进行数字测量的方法和系统的制作方法

进行数字测量的方法和系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供了进行数字化测量的方法、装置和系统。
【专利说明】进行数字测量的方法和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年I月20日提交的第61/434，670号美国临时专利申请的权利，出于所有目的将其全文清楚地弓I入本文作为参考。
[0003]发明背景
[0004]本发明涉及进行数字测量的方法、装置和系统。更具体地，本发明涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。
[0005]数字测量因其所提供的稳定性、较高的灵敏度和较高的准确性而在生物学中日益重要。此外，与模拟测量不同，在所述模拟测量中通常必须通过加标(running standard)进行校准，数字测量是基于计算二进制是或否的回复，不需要校准，从而节省用户的时间，增强稳定性和分析的方便性。
[0006]数字分析的一个重要应用是对样品中存在的DNA或RNA的准确定量。在这里，检测DNA或RNA的最广泛使用的方法是聚合酶链反应(PCR)，其中样品通常在约60°C和95°C的两个或三个温度之间循环。使用PCR扩增DNA或RNA大大地推进了大范围的学科，范围从基础生物学到临床诊断学和法医学。诊断学和生物医学研究中常用的一种特别形式的PCR是定量PCR (qPCR)，它不仅能够检测样品中是否存在DNA或RNA，而且能准确地测量其浓度。这是进行后续决策和分析的一个重要的数据点——例如，通过在试验样品中检测到的病毒RNA载量确定给患者的HIV治疗药物的量。
[0007]目前，进行qPCR的最常见形式是实时PCR，广泛应用于多个领域，包括基础生物医学研究和临床诊断学。在实时PCR中，样品的绝对浓度是通过扩增过程的时间进展推导出来的，其中所述扩增过程通过能够具体地识别扩增产物的荧光探针监测，如分子信标或Taqman?探针。实时PCR对各种错误敏感，包括不需要的引物二聚体的形成，其中引物分子由于其序列中的互补段而彼此附着。这样就会产生一种副产物，可以与现有PCR试剂的靶元素相竞争，从而能够抑制靶序列的扩增，并且干扰准确的定量。目标的定量还要求对每个循环的扩增效率有精确的了解，并且由于增长是指数性的，扩增效率中微小的不确定性(例如，低于阈值检测水平)会使目标拷贝数的确定发生极大的错误。当核酸的初始浓度低或荧光检测不够灵敏时，这种错误会非常大。虽然实时PCR能够识别并定量复杂样品中的靶DNA，但还是不能足够精确地定量低样品浓度，而这正是例如病原体检测或临床诊断学所需要的。
[0008]为了解决实时PCR难以定量低拷贝数DNA的问题，发展了数字或限制稀释DNA扩增，所述数字或限制稀释DNA扩增能够更准确地定量样品中模板拷贝的绝对数。在dPCR中，总样品被分为一批小的体积，使得根据Poisson统计，只有少数的体积含有一个或多个靶分子，而大多数体积不含DNA。然后，在所有体积中同时进行DNA扩增，使只有含有靶分子的那些少数体积中的荧光增加。通过对荧光体积(即含有DNA拷贝的那些)进行计数，就能简便而准确地确定DNA拷贝数。
[0009]dPCR的概念很有吸引力，但其尚未广泛应用，这是因为(I)不易建立dPCR中使用的一大批的极小的体积(皮升到纳升)，以及(2)实验的动态范围由离散阵列的大小和数量限定，通常极低。为了准确地定量样品中DNA或蛋白的量，大多数区室通常最多含有一个靶分子。这就意味着样品的初始浓度与分析的动态范围相匹配。换句话说，初始样品浓度应当在向运行dPCR的设备中输入正确的样品浓度之前进行测定。这会增加运行dPCR的不便，并会限制具有恒定体积的数字阵列的可能性。
[0010]不管使用何种具体的反应，重要的是克服数字分析的有限动态范围。直接的方法是通过增加相同大小的数字体积的数量来扩大分析的范围。这一方法是有问题的；为了容纳大量的体积，设备需要很大，并会涉及相当复杂和昂贵的微加工过程。因此，需要进行数字测量的另外的方法和系统。
[0011]除了上述dPCR的实际问题之外，精确的温度控制和温度循环也阻碍着该方法的广泛使用。一般来说，退火和解链步骤的温度控制在+/-1摄氏度。对于DNA和RNA绝对定量重要的许多应用，这些因素难以满足，或者其实现昂贵，特别是在资源有限的环境以及医疗点中。为了提供在这些环境中扩增DNA和RNA的更为符合人体工学的方式，开发了几种等温方法，包括滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或环介导扩增(LAMP)。
[0012]LAMP是用于扩增DNA或RNA的等温过程，在60_65摄氏度的固定温度下有极高的特异性。由于其高的特异性，LAMP在扩增过程中能够区分单核苷酸差异。因此，LAMP已应用于SNP (单核苷酸多态性)分型。LAMP还显示能够检测病毒RNA，其灵敏度比RT-PCR高约十倍。LAMP与其它等温方法区分的另一个特征是其能够直接将DNA的扩增与增加溶液浑浊度的焦磷酸镁的产生相关联。这样，使用一个浊度计就可以跟踪LAMP溶液的进展。因此，非均质分析可以用来检测LAMP产生的扩增产物。焦磷酸镁的产生也能够以荧光指示剂的形式使用，这对数字分析的读出特别有用。在反应前，在反应混合物中加入少量的钙黄绿素。在扩增过程中，焦磷酸盐的产生增加会使含有一个或多个靶分子的体积中的钙黄绿素荧光快速增加。
[0013]这些反应在固定温度下进行，可以减少仪器的复杂度，降低能耗，使其更适合于治疗点诊断和家庭医疗设备。将这些方法转换为数字形式是为了更好、更准确地在治疗点检测出病原体的重要步骤。另外，数字分析还会提高基于蛋白扩增的分析的准确度，如ELISA(酶联免疫吸附试验)或任何单分子分析，其中所述单分子分析可能要求或不要求扩增。
[0014]鉴于上述情况，需要提供进行数字测量的改进的方法和系统。此外，还需要提供使用数字测量的另外的技术，例如数字LAMP。本文公开的本发明提供这些需要以及更多。
[0015]发明概沭
[0016]本发明提供进行数字化测量的方法、装置和系统。更具体地，本发明涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。在一些方面中，本发明提供增加数字测量动态范围的方法和装置，包括但不限于数字PCR、数字等温核酸扩增(例如:数字NASBA和数字LAMP)、数字蛋白扩增(例如:数字ELISA)、数字单分子测量以及其它形式的数字测量。
[0017]在一个方面中，本发明提供一种用于扩大样品数字测量的动态范围的方法，所述方法包括:
[0018]建立样品浓度梯度；和/或
[0019]建立不同大小的样品体积。
[0020]在一个实施方案中，动态范围是通过将数字测量和读数与用于形成浓度梯度的方法和装置整合而扩大的。分析物分子的浓度梯度优选地呈对数或指数形状，但也可以是许多其它形状，包括但不限于线性、多项式、误差、高斯、指数、对数、及其任何组合。
[0021]在另一个实施方案中，通过使用不同大小的数字化体积扩大动态范围。例如，动态范围可以通过在同一芯片或基底上具有下列数字化体积阵列实现:体积为IOOnL的第一组阵列、体积为IOnL的第二组阵列、体积为InL的第三组阵列、体积为IOOpL的第四组阵列、体积为IOpL的第五组阵列、体积为IpL的第六组阵列、体积为IOOfL的第七组阵列、体积为IOfL第八组阵列、最后是体积为IfL的第九组阵列。根据最终的应用，可能在同一芯片上不需要有所有这些阵列组。对于一些应用，从IfL到InL的阵列可能就足够了 ；而对于其它应用，从IOOnL到IpL的阵列可能更合适。然而对于其它应用，仅有不同体积的两组阵列可能就足够了。含有不同体积的阵列组的数量会不同，并取决于每个阵列的大小。例如，如果一个阵列包含一百万个数字化体积，则可能无需涵盖PL到nL的浓度范围的InLUOOpL和IpL的阵列,仅IOOpL和IpL两组阵列可能就足够了。
