专利名称：一种高灵敏、高线性的d-d二聚体检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物样本检测领域，特别是涉及到一种利用平均直径不同的两种乳胶微粒来提高生物样本检测灵敏度和检测范围的试剂盒及其使用方法，具体地说是一种高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
D 二聚体(D-D dimer)来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。是在血液凝固 纤溶系统中，由于凝固第十三因子的作用，安定的交联纤维蛋白被纤溶酶分解的FDP的一种，纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物。血液中D 二聚体的增加证明体内有血栓形成，启动纤溶系统，在恶性肿瘤，产科疾患，血管病变，DIC (Disseminated Intravascular Coagulation Syndrome;弥散性血管内凝血综合症)等疾病中显示高值。纤维蛋白降解产物D-二聚体的水平升高，表明体内存在着频繁的纤维蛋白降解过程。因此，纤维D-二聚体是深静脉血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。该适应症所采用的诊断方法是D 二聚体测定。血清D 二聚体的测定目前检测的方法是胶乳免疫比浊法，标本中的D-D 二聚体与鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳增强颗粒发生抗原抗体反应，产生凝集以致浊度上升。通过对浊度，测定D二聚体浓度。其反应过程如下:
血清中D-D 二聚体+鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体一抗原抗体复合物。然而，现有的方法在检测灵敏度上及线性上均不宽，在用于临床检测D-D 二聚体时常常受到高浓度样本检测线性不足亦或是低浓度样本检测灵敏度低的制约。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，而提供一种同时运用平均直径不同的两种乳胶微粒对D-D 二聚体进行检测，并通过优化大、小微粒的平均直径和它们在反应体系中的浓度，可以实现低浓度场合的高灵敏度检测，也可以使高浓度场合下的检测范围得以拓宽，并提升低浓度场合的检测准确度从而得到准确的临床判定的高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒及其使用方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
一种高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒，其中:包括有试剂一、试剂二、D-D 二聚体标准品以及对照用D-D 二聚体异常血清，试剂一为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，试剂二包括有浓度为0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒与浓度为0.05 (w/v)至0.2%(w/v)的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒混合液，小直径鼠抗人D-D 二聚体单 克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量的0.5%至10%。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
上述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.15微米至0.29微米之间，小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.05微米至0.10微米之间。上述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的抗体的蛋白质质量高于两种胶乳颗粒总蛋白量质量的14%。上述的试剂二中含有的D-D 二聚体单克隆抗体为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒所能吸附的D-D 二聚体单克隆抗体最大量的85%至120%。上述的试剂二中含有的D-D 二聚体单克隆抗体为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒所能吸附的D-D 二聚体单克隆抗体最大量的95%至120%。上述的试剂一为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。一种高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
步骤一、在试剂一中加入D-D 二聚体试验品，置于37°C水浴5分钟，然后加入试剂二，置
于37°C水浴，使D-D 二聚体试验品中的D-D 二聚体与试剂二中的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 10秒后， 通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO，3分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ k職=Al-AO ；
步骤二、通过已知的D-D 二聚体标准品吸光度ΛD-D 二聚体标准品浓度计算
D-D 二聚体试验品浓度；公式为:D-D 二聚体试验品浓度=D-D 二聚体标准品浓度X Δ A试验
品/ △ A标准。上述的D-D 二聚体试验品浓度在Omg/L至20.8mg/L。与现有技术相比，本发明试剂二包括有浓度为0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒与浓度为0.05(w/v)至0.2%(w/v)的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒混合液，小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量的0.5%至10%。这两种乳胶微粒均属致敏乳胶微粒。运用平均直径不同的两种乳胶微粒的可以提高低浓度场合的检测灵敏度和拓宽高浓度场合的检测范围；平均直径大的乳胶微粒(大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒)偶连一定数量的抗体后进行免疫反应，可以达到或者接近免疫反应的最大速率，而平均直径小的乳胶微粒(小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒)偶连少于某个量的抗体后进行免疫反应，可以降低反应速率；通过优化大、小微粒的平均直径和它们在反应体系中的浓度，可以实现低浓度场合的高灵敏度检测，也可以使高浓度场合下的检测范围得以拓宽，并提升低浓度场合的检测准确度从而得到准确的临床判定。