上层有机相，取下层无机相用于分析。牛奶样本称取4. Oml ±0. 05ml牛奶至50ml离心管中，加入6ml乙酸乙酯，2ml乙腈，上下振荡5min，3000g以上室温(20-25°C)离心5min ;移取6ml上层有机相至IOml干燥玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干，加入O. 5ml O. 02mol/L PBS缓冲液，涡动Imin溶解干燥的残留物，待检。蜂蜜样本称取4. 0g±0. 05g蜂蜜至50ml离心管中，加入4ml去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；加入4ml乙酸乙酯，4ml乙腈，上下振荡5min，3000g以上室温(20-25°C)离心5min ;移取6ml上层有机相至IOml干燥玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干，加入0.5ml O. 02mol/L PBS缓冲液，涡动Imin溶解干燥的残留物，待检。(2)用试剂盒检测滴加待检样品溶液200μ I到微孔试剂中，混匀后，室温(20_25°C)孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，IOmin后观察结果。三、检测结果分析氯霉素在样本中的含量高于或等于试剂盒对其的最低检测限时，氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物与氯霉素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红色线“I”，判为阳性，如图4. a图所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸条以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图4. c、4. d所示。[0039]四、检测试剂盒中用到的材料制备方法I、氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定氯霉素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。( I)氯霉素半抗原合成a.取I. Og氯霉素加30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加咪唑O. 44g、叔丁基二甲基氯硅烷O. 37g，室温搅拌3h，加水乙酸乙酯萃取分离，有机相水洗，蒸干，上硅胶柱，石油醚乙酸乙酯=5:1洗脱，得到产物I. 20g;b. 1.2g洗脱产物用吡啶30ml溶解，加琥珀酸酐0.65g，70°C加热搅拌12h。反应停止后，蒸干溶剂，石油醚乙酸乙酯=3:1洗脱，得到产物I. 33g ；c. I. 3g洗脱产物加甲醇溶解，加对甲苯磺酸O. 2g，室温搅拌3h，加水乙酸乙酯萃取分离，蒸干，上硅胶柱。石油醚乙酸乙酯=1:1洗脱，得到氯霉素半抗原产物O. 46g。(2)免疫原的制备——氯霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成取20mg半抗原，溶解于I. 5ml DMF中，得溶液I ;取50mg碳化二亚胺(EDC)用
0.2ml水充分溶解后于加入I中，室温下搅拌24h，得溶液II ;称取牛血清白蛋白(BSA)60mg，使之充分溶解在4. 3ml PBS (pH 7. 2)中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，用O. 01mol/L PBS 4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20°C保存备用。(3)包被原的制备——氯霉素半抗原与卵清蛋白偶联物合成取15mg半抗原,溶解于I. 5ml DMF中，得溶液I ;取36mg二环己基碳二亚胺(DCC)和18mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用O. 2ml DMF充分溶解后于加入I中，室温下搅拌24 h，得溶液II ;称取卵清蛋白(0VA)45mg，使之充分溶解在4. 3ml PBS (pH 7. 2)中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用O. O ImoI/L PBS 4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。(4)氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、氯霉素半抗原、氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成
O.5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L ρΗ7· 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200_800nm范围内扫描，得到载体蛋白、氯霉素半抗原、氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明氯霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。2、氯霉素单克隆抗体的制备( I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌氯霉素单克隆抗体的氯霉素单克隆杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。[0059](4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
O.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成O. 01%(质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用O. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH至7. 2,按每毫升胶体金溶液中加入5(Γ 00μ g的标准向胶体金溶液中加入上述氯霉素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOmin后，加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min, 4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. 19Γ0. 3% (体积百分含量)、吐温-80 O. 059Γ0. 2%(质量百分含量)、ΡΗ7. 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将氯霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为l.Oyg/cm2;用
O.01mol/L、pH7· 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测氯霉素的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和8个试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上具有包被有氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述底板可为PVC底板，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微孔塞。
8.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂中冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
专利摘要本实用新型提供了一种检测氯霉素的试剂盒，试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶中包括微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中。反应膜上具有包被有氯霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“|”。本实用新型试剂盒具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在氯霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK202735343SQ201220227859
公开日2013年2月13日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者何方洋, 万宇平, 罗晓琴, 陶光灿, 吴鹏, 冯静, 赵正苗, 汪善良, 崔廷婷, 陈炜玲 申请人:北京勤邦生物技术有限公司