[0022]在另一个方面中，可以结合浓度梯度和不同数字化体积大小进一步扩大数字测量的动态范围。在另一个方面中，本发明是采用浓度梯度或不同大小不相关体积扩大数字单分子测量动态范围的一种方法。在另一个方面中，本发明是一种制备具有疏水和亲水斑块(patch)的图案化表面的工艺，其中所述斑块导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。在另一个方面中，本发明是非暂时性计算机可读取介质，所述可读取介质具有存储在其上的计算机可执行的指令，所述指令是用于使机器实施本文所述的任何方法的指令。在另一个方面中，本发明是一种包括疏水和亲水斑块的图案化表面的阵列，其中所述斑块导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。在另一个方面中，本发明用于扩大非均质分析中样品数字测量的动态范围。需要注意的是，用于形成浓度梯度和用于数字化样品体积的方法很多。本文提供的实例不应被视为限制性的。
[0023]本发明还描述了用于进行以下的方法和装置:(I)数字NASBA，(2)数字LAMP，(3)进行PCR或使用具有疏水和亲水斑块的图案化表面形成的表面附着液滴进行其它核酸扩增，以及(4)进行使用非均质分析进行数字核酸扩增读数。
[0024]在又一个方面中，本发明提供一种方法，用于使用数字测量确定样品浓度。该方法可以包括产生具有第一体积分布的第一多个液滴，其中第一多个液滴的至少一个液滴包含来自样品的成分；分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴的数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。
[0025]在又一个方面中，本发明提供一种用于对样品进行数字测量的系统。该系统包括含有第一多个液滴的样品容器，所述第一多个液滴具有第一体积分布；用于检测第一多个液滴的至少一个液滴含有的可检测试剂的探测器；以及包含具有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器:分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。
[0026]在又一个方面中，本发明提供了一种对样品进行数字环介导扩增的方法。该方法包括在微流体装置上产生多个样品液滴，其中至少多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子；和在至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生核酸分子的扩增产物。
[0027]为了更完整地理解本发明的性质和优点，应参考随后的与附图结合的详细描述。这些附图以说明的方式表示了本发明的实施方案。本发明可以在多个方面修改而不偏离本发明。因此，附图/图示和这些实施方案的描述的本质是说明性的，而不是限制性的。
[0028]附图的简要i兑明
[0029]图1描述了含有分析物的梯度浓度的数字化体积的生成。出于可视化的目的，我们使用荧光染料荧光素作为我们的分析物。我们使梯度流过一列孔。在这里，梯度是使用以200 μ L/min来自顶部入口(上面箭头)的200 μ M荧光素和以400 μ L/min来自底部入口(下面箭头)水生成的。当孔充满浓度梯度时，我们使轻质矿物油(比水密度小)在孔上方流动，以在孔中建立单个数字化体积。在这个实例中的孔体积相同，但也可使用不同体积的孔。对于该实验，孔的直径为75 μ m,深度为100 μ m,并且位于2mm高的流动室下方。
[0030]图2描述了使用亲水和疏水图案化表面生成不同大小(体积)的数字化体积的方法和装置。在这里，圆形的亲水斑块在疏水表面的背景上形成图案。当该表面暴露于水(或任何其它水溶液，如样品溶液、PCR试剂溶液或缓冲液)和油时，水溶液会优先润湿亲水斑块，而油溶液会优先润湿疏水表面。这样，就会在被油包围的亲水斑块上形成水溶液的液滴(或半液滴)。此外，亲水斑块的面积(即圆圈的面积)各异，以使亲水斑块的不同尺寸控制亲水斑块保留的水溶液的体 积。即使斑块是圆形的，亲水斑块保留的体积的横截面也可以有不同的形状。确切的形状将取决于所使用的亲水和疏水表面以及油相和水相的性质。横截面的形状可以是半圆或比半圆更圆或更扁。亲水斑块优选为圆形的，但也可以为许多其它形状，包括正方形和长方形。
[0031]图3提供了对根据本发明的一个实施方案的计算机系统的说明。
[0032]图4描述了根据本发明的一个示例性实施方案，所占据的液滴的累积数对液滴数量的关系。图中所示尺寸模拟针对浓度(在绘图中从左到右)2.0\10_3、2.0\10_4、
2.0X 10_5、2.0X 10_6、2.0X 10_7 和 2.0XlO^8 摩尔 /fL。所有模拟包含 10，000 个液滴，其直径由从4到190微米延伸的均匀分布中得到。所有液滴按照体积从最小到最大排列，液滴数量i的所占据的液滴的累积数为液滴数量< i的所占据的液滴总数。
[0033]图5提供了根据本发明的一个示例性实施方案，浓度为2.0X 10_6的所占据液滴累积数的模拟。其它详细信息同图1。在低位区域，液滴被占据的概率极低，因此模拟曲线为零。在高位区域，液滴被占据的概率非常接近1，曲线以接近单位斜率上升。在过渡区域，液滴被占据的概率从零增加到近乎I。
[0034]图6显示了根据本发明的一个示例性实施方案，均匀液滴分布(直径为4到190微米)的估计功效(power)。虚线是尺寸E1的测量误差，实线是尺寸E2的测量误差。下部两条线是1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。
[0035]图7显示了根据本发明的一个示例性实施方案，均匀液滴分布(直径为10到100微米)的估计功效。虚线是尺寸E1的测量误差，实线是尺寸E2的测量误差。下部两条线是
1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。
[0036]图8A-8B描述了根据本发明的一个示例性实施方案，使用显微镜确定乳化液滴的大小。图8A显示了硅烷化的显微镜载玻片上液滴的暗场像。如果液滴足够分开，则可根据暗场像确定单个液滴的大小。使液滴呈圆形轮廓的水相和油之间的界面散射的光形成对比度，从此可以测量液滴的直径。比例尺代表100微米。图SB显示了乳化后测量的577个液滴的尺寸分布。分布是不对称的，中位直径为20 μ m。大多数液滴的直径在10到40微米的范围内。
[0037]图9显示了用于说明书的表3中的模拟的部分省略的对数正态分布。这一分布理想化地接近图8中所示的实验性分布。
[0038]图10描绘了图9所示部分省略的对数正态液滴分布的估计功效。虚线是尺寸E1的测量误差，实线是尺寸E2的测量误差。下部两条线是1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。