检测D-D 二聚体浓度的方法是通过标本中的D-D 二聚体与鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳增强颗粒发生抗原抗体反应，产生凝集以致浊度上升。在570nm处通过分光光度计测定浊度的变化率，再与标准品对比求出D-D 二聚体的浓度。D-D 二聚体检测试剂采用先进的纳米技术制作的乳胶颗粒非特异性地吸附样品中的鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体，使其固相化，易于分散。在D-D 二聚体单克隆抗体乳胶颗粒的制备上，将以两种不同亲和力的抗体分别标记不同大小的微球，以高亲和力抗体标记大微球，其检测范围窄但灵敏度高，适合对低浓度样本进行检测，而以低亲和力抗体标记小微球，适合定量检测高浓度标本。如此即克服了血清学中的钩状效应，同时也提高了试剂检测的灵敏度，这是其它检测方法学所不能具备的。用大微球包被的高亲和力的抗体容易和低浓度的抗原发生抗原抗体反应，小微球包被的低亲和力的抗体容易和样本中的高浓度抗原发生反应。可以说该试剂可同时兼顾高低浓度的样本测定。
具体实施例方式以下对本发明的实施例作进一步详细描述。本发明的一种高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒，其中:包括有试剂一、试剂二、D-D 二聚体标准品以及对照用D-D 二聚体异常血清，试剂一为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。试剂二包括有浓度为0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒与浓度为0.05 (w/v)至0.2% (w/v)的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒混合液，小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量的0.5%至10%。大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.15微米至0.29微米之间，小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.05微米至0.10微米之间。大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的抗体的蛋白质质量高于两种胶乳颗粒总蛋白量质量的14%。试剂二中含有的D-D 二聚体单克隆抗体为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒所能吸附的D-D 二聚体单克隆抗体最大量的95%至120%。一种高灵敏、高线性 的D-D 二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
步骤一、在试剂一中加入D-D 二聚体试验品，置于37°C水浴5分钟，然后加入试剂II，
置于37°C水浴，使D-D 二聚体试验品中的D-D 二聚体与试剂二中的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 10秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度A0，3分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A, P =Al-AO ；
步骤二、通过已知的D-D 二聚体标准品吸光度ΛD-D 二聚体标准品浓度计算
D-D 二聚体试验品浓度；公式为:D-D 二聚体试验品浓度=D-D 二聚体标准品浓度X Δ A试验
品/ △ A标准。上述的D-D 二聚体试验品浓度在Omg/L至20.8mg/L。由于减少乳胶颗粒上的抗体含量可以减缓免疫反应的速率，因此可通过计算反应时间，选择最适的抗体含量。在高浓度的检测场合，使用标准曲线可以使测量范围向检测限的上限方向延伸。另外，偶连在微粒上的特异性抗体的量，可以通过使用缓冲液对含有异性抗体或者抗原亲和性片段的溶液进行稀释而自由调节。此外，应根据待检抗原的类型，以及检测目的、检测范围、抗体滴度等，在上述界定限以内可适度选择更佳合适偶连剂量。另一方面，吸附在乳胶微粒上的抗体越多，反应速率越快；乳胶微粒直径越大，反应速率也越快。偶连在大微粒上的特异性抗体越多，则在低浓度场合的检测灵敏度越高。因此，偶连在大微粒上的特异性抗体需要尽可能的多。所以，在100%吸附等温线中，最好能到最大吸附量的85% 120%，能达到959^120%更好。根据表面化学上等温吸附线的概念，在100%吸附等温线的抗体最大吸附量很容易确定下来。本发明中，免疫测定法和相应的试剂均已经建立。使用本发明可以实现低浓度场合的高灵敏度检测，也可以使高浓度场合下的检测范围得以拓宽，并提升低浓度场合的检测准确度从而得到准确的临床判定。D-D 二聚体检测试剂盒 型号:生化试剂
产品编号:9010-717 规格:
每个D-D 二聚体检测试剂盒(400测试)含有:
1、试剂I一瓶60ml
2、试剂2—瓶20ml
3、D-D二聚体标准品一瓶Iml
4、D-D二聚体标准品稀释液一瓶Iml
5、一份使用说明书 试剂配置:
本试剂盒为液体双试剂，可直接上机使用`。如果受限于分析仪比色杯容积限制，可以依比例调整试剂R1、样本/标准品及试剂R2使用量。试剂的稳定与贮存期
试剂及标准品避光保存2 8°C—年，严禁冷冻。样本处理:
1)空腹采血并尽快分离血清；
2)血清标本2 8°C保存稳定一周，_20°C冷冻保存可稳定3个月。试验参数与操作步骤:
温度37 °C
测试方法终点法
启动反应 14微升样本/标准品+150微升试剂Rl (或依比例混匀)
孵育时间5min
终止反应加50微升试剂R2 (或依比例混匀)
延迟时间IOmin
测试仪日立7100
检测介质:血清或血浆 适用于体外诊断 用途
D-D 二聚体检测试剂盒用于测定血清或血浆标本中的D-D 二聚体含量，从而用来判断有无血栓形成，同时在恶性肿瘤，产科疾患，血管病变，DIC(Disseminated IntravascularCoagulation Syndrome;弥散性血管内凝血综合症)等疾病中显示高值。因此，纤维D-二聚体是深静脉血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。反应过程:在0.150ml试剂I (30mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液)中加入14微升的D-D 二聚体，置于37°C水浴5min，加入0.050ml试剂II (鼠抗人D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒)，37°C水浴IOS后，读取吸光度AO，3分钟后，读取吸光度Al，Λ Ams =Al-AO。2)计算及结果:
计算公式:D-D 二聚体浓度(mg/L) =D-D 二聚体试验品浓度=D-D 二聚体标准品浓
度X Λ A试验品/ Λ A标准
结果:D-D 二聚体线性范围0.5mg/L至20mg/L。注意事项
1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。2.测试中D-D 二聚体正常或升高血清对照应作为阴性或阳性参照。3.若样品D-D 二聚体浓度大于20mg/L，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。4.如保存不当，试剂发现有浑浊时，应弃用。5.溶血对测定有干扰，操作过程中要尽量避免溶血。关于本专利申请的名称解释，其实高灵敏度及高线性概念在IVD (体外诊断试剂)来说，是试剂指标的专业术语，灵敏度指的是生化诊断试剂在低值上检测的一种能力，线性则指的是生化诊断试剂 在高值上检测的一种能力。如现有技术公开的D-D 二聚体检测范围为200-1200ug/L，而本专 利申请的检测范围为0-20000ug/L，在低值上相比低，高值上相比高，就说本专利申请灵敏度及线性高，优于现有技术公开的指标。
权利要求
1.一种高灵敏、高线性的D-D 二聚体检测试剂盒，其特征是:包括有试剂一、试剂二、D-D 二聚体标准品以及对照用D-D 二聚体异常血清，所述的试剂一为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述的试剂二包括有浓度为0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒与浓度为0.05 (w/v)至0.2%(w/v)的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒混合液，所述的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量为大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量的0.5%至10%。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，其特征是:所述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.15微米至0.29微米之间，所述的小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒直径在0.05微米至0.10微米之间。
3.根据权利要求2所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，其特征是:所述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的抗体的蛋白质质量高于两种胶乳颗粒总蛋白量质量的14%。
4.根据权利要求3所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，其特征是:所述的试剂二中含有的D-D 二聚体单克隆抗体为所述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒所能吸附的D-D 二聚体单克隆抗体最大量的85%至120%。
5.根据权利要求4所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，其特征是:所述的试剂二中含有的D-D 二聚体单克隆抗体为所述的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒所能吸附的D-D 二聚体单克隆抗体最大量的95%至120%。
6.根据权利要求5所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，其特征是:所述的试剂一为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。·
7.—种如权利要求1所述的高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒的使用方法，其特征是:包括以下步骤: 步骤一、在试剂一中加入D-D 二聚体试验品，置于37°C水浴5分钟，然后加入试剂二，置于37°C水浴，使D-D 二聚体试验品中的D-D 二聚体与试剂二中的大直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒以及小直径鼠抗人D-D 二聚体单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 10秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO，3分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A, P =Al-AO ； 步骤二、通过已知的D-D 二聚体标准品吸光度ΛD-D 二聚体标准品浓度计算D-D 二聚体试验品浓度；公式为:D-D 二聚体试验品浓度=D-D 二聚体标准品浓度X Δ A试验品/ △ A标准。
8.根据权利要求7所述的一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒的使用方法，其特征是:所述的D-D 二聚体试验品浓度在Omg/L至20.8mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种高灵敏、高线性的D-D二聚体检测试剂盒，试剂一为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。试剂二包括有浓度为0.01%(w/v)至0.04%(w/v)的大直径鼠抗人D-D二聚体单克隆抗体胶乳颗粒与浓度为0.05(w/v)至0.2%(w/v)的小直径鼠抗人D-D二聚体单克隆抗体胶乳颗粒混合液，小直径鼠抗人D-D二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量为大直径鼠抗人D-D二聚体单克隆抗体胶乳颗粒上的特异性抗体含量的0.5%至10%。通过优化大、小微粒的平均直径和它们在反应体系中的浓度，可以实现D-D二聚体低浓度场合的高灵敏度检测，也可以使高浓度场合下的检测范围得以拓宽。
文档编号G01N33/577GK103235130SQ20131013507
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者张闻 申请人:宁波瑞源生物科技有限公司