[0039]图11A-11D显示了根据本发明的一个示例性实施方案，液滴中PCR扩增的检测。图1lA和IlB描绘了 PCR (阴性对照实验)后不含靶DNA的液滴的图像。所显示的是组合的暗场/ ROX (IlA)和暗场/ FAM (11B)图像，其中ROX是加入反应中的参比染料，FAM是检测DNA扩增的Taqman?探针中使用的荧光指示剂。暗场照亮液滴的环形轮廓，覆以来自荧光团的高斯形荧光信号。插入物显示沿着穿过液滴中心的浅灰色线测得的强度。液滴中心区域的信号主要是由于荧光，如果没有DNA靶标，中心区域保持暗的状态，ROX和FAM荧光的比例高(R0X:FAM=120:20=6:1)。图1lC和IlD是在含有靶DNA液滴的PCR图像之后。显示了组合的暗场/ ROX (IlC)和暗场/ FAM (IlD)图像，其具有穿过液滴的相应的线扫描。线扫描显示中心区域增强的荧光信号以及空液滴中未观察到的高斯分布。这两种荧光信号之间的各自的比例明显低于空液滴(ROX: FAM=60:30=2:1)。
[0040]图12A-12C描述了根据本发明的一个示例性实施方案，数字LAMP自数字化芯片的设计。图12A是显示完全组装的芯片的各个组件的示意图。微流体阵列可以嵌入PDMS薄片中，所述PDMS薄片的顶部覆盖有密封膜，底部有PDMS包被的盖玻片。空气压力可以通过可拆式接合器送入，所述可拆式接合器可以连接到外部压力源。图12B是微流体网络的示例性布置。长方形侧室的密集阵列连到薄的主通道。整个阵列由单独的蓄水池包围，以在65°C下孵育时饱和PDMS。比例尺表示5mm。图12C显示了侧室阵列和主通道的示例性几何形状。所有尺寸的单位都是微米。
[0041]图13A-13E显示了根据本发明的一个示例性实施方案，dLAMP SD芯片中样品的自数字化。图13A提供了使用水溶液初次灌注侧室阵列的连续图像。在芯片上涂油之后，含水样品进入主通道并分布到侧室中，置换室中的油相。图13B提供了显示侧室中含水样品自数字化的一系列图像。在全部水相进入芯片后，主通道中的尾油相将纳升大小的液滴隔离到侧室中。图13C显示了侧室中液滴大小分布对所施加压力的依赖关系。平均相对体积分数(RVF)最高的最均匀分布获得自7psi的外部压力。更低和更高的压力会导致具有更易变的体积和降低的RVF的液滴的形成。图13D描绘了来自16个单个芯片的5000个自数字化液滴的RVF值的大小分布。在所有实验中，外部压力均设定为7psi。所有液滴的平均RVF为0.89±0.14。插入物显示RVF值的累积分布。数量对应于RVF分别超过50%、75%和90%的液滴分数。例如，所有液滴的85%充满侧室的75%以上。图13E显示了样品自数字化的重现性。所显示的是15个单个芯片的平均RVF值以及标准偏差，每个芯片有7psi的外部压力。
[0042]图14A和14B描绘了根据本发明的一个实施方案，在升高的温度下的芯片性能。图14A显示了液滴体积上孵育的效果。显示了在65°C下孵育70分钟之前和之后典型的液滴大小分布。样品包含没有模板的阴性对照溶液，因此不会发生扩增。液滴平均收缩约10%。从插入物中可以看到，位于阵列外周的液滴收缩会稍微增加，这是因为他们更多地暴露于大量的PDMS。而在阵列中心的液滴则较少地受到收缩的影响。图14B显示了在我们的芯片中观察到的数字LAMP签名。显示了孵育之前和之后的室阵列的一部分。强度分布对应于穿过各室中心的线。一些侧室中的环介导DNA扩增导致它们的荧光激增。邻近的非LAMP活性的室显示荧光未增强，表明相邻室之间的样品串扰可以忽略。
[0043]图15A-15F显示了不同DNA模板浓度Ci的数字LAMP结果=Ci=Ctl/^ (15A)、Ci=Co/30 (15B)、Ci=Co/150 (15C)、Ci=C(l/430 (15D)和 Ci=c0/1300 (15E)。C0 为模板储备溶液的浓度。LAMP有效室的各分数在图16中分析。对于在最低样品浓度(C(l/1300)下的实验，使用535室芯片以增加阳性室的绝对数量。图15F显示了不加模板的LAMP溶液的对照实验。如预期的一样，没有室显示超过背景的荧光的增强。
[0044]图16A和16B显示了根据本发明的一个实施方案，DNA浓度的相对和绝对变化的定量。图16A显示了LoopAmp?试剂盒中所含的对照DNA样品的稀释系列，见图15。对于每个样品浓度，分析至少三个不同的芯片。实线代表在储备溶液中模板浓度为0.99X IO4摩尔每μ I的泊松分布基础上的预期的阳性事件的分数。该浓度由三个最低样品确定。图16Β显示了 DNA浓度的绝对定量。显示了在65°C下孵育70分钟之前和之后的535孔芯片。λ-噬菌体DNA稀释到20拷 贝每μ I的终浓度，我们预期约有12%的阳性室。在孵育之后，在535孔阵列中检测到9.8%的LAMP有效液滴(最初形成的479个液滴中的47个)。期望值和测量值之间的差异fa可能是由于八倍稀释系列所累积的吸量误差导致的。
[0045]图17显示了表2，其中包括由Z-测试和模拟估计的置信水平的比较。
[0046]发明详沭
[0047]本发明涉及进行数字测量的方法和系统。更具体地，本发明涉及在变化的体积中进行数字测量的方法和系统。
[0048]1.综述
[0049]虽然不是限制性的，本发明部分基于通过生成大小可变化的体积来增加数字分析的动态范围。对于给定的样品浓度，体积的大小可以确定被一个或多个感兴趣的分子(例如:模板分子)占据的概率。在扩增相关技术的实例中，体积大小的变化可以用来改变占据概率，从而改变显示扩增的孔的数量或样品体积(即液滴)。尤其地，本发明优于现有技术，所述现有技术仅增加大小恒定的体积的数量以扩大动态范围。这一优点是由于本文公开的方法和系统不要求很大的面积来容纳需要扩展动态范围的体积，那样会增加芯片上产生缺陷的可能性，其中数字化体积在所述芯片上不正确形成或有其它缺陷。此外，仅增加体积的数量也会增加分析所有数字化体积所需的时间。
[0050]另外，本发明提供了用于进行动态范围增加的数字分析的方法、系统和装置，其中生成大量大小不同的体积。与上述预制的平台不同，本发明可以包括使用连续的而非离散的大小(例如，体积)分布。在一些实施方案中，可以随机地或通过微流体的可控式应用，按照各种方式建立大小不同的液滴。例如，本领域公知通过使用T形接头或流动集中(flowfocusing)设备来微流体生成恒定体积液滴。在这些系统中，液滴的大小可以通过剪切速率和通道尺寸控制。如果对于给定的T形接头几何的剪切速率连续变化，那么可以生成不同体积的液滴。这些方法可以通过例如计算机控制的注射泵或调整气压实现，所述计算机控制的注射泵或调整气压调整水相和载油流体的相对流速。
[0051]在一些实施方案中，可以通过在样品容器(例如，试管)中乳化而随机生成不同大小的液滴。由于例如无需努力控制液滴的大小，因此液滴随机性可以简化实验。在乳化过程中，不同体积的液滴可以通过使用不同的表面活性剂稳定。该乳化方法特别有用，原因如下:(1)该方法与每个生物医学实验室中发现的基本仪器兼容，(2)液滴的生成简单，不要求复杂的芯片设计或用于流量控制的精细设备，(3)液滴不限制在单个孔中，从而使需要容纳大量液滴的空间最小化，以及(4)由于扩增过程中液滴的生成和存储可以使用相同容器而使分析简单。在液滴生成和扩增反应之间无需样品转移。
[0052]术语“动态范围”定义为可变化量的最大和最小可能值之间的比率。
[0053]术语“数字化体积”是指在分析的准备中获得初始样品并将其分为物理上明显更小的体积后产生的体积。
[0054]术语“均质分析”是指在检测时溶液相中存在所有分析组分。在均质分析中，没有分析组分散射可检测的光。
[0055]术语“非均质分析”是指在检测时一种或多种分析组分存在于固相中。沉淀或颗粒的形成，例如在LAMP或滚环扩增中，是异质分析的常见形式。在这类型的分析中，固相成分可能散射可检测的光。
[0056]如本文所提供，术语“连续体积分布”意在描述一种体积分布，所述体积分布在体积分布中连续而非通过预定义离散等级(step)变化。例如，基于芯片的平台可能包括通过预定义离散等级定义的体积分布的孔或液滴体积，作为芯片的一部分制造。也就是说，芯片可以制备成具有存在于IOOnLUOnL和InL的体积，在那些离散等级之间没有其它体积。相反地，连续体积分布不是预定义的(即体积分布在生成或形成液滴体积之前没有确定)。连续体积分布可以，例如，通过乳化产生，如本文进一步描述。在乳液中，体积(例如，液滴体积)具有不连续体积，但分布中的液滴体积在液滴产生之前没有确定(即没有通过制作技术预定义)，体积根据连续体积分布随机分布。液滴体积的上限和下限可以通过施加于乳液的力改变(例如，涡旋振荡速度或振摇强度)。但是，采用这种技术生成的液滴体积会随着产生的体积分布不断变化。
[0057]在一些方面中，连续体积分布也可具有特征，以使对于任意组(或多个)液滴体积，其分布函数可以表示为f (X)，其中f (x)dx为组中给定液滴的体积为X到x+dx的可能性。(dx为无限小的小数。)在某些实施方案中，连续分布是指液滴组中液滴的体积为(I)未预先指定以及(2)对于某些范围，ΧΤΚ〈Χ〈Χ±Κ, f (X)总是大于零(XtrF能等于XUPPOT，有关f(x)无需了解更多)。因此，本发明在一些实施方案中可以包括使用连续分布的液滴组，测量组中每个液滴的体积，并将测得的液滴体积用于分析。
[0058]1.数字测量的方法
[0059]在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于建立与数字测量和读数整合的浓度梯度。例如，微流体梯度生成可以与样品数字化芯片结合。图1显示了使用微通道插入物形成浓度梯度的实例。对于动态范围的扩大，优选对数或指数浓度梯度，但现在有许多方法可用于在芯片上形成各种类型和形状的浓度梯度，包括非线性梯度，如功效、指数、误差、高斯和立方根函数。图1描绘了包含分析物梯度浓度的数字化体积的生成。
[0060]为了使用图1所示的微流体设计类型生成浓度梯度，只需要两个插入口贮液器或通道，但更多也可适用于本发明。一个入口用于样品，一个用于缓冲液(或数字PCR情况下的PCR试剂)。当两种溶液流过网络时，样品溶液按照预定义的方式被缓冲液(水或PCR试剂)稀释，以在各出口通道存在不同浓度的样品。采用这一设计的变型已生成跨越六个数量级的线性、多项和对数梯度。
[0061]在另一个实施方案中，使用浓度跨越六个数量级的对数或指数梯度。样品和PCR溶液被吸移到两个入口贮液器中，之后它们将经过孔阵列。孔充满浓度梯度后，在孔上流过轻质矿物油或其它不互溶流体，以在孔内建立数字化体积。在该实例中的孔体积相同。在本发明的另一个实施方案中，在图1中描绘的图表与不同体积的孔一同使用。
[0062]在另一个实施方案中，样品和PCR溶液被吸移到两个入口贮液器中，之后它们将经过亲水和疏水斑块阵列。当样品流经亲水斑块时，会导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。
[0063]供选择地，样品可通过使用图2所示的图案化表面数字化。
[0064]在本发明的另一个方面中，梯度与使用阀门、孔或液滴建立的数字化体积联合使用。在采用液滴的实施方案中，液滴能够以T通道几何或流动集中几何的连续流动方式形成，这两种方式都是本领域公知的。
[0065]为了数字化已稀释的样品，可以使用图1所述的数字化方案。在这里，包含不同浓度的靶分子的样品溶液流经地形图案化的表面，以形成数字化的离散体积，用于后续的数字测量和读数。供选择地，我们可以采用图2所示的图案化表面数字化所示的样品。
[0066]在另一个实施方案中，可以使用微流体通道和不互溶的流体相数字化样品。在这一实施方案中，样品相被引入通道，之后引入不互溶相，形成由侧腔的几何尺寸限定的离散样品体积(D.E.Cohen, T.Schneider, M.Wang, D.T.Chiu Anal.Chem.82，5707-5717)。
[0067]本发明的另一个方面包含进行本发明方法的装置。这样的装置可以建立与数字测量和读数整合的浓度梯度。在另一个实施方案中，装置进行用于扩大样品数字测量的动态范围的方法，包括建立样品浓度梯度，和/或建立不同大小的样品体积。
[0068]在一些实施方案中，本发明包括扩大数字测量动态范围的方法，所述数字测量基于建立不同大小的数字化离散体积阵列。该方法优于仅通过增加数字化体积的数量来扩大动态范围的方法。这是因为增加数字化体积的数量会增加体积所占据的面积以及增加芯片上具有缺陷的可能性，在所述芯片上数字化体积不正确地形成或有其它缺陷。仅增加数字化体积的数量还会增加分析所有数字化体积所需的时间。扩展动态范围的更好方法是建立不同大小的数字化体积的阵列，而不是仅增加数字化体积的数量。不同大小数字化体积阵列可以是随机阵列(例如，不同直径的液滴均存在并随机分布在容器中)，也可以是规则的阵列(例如，图2所示的阵列)。
[0069]图2显示了建立不同大小的数字化体积的实例，其中采用图案化表面建立不同大小的体积阵列。在该实例中，建立了七组阵列，每组阵列包含900个数字化体积(30X30)。阵列通过在疏水表面的背景中建立圆形亲水斑块形成。因此，当表面暴露于水溶液和油时，亲水斑块会被油包围的水滴覆盖。图下方显示了水滴的侧视图。该侧视图描绘了半圆形液滴，但液滴的形状可以根据我们所使用的具体表面以及使用的油和水溶液而变化(更扁或更圆)。在一个实施方案中，使用了重油，由于油会压迫液滴，因此液滴会更扁。
[0070]限定每组900个亲水斑块的圆圈大小不同,其直径可以是I μ m到5 μ m到10 μ m到50 μ m到100 μ m到500 μ m和直径最终到1mm。由于液滴的体积粗略地测量为直径的立方，因此斑块的直径增加10倍，体积就会增加约1000倍。因此，从空间和读数来说，使用不同大小的数字化体积比仅使用大小相同的数字化体积更为有效。在一个实施方案中，使用每组阵列900个数字化体积，这是由于该数字适合实现统计学稳定的数字读数。但是，根据具体的应用和所需的读数稳定性，可以在每组阵列中设计更多或更少的数字化体积。
[0071]由于不同大小的表面图案亲水斑块的容易性，这一设计的使用代表了建立大小不同的数字化体积阵列的独特方案。因此，对于数字PCR等通常需要大的动态范围的应用，在采用图2所述的图案化表面建立的液滴中进行PCR是高度有益的。
[0072]在一些实施方案中，本发明提供了使用数字测量确定样品浓度的方法。该方法可以包括产生具有第一体积分布的第一多个液滴，其中第一多个液滴的至少一个液滴包含来自样品的成分；分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的液滴体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴的数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。
[0073]在一些实施方案中，体积可以使用阀门、孔或液滴建立。涉及液滴的实施方案可能特别有用。在这里，可以采用多种方法生成不同体积(直径)的液滴。在一种方法中，使用微流体(例如，本领域公知的T形通道或流动集中设备)生成确定体积的液滴；通过改变剪切速率或通道尺寸，容易地形成不同大小的液滴。在另一种方法中，在不同表面活性剂的辅助下通过乳化生成不同体积的液滴；在这里，使用不同的表面活性剂稳定和控制不同体积的液滴。在任何一种方法中，都可以在不同体积(大小)的所有液滴中同时进行分析物的扩增(例如，数字PCR)，之后液滴能够以单一文件形式流过流式细胞仪或其它类似设备，在所述流式细胞仪或其它类似设备中可以确定液滴的大小，并测定来自液滴的荧光。在该示例性设备中，根据荧光确定每个液滴中是否存在扩增产物，并且根据液滴的散射信号确定每个液滴的大小(体积)。这样，通过记录每个液滴的大小以及每个给定大小的液滴中是否存在扩增产物，可以在测定足量的不同大小的液滴后倒退计算样品中存在的分析物的初始浓度。由于液滴大小不同，因此对于给定的动态范围，出于之前讨论的原因，分析比大小相同的液滴快得多。
[0074]如本文所述，可以产生具有多种体积分布的体积，所述多种体积分布可以采用多种不同的方法分析。在一些实施方案中，样品可以包含可分析的一个或多个感兴趣的分子。通过数字测量，可以生成样品的离散体积以用于分析。例如，本文所述的方法可以包括产生具有体积分布的多个液滴。在一些实施方案中，可以在含有合并的不互溶流体的乳液中产生样品的多个液滴，如本文进一步描述。在一个实例中，样品包括含有感兴趣的分子(例如，核酸分子)的水溶液。样品可以与油混合以形成在油中悬浮的样品液滴。根据所采用的方法，乳液中多个液滴的体积可以随着连续体积分布随机分布。此外，体积的范围可以由用于形成乳液的方法控制。例如，可以通过控制涡旋振荡、振摇和/或超声波的强度产生所需要的体积分布。
[0075]如本领域一般技术人员所理解的，体积分布的范围和体积将取决于给定的分析的多个因素。在一些实施方案中，多个液滴的体积分布包括的体积范围可以是约100纳升(nL)到约I毫微微升(fL)、约IOnL到约10fL、约InL到约lOOfL、约IOOnL到约I皮升(pL)、约IOnL到约10pL、约InL到约IpL0根据所选择的液滴生成的因素，通常通过例如改变样品和油与表面活性剂混合的强度确定体积分布的上限和下限。在体积分布中可以具有体积的范围。例如，分布中的体积的范围可以是2倍以上、10倍以上、100倍以上或其它倍数。如果范围是2倍，则体积分布的下限可以是例如10nL，上限为20nL。同样地，如果范围是10倍，则体积分布的下限可以是例如10nL，上限为100nL。
[0076]除了生成具有第一体积分布的第一多个液滴以外，本发明还包括对具有第二体积分布的第二多个液滴进行分析。对第二多个液滴的分析包括，例如，确定第二多个液滴中液滴的体积。体积的确定可以采用多种方法进行(例如，采用散射和/或显微技术)。在一些实施方案中，可以确定多个液滴中所有液滴的单个体积。在一些实施方案中，只能确定一些液滴的单个体积。液滴的分析还包括确定含有本文进一步描述的可检测试剂(即一种或多种可检测试剂)的液滴数量。还应当指出的是，第二多个液滴是基于与产生的第一多个液滴相同的液滴。这样，第一体积分布可以与第二体积分布相同，也可以不同(即更窄)。如果分布相同，则第一多个液滴中的每个液滴将包含在第二多个液滴中。在某些实施方案中，第二体积分布比第一体积分布更窄。例如，液滴可以从具有约IfL到约IOOnL的体积分布的乳液中产生。根据例如样品的浓度，可以对从IfL到约InL的体积分布进行数字测量的分析，其中第二体积分布比第一体积分布更窄。
[0077]在体积分析之前或分析期间，可以在大小不同的体积中进行反应(例如，扩增)，确定哪些体积经历了反应(例如，有扩增产物)。在特定的实例中，可以确定体积(例如，液滴)大小并计数所占据的液滴(例如，含有可检测试剂的液滴)的数量。可以分析所有液滴或仅分析某些液滴。分析可以，例如，通过将液滴以单列的形式流过流式细胞仪或类似设备来实现，在所述流式细胞仪或类似设备中可以确定液滴的大小，并检测是否存在扩增。液滴的大小可以，例如，根据来自液滴的散射信号确定，是否存在扩增可以由来自液滴的荧光信号指示。供选择地，液滴的直径也可以通过显微法确定。液滴可以从样品容器中提取(在反应例如扩增之前、期间或完成之后)，并用CCD摄像机取得广角图像。液滴，例如，可以铺展在表面上，或嵌于两个载玻片之间，并放置在广角显微镜下。通过使用合适的激发和发射滤光片，可以定量液滴中的荧光，从而显示是否存在扩增。通过记录液滴的大小以及每个液滴中是否存在扩增产物，可以在测定足量的不同大小的液滴之后倒退计算样品中存在的分析物的初始浓度。由于液滴大小不同，因此对于给定的动态范围，出于之前讨论的原因，分析比大小相同的液滴快得多。在一些实施方案中，本文的方法进一步包括使用多个液滴中的液滴数量和多个液滴中的液滴体积进行数字测量。例如，样品中感兴趣的分子的浓度可以通过使用多个液滴中的液滴数量、含有一个或多个感兴趣的分子的多个液滴中的液滴数量以及通过测量多个液滴中一些或所有液滴的体积来确定。确定样品浓度的示例性方法请见实施例部分。
[0078]本发明可用于数字测量提供有关样品的有用信息的任何技术中。因此，本文提供的方法、系统和装置可以包括含有可检测试剂的体积。在特定的实施方案中，体积可以是微流体芯片上的孔或室，或含有可检测试剂的液滴(例如，在乳液中或芯片表面上形成的水滴)。一般理解的是，可检测试剂可以含有可检测的单个分子或多个可检测分子。也可以使用其它类型的可检测试剂，例如珠子、量子点、纳米粒等。另外，可检测试剂可以，例如，是待分析的样品中存在的感兴趣的分子(例如，血液、血清、唾液或其它溶液中的核酸分子)。供选择地，可检测试剂可以是与样品中感兴趣的分子(例如，核酸分子)相关的分子，从而使该分子可被检出。在一些实施方案中，本发明的方法和系统可以用于涉及数字测量的扩增相关技术(例如，数字PCR)。对于扩增测量，体积(例如，液滴)可以包含单个DNA分子，例如，但该体积还包含一般公知用于扩增和检测的必要组分。在一些实施方案中，可检测试剂是荧光的，因此，可通过本领域已知的基于荧光的检测方法检测。但是，也可使用其它检测方法(例如，吸光度、化学发光、浊度、和/或散射)分析体积的成分。适用于本发明的多种可检测试剂都是本领域公知的，并且可以例如在Molecular Probes? Handbook,第11版(2010)中找到。
[0079]在特定的实施方案中，可检测试剂可与用于检测的感兴趣的分子关联。例如，可检测试剂可与核酸分子(例如，DNA或RNA)、肽、蛋白、脂质或样品中存在的其它分子(例如，生物分子)关联。如本文所定义，在可检测试剂上下文中的“关联”包括通过共价和/或非共价相互作用与分子的相互作用。例如，可检测试剂可以共价连接于靶分子。供选择地，可检测试剂可以，例如，是可以用于检测核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)的插层剂或Taqman?探针。可以使用其它可检测试剂，例如不会与感兴趣的体积中的分子关联的参比染料。
[0080]本发明的一些实施方案包括在不互溶的流体中产生液滴。如本领域公知，多种不互溶流体可以结合以产生体积不同的液滴。如本文进一步描述的，流体可以以多种方式结合，例如通过乳化作用。例如，水溶液(例如，水)可以与非水流体(例如，油)结合，在样品容器内或微流体芯片上产生液滴。适用于本发明的水溶液包括水基溶液，所述水基溶液进一步包括缓冲液、盐及一般已知在诸如PCR的检测分析中使用的其它组分。因此，本文描述的水溶液可以包括，例如，引物、核苷酸和探针。适合的非水流体可以包括但不限于，有机相流体如矿物油(例如，轻质矿物油)、硅油、含氟油或含氟流体(例如，含氟乙醇或Fluorinert)、其它市售材料(例如,Tegosoft?)或其组合。
[0081]除了水溶液和非水流体以外，还可含有表面活性剂，以例如改善液滴的稳定性和/或促进液滴的形成。合适的表面活性剂可以包括但不限于，非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、硅酮基表面活性剂、含氟表面活性剂或其组合。非离子型表面活性剂可以包括，例如，山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Span60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TweenSO)和山梨糖醇酐单油酸酯(SpanSO)。硅酮基表面活性剂包括，例如，ABIL WE09表面活性剂。本领域一般地熟知的其它类型的表面活性剂也同样可用。在一些实施方案中，表面活性剂可以存在于多种浓度或浓度范围下，例如按重量计约0.01%、0.1%、0.25%,0.5%、1%、5% 或 10%。
[0082]本发明进一步包括样品浓度的确定。例如，所述方法和系统可以用于确定(I)液滴的体积，以及(2)含有可检测试剂的液滴的数量，以用于确定样品浓度。这一信息能够以多种方式应用，以确定样品浓度。例如，靶分子在样品中以是摩尔/体积的浓度单位存在。样品可分布为体积不同的液滴，可以对所述体积进行分析。(所有或一些)液滴的单个体积可以采用本文提供的方法确定。另外，使用本文所述的检测方法，可以分析液滴是否含有可检测试剂。对于给定的样品浓度，一些体积不同的液滴可能包含可检测试剂，一些液滴可能不包含。对于更高的样品浓度，一般地多个液滴中更多的液滴可能包含可检测试剂，反之亦然；对于低的样品浓度，多个液滴中更少的液滴可能被可检测试剂占据。如本文进一步描述的，在具体体积分布中被可检测试剂占据的概率可针对广泛范围的样品浓度确定，然后可与实际数据比较，确定未知样品的浓度。下面实施例1和实施例2中进一步公开了样品浓度的确定。实施例所示的方法涉及初步估计样品浓度，然后计算液滴数量，预测所述液滴包含一个或多个可检测试剂(被占据的液滴)。然后，使用熟知的数值法调整估计的样品浓度，直到多个液滴中被占据液滴的预测数量与被占据液滴的实际数量相等，达到希望的准确度。
[0083]如本文进一步描述的，本发明提供了一些现有方法和系统无法实现的数字测量的多个方面。例如，本发明能够提供在广泛动态范围内测量样品浓度的能力。在一些实施方案中，动态范围可以是至少三个数量级、至少四个数量级、至少五个数量级、或至少六个数量级。在一些实施方案中，动态范围可以是约?ο—1到约10_9摩尔/ fL、约10_2到约10_8摩尔/ fL、约1(Γ3到约10〃摩尔/ fL、或约1(Γ4到约1(Γ6摩尔/ fL。在特定的实施方案中，可以通过检测与样品中感兴趣的分子相关联的可检测试剂来确定动态范围内的样品浓度。动态范围可以取决于多种因素，诸如乳液中产生的体积的范围和/或分析和检测的体积范围。例如，具有第一体积分布的第一多个液滴能够产生可检测浓度的动态范围。在某些情况下，动态范围可以通过分析具有第二体积分布的第二多个液滴中更窄的体积分布来减小。在特定的实施方案中，体积分布包括连续变化的液滴体积。
[0084]通过整合dPCR与芯片上的梯度生成、或通过使用大小不同的数字化体积、或这两种方法的组合，本发明有效地将我们的dPCR芯片的动态范围从I个数量级扩大到6个数量级，所述动态范围可以与RT-PCR提供的动态范围相当。如果需要,可以通过使用更广范围的浓度梯度或更大尺寸差异的数字化体积阵列进一步扩大动态范围。这种进行定量PCR(qPCR)的新方法有几个主要的优点:(I)如前所述的更为准确，(2)避免了进行RT-PCR所需的校准样品类型，从而节省时间，以及(3)无需实时灵敏荧光检测，所述实时灵敏荧光检测会使RT-PCR与常规的PCR机器相比产生相对更高的成本(约十倍)。
[0085]本发明的另一个方面包括用于实施本发明方法的装置。这样的装置可以建立不同大小的数字化和离散体积阵列。在另一个实施方案中，装置实施用于扩大样品的数字化测量动态范围的方法，所述方法包括建立样品浓度梯度和建立不同大小的样品体积。
[0086]在本发明的又一个方面中，本文所述的方法、系统和装置可以用于等温扩增技术，例如数字ELISA、NASBA和LAMP。ELISA是基于蛋白的，常用于蛋白或小分子的定量。NASBA和LAMP是被开发以补充PCR的等温扩增方案。
[0087]在等温扩增中，没有传统PCR中发生的温度循环。有几种类型的等温核酸扩增方法，例如转录介导扩增、基于核酸序列的扩增、RNA技术的信号介导扩增、链置换扩增、滚环扩增、DNA环介导等温扩增、等温多置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、以及环状解链酶依赖性扩增。
[0088]NASBA (基于核酸序列的扩增)是用于扩增RNA的等温(约40°C )过程，并已成功应用于检测临床样品中的病毒和细菌RNA。NASBA的优点是:(I)其具有高的扩增效率和快速的扩增动力学，在一或两个小时内可以实现一千倍以上的扩增；(2)不会产生象RT-PCR那样由基因组dsDNA导致的假阳性结果；(3)可以不使用内含子侧翼引物而进行基因表达研究；(4)不要求PCR需要的温度控制和反馈的程度。因此，NASBA已广泛用于检测病毒和细菌RNA。NASBA是一种等温方法的事实使其可以使用温控烤箱同时运行多个样品，这在许多现场工作中都是重要的实用优点。[0089]LAMP代表环介导等温扩增，能够在等温条件(约60°C )下高特异性、高效率和快速扩增DNA。由于其扩增反应的特点，LAMP能够在扩增过程中区分单核苷酸差异。因此，LAMP已被用于SNP (单核苷酸多态性)分型。LAMP已在检测病毒RNA中的灵敏度比RT-PCR高约十倍。此外，由于DNA的LAMP扩增可以直接与增加溶液浑浊度的焦磷酸镁的产生相关联，因此使用简单的浊度计就可以监测LAMP的进展。因此，非均质分析可以用来检测LAMP产生的扩增产物。
[0090]在一个方面中，本发明提供了用于进行样品的数字环介导扩增的方法。该方法可以包含在微流体装置上产生样品的多个液滴，其中多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)；然后在至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生核酸分子的扩增产物。该方法还可以包括扩增产物的检测。在一些实施方案中，该方法包括确定多个液滴中含有扩增产物的液滴数量；并使用多个液滴中单个液滴的体积和多个液滴中含有核酸分子的液滴数量来计算样品中核酸分子的浓度。微流体装置可以包括配置以形成多个液滴的多个室。采用本发明进行数字LAMP的其它方面可见实施例3。
[0091]尽管NASBA和LAMP有这些优点，其一个重要的缺点是难以进行定量化，而定量化在大多数情况中都是有益的。定量通常要求在相同的条件下使用标准扩增产物进行谨慎的校准和控制，这可能非常单调(特别是对于现场研究)，并且在许多情况下不实用。对于非均质分析，如检测LAMP中的沉淀，准确的校准可能尤其有挑战性。
[0092]滚环扩增(RCA)是一种等温核酸扩增法。这种方法在几个方面与聚合酶链反应和其它核酸扩增方案有区别。在RCA过程中，短DNA探针退火到感兴趣的DNA，如病原生物的DNA或含有有害突变的人类基因。然后，探针充当滚环扩增反应的引物。探针的自由端退火到小的环状DNA模板。加入DNA聚合酶以延伸引物。DNA聚合酶沿着环状DNA模板不断延伸引物，生成由该环状模板的许多重复拷贝构成的长的DNA产物。在反应结束时，聚合酶生成几千个环状模板的拷贝，拷贝链与原始靶DNA相连。这允许靶标具有空间分辨率，和信号的快速扩增。正向和反向引物的使用可以将上述线性扩增反应改变为在一个小时内生成多达1012个拷贝的指数模式。这种定量测量要求的校准可能比较麻烦。
[0093]为了克服这一缺点，本发明提供了数字等温扩增，如NASBA和LAMP，其中与数字PCR类似，数字化体积阵列的使用用于进行数字NASBA、数字LAMP和滚环扩增。此外，通过使用浓度梯度和/或不同大小的数字化体积阵列，我们可以有效地扩大这些数字测量的动态范围。本方法理想地补充了这些等温扩增方案，使其成为用于测量是否存在RNA和DNA的定量技术。在本发明的另一个实施方案中，本方法应用于基于抗体的扩增。在另一个实施方案中，该方法应用于基于特异性分子识别的扩增。
[0094]II1.数字测量的系统
[0095]在又一个方面中，本发明提供了一种系统，用于使用数字测量测定样品浓度。该系统可以包括含有具有第一体积分布的第一多个液滴的样品容器；用于探测第一多个液滴的至少一个液滴中含有的可检测试剂的探测器；以及包括存储有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器:分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。在一些实施方案中，样品中可检测试剂的浓度用于计算样品的浓度。
[0096]如本文进一步描述，用于数字测量的体积可以通过多种方式生成和分析。本发明包括样品容器，所述容器用于容纳体积，以使体积可以进一步被处理和/或分析。本发明的样品容器包括试管、微量离心管、微阵列上或微流体芯片中的孔阵列、配置以生成液滴的微流体芯片、以及市售或一般地公知的能够容纳样品的离散体积(例如，孔或液滴)的装置。本发明的系统还包括配置用于分析体积的检测系统。检测系统可以包括用于分析体积成分、确定液滴体积和/或其它感兴趣特征的探测器。本文所述的方法一般可以与任何已知的能够检测和分析体积(例如，液滴和/或孔)的系统相容。
[0097]在又一个方面中，该系统可以包括计算机可读取的存储介质，用于进行数字测量。计算机可读取的存储介质在其上存储有指令，在计算机的一个或多个处理器执行这些指令时会使计算机:分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一多个液滴包含第二多个液滴，并且第二体积分布比第一体积分布更窄；并且使用第二多个液滴中的液滴的数量、第二多个液滴中一些或所有液滴的体积以及第二多个液滴中的含有一种或多种可检测试剂的液滴数量来确定样品中可检测试剂的浓度。
[0098]在又一个方面中，提供了用于进行体积分析并且从分析的体积中检测和计算信息的系统。该系统包括一个或多个处理器，以及包含可由一个或多个处理器执行的指令的存储装置。当这些指令被一个或多个处理器执行时，该系统至少接收用户输入来进行体积分析(例如，多个液滴)。该系统可配置成进行本发明方法的多个方面，例如计算体积数量(例如，液滴)、确定一种体积分布中的多个液滴的体积，并使用含有一种或多种可检测制剂的液滴数量确定样品中可检测试剂的浓度。该系统还为用户提供数据。提供给用户的数据可以包括样品中可检测试剂的浓度或样品的浓度。
[0099]图3是计算机系统100的简化的方框图，该计算机系统100可用于本文所述的方法、介质和系统中。在各种实施方案中，计算机系统100可用于实施以上说明和描述的任何系统或方法。如图3所示，计算机系统100包括处理器102，通过总线子系统104与多个外围子系统联系。这些外围子系统包括存储子系统106、用户界面输入装置112、用户界面输出装置114以及网络界面子系统116，所述存储子系统106包括存储器子系统108和文件存储子系统110。
[0100]总线子系统104提供一种机制，使计算机系统100的各种组件和子系统能够如预期一样相互联系。尽管总线子系统104作为单个总线示意性地显示，但总线子系统的供选择的实施方案也可使用多个总线。
[0101]网络界面子系统116提供与其它计算机系统和网络的界面。网络界面子系统116充当从其它系统接受数据以及从计算机系统100输出数据到其它系统的界面。例如，网络界面子系统116可以使用户计算机连接到互联网并通过互联网促进通信。
[0102]用户界面输入装置112可以包括键盘、定位设备如鼠标、跟踪球、触摸板或图形输入板、扫描仪、条形码扫描仪、纳入显示器的触摸屏、音频输入装置如声音识别系统、麦克风和其它类型的输入装置。一般地，术语“输入装置”的使用意在包括向计算机系统100输入信息的所有可能类型的装置和机制。
[0103]用户界面输出装置114包括显示器子系统、打印机、传真机、或非可视显示器如音频输出装置等。显示器子系统可以是阴极射线管(CRT)、平板设备如液晶显示器(IXD)或投影设备。一般地，术语“输出装置”的使用意在包括用于从计算机系统100输出信息的所有可能的类型的装置和机制。使用一个或多个用户界面输出装置114，计算机系统100可以输
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[0104]存储子系统106提供一个计算机可读取的存储介质，用于存储基本的编程和数据结构。当被处理器执行时，软件(程序、代码模块、指令)提供了本文所述的方法和系统的功能，可以存储在存储子系统106中。这些软件模块或指令可以由一个(或多个)处理器102执行。存储子系统106也可以提供一个存储库，用于存储根据本发明使用的数据。存储子系统106可以包括存储器子系统108和文件/磁盘存储子系统110。
[0105]存储器子系统108可以包括多个存储器，包括用于存储程序执行过程中的指令和数据的主随机存取存储器(RAM)118，以及用于存储固定指令的只读存储器(R0M)120。文件存储子系统110提供程序和数据文件的非短暂性持久(非易失)存储，可以包括硬盘驱动器、软盘驱动器及相关的可移动介质、光盘只读存储器(CD-ROM)驱动器、光驱、可移动介质盒以及其它类似的存储介质。
[0106]计算机系统100可以有多种类型，包括个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、主机、一体机、服务器或任何其它数据处理系统。由于计算机和网络的性质不断变化，图3中对计算机系统100的描述只作为用于说明计算机系统的实施方案的一个具体示例。具有比图3所描绘的系统更多或更少的组件的许多其它配置也是可以的。
[0107]鉴于本公开，本领域技术人员显而易见的是，本发明的装置、设备、系统和组件的具体尺寸可以根据预期的应用而容易地改变。此外，应懂得的是，本文所述的实施例和实施方案仅出于说明性目的，可向本领域技术人员建议各种改变或变化，并且这些改变或变化都在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文所述实施方案的众多不同组合是可能的，并且这些组合方式.被视为本发明的一部分。另外，本文中与任何一个实施方案结合讨论的所有特征都可以容易地调整以用于本文的其它实施方案中。在不同实施方案中针对类似特征使用的不同术语或标记符号不一定意味着与明确规定的不同。因此，意在仅参照所附权利要求描述本发明，并不限于本文所公开的实施方案。
[0108]IV.实施例
[0109]实施例1
[0110]实施例的理论框架
[0111]该实施例描述了一个非限定性的理论框架，所述理论框架可以用来描述本文所公开的本发明的特定方面。应当理解的是，该实施例中描述的方法是采用本发明确定样品浓度的众多方法之一。在这一理论框架下，假设靶分子以单位为摩尔/体积的浓度Cs存在于样品中。样品分布为不同体积的数字化体积；靶分子按照泊松统计分布为液滴。对于数字阵列中的每个液滴，如方程式I中所示，靶标的平均数取决于其体积Vi，和初始样品浓度Cs:
[0112]P{n,Cs-Vi)=(('、七)exp(-Cv// ) (I)

n\
[0113]是对于溶液中靶分子的给定浓度Cs，在体积Vi的液滴中找到η个分子的概率。扩增反应会导致包含一个或多个分子的液滴与空液滴区别开来，例如通过其荧光强度。在该方法中，我们只知道液滴是空的还是已被占据。有关的概率如方程式2所示:
【权利要求】
1.一种采用数字化测量确定样品浓度的方法，所述方法包括: 生成具有第一体积分布的第一多个液滴，其中所述第一多个液滴中的至少一个液滴包含来自于所述样品的成分； 对具有第二体积分布的第二多个液滴进行分析，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴的数量，其中所述第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；以及 使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴数量确定所述样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二体积分布为连续的体积分布。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二体积分布在产生步骤之前是未限定的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过合并不互溶流体而在乳液中产生所述第一多个液滴。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述不互溶流体包括水和油。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述乳液包括表面活性剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个液滴的第二体积分布包括以下体积范围:约100纳升(nL)到约I毫微微升(fL)、约IOnL到约10fL、约InL到约100fL、约IOOnL到约I皮升(pL)、约IOnL到约10pL、约InL到约lpL。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂是荧光的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测试剂与核酸分子、肽、蛋白或其组合关联。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括进行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)或其组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少三个数量级的动态范围内确定。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少六个数量级的动态范围内确定。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体积分布中的体积变化超过两倍。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体积分布中的体积变化超过10倍或超过100倍。
15.一种采用数字化测量确定样品浓度的系统，所述系统包括: 包含具有第一体积分布的第一多个液滴的样品容器； 用于检测在第一多个液滴中的至少一个液滴内含有的可检测试剂的探测剂；以及 包括存储有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器: 分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液体体积以及第二多个液滴中含有可检测试剂的液滴数量，其中所述第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；以及 使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴数量来确定所述样品的浓度。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一和第二体积分布为连续的体积分布。
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述第二体积分布在产生步骤之前是未限定的。
18.根据权利要求15所述的系统，其中通过合并不互溶流体而在乳液中产生所述第一多个液滴。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述不互溶流体包括水和油。
20.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂是荧光的。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述可检测试剂与核酸分子、肽、蛋白或其组合关联。
22.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一多个液滴中的至少一个液滴包括来自聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)或其组合的扩增产物。
23.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂的浓度在至少三个数量级的动态范围内确定。
24.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂的浓度在至少六个数量级的动态范围内确定。
25.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一体积分布的体积变化超过两倍。
26.根据权利要 求15所述的系统，其中所述第一体积分布的体积变化超过10倍或超过100 倍。
27.一种用于进行样品的数字环介导扩增的方法，所述方法包括: 在微流体装置上产生所述样品的多个液滴，其中所述多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子；以及 在所述至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生所述核酸分子的扩增产物。
28.根据权利要求27所述的方法，还包括扩增产物的检测。
29.根据权利要求28所述的方法，还包括: 确定多个液滴中包含扩增产物的液滴数量；以及 使用多个液滴中单个液滴的体积和多个液滴中含有核酸分子的液滴数量计算所述样品中核酸分子的浓度。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述微流体装置包括配置用于形成多个液滴的多个室。
【文档编号】G01N33/68GK103429997SQ201280012684
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年1月20日 优先权日:2011年1月20日
【发明者】D·T·赵, B·S·藤本, A·R·甘森, G·S·言, R·M·洛伦兹 申请人:华盛顿大学商业中心