专利名称：高灵敏性银染的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及高灵敏性银染的方法，更具体地，本发明涉及DNA银染的改进方法，该方法包括将DNA与一种聚合物连接，并且将许多银离子与DNA-聚合物复合物结合的步骤，所述的聚合物与DNA具有高亲和性。现有技术描述通常银染是通过利用化学或光将与感兴趣靶材料连接的银离子选择性还原(见Beidler,J.L.等，分析生物化学，126:374(1982)；Goldman,D.和Merril,C.R.,电泳，3:24(1982))并检测由此产生的银颗粒的光散射色(见Merril,C.R.,美国科学院院刊，85:453(1988))。
目前使用的银染方法大致可分为以下几种碱法，其是将硝酸银的二胺复合物置于含甲醛的弱酸溶液中以还原在强碱条件下形成的该复合物；酸法，其是在甲醛溶液中还原硝酸银(见Bassam,B.J.等，应用生物化学及生物工程，42:181(1993))。
尽管银染技术最初是开发用来检测丙烯酰胺凝胶电泳的痕量蛋白(见Switzer,R.C.等，分析生物化学，98:231(1979))，经持续的改进，该方法已广泛用于检测脂多糖(见Tsai,C.和Frash,C.E.,分析生物化学，119:115(1982))和核酸(见Somerville,L.L.和Wang.K.,生物化学和生物物理研究通迅，102:54(1981))及蛋白质。
直至目前已开发了如下几种用于检测DNA的银染方法二胺复合物银染法(见Wary,W.等，分析生物化学，118:197(1981))；酸性银染法(见Heukeshoven,J.和Dernick,R.,电泳，6:103(1985)；Gottlieb.M.和Chavco,K.,分析生物化学98:231(1979))；铜-银法(见Switzer,R.C.等，分析生物化学，98:231(1979))，等等。然而已证明这些银染方法仍是令人不满意的，因为它们不能检测纳克级的DNA，并且精度和重复性不可靠。
因此，强烈需要开发一种高灵敏的检测DNA的改进方法。发明概述本发明人基于Bassam等的DNA银染方法(见Bassam B.J.等，分析生物化学，196:80(1991))，开发了一种改进的银染方法，与传统的将银离子与DNA分子直接连接的银染方法相比，本发明方法能以更高的灵敏性和重复性检测DNA。
因此本发明的一个主要目的是提供一种改进的高灵敏的DNA分子银染方法。附图的简要说明本发明的上述及其它目的和特征通过参照附图的下列描述将更加清楚。
图1(A)是一张硝酸纤维素膜的照片，其中银染是通过传统的Bassam等的方法进行。
图1(B)是一张硝酸纤维素膜的照片，其中银染是通过本发明方法进行。
图2(A)是一张硝酸纤维素膜的照片，其中银染是通过Bassam等的方法进行。
图2(B)、2(C)、2(D)和2(E)是硝酸纤维素膜的照片，其中银染是根据本发明用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸处理而进行。
图3(A)是显示用于核苷酸测序的丙烯酰胺凝胶电泳的照片，其中银染是通过Bassam等的方法进行。
图3(B)是显示用于核苷酸测序的丙烯酰胺凝胶电泳的照片，其中银染是根据本发明用0.2％(v/v)聚丙烯酸处理而进行。发明的详细描述本发明人改善了Bassam等的用于DNA检测的银染方法(见Bassam,B.J.等，分析生物化学196:80(1991))的灵敏性，该银染方法已知是一种简便的高灵敏的方法，改进是将含DNA的凝胶浸入含一种聚合物的水溶液中，并使银离子与DNA-聚合物复合物结合。据此将对于DNA分子具有高亲和性的聚合物，优选聚丙烯酸或聚乙烯亚胺，与DNA连接以诱导银离子显色。水溶液(例如水)中聚合物的浓度可根据聚合物的种类而变化，但若采用聚丙烯酸，浓度范围为0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
根据本发明的银染方法，当将DNA以5mm直径的圆形点到硝酸纤维素膜上时，甚至是纳克级的DNA也可以较高的重复性被检测出，而相比之下，Bassam等的方法检测的是微克级的DNA。
本发明的银染方法可以用于核苷酸测序和检测痕量DNA分子。
本发明经下述实施例进一步描述，这些实施例不是限制本发明范围。实施例1聚丙烯酸对银染灵敏性的影响为研究聚丙烯酸对DNA银染灵敏性的影响，将稀释至一定浓度的λDNA以5mm直径的圆形点到硝酸纤维素膜上。将膜置于温度保持在65℃的干燥箱中12小时后，令其吸收0.2％(v/v)聚丙烯酸溶液10分钟。然后根据Bassam等的方法(见Bassam等，分析生物化学，196:80(1991))进行银染通过用聚丙烯酸处理硝酸纤维素膜并令其在含1g/L硝酸银溶液和1.5ml/L甲醛的水溶液中吸收20分钟而使银离子与聚丙烯酸结合。用蒸馏水润洗上述硝酸纤维素膜5秒钟以除去未结合的银离子并置于含30g/L碳酸钠、3ml/L甲醛和2mg/L硫代硫酸钠的显色溶液中。然后当显色充分后加入7.5％乙酸终止反应。另外使用根据Bassam等的方法用硝酸银染色的DNA样品作为对照。
图1(A)示出了经Bassam等的方法用硝酸银染色的硝酸纤维素膜，该方法是目前为止所报道的最好的银染方法。图1(B)示出了用本发明方法经聚丙烯酸处理的硝酸纤维素膜。在图1(A)和图1(B)中，泳道1-9分别含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、2ng、1ng和100pgλDNA。如图1(A)和图1(B)所示，与能检测1μg DNA的传统Bassam等的方法相比，采用聚丙烯酸的本发明的方法具有更高的灵敏性，能检测1ng DNA。这些结果表明新开发的银染方法改进了DNA检测的灵敏性。实施例2聚丙烯酸浓度对银染灵敏性的影响为研究最佳聚丙烯酸浓度，以与实施例1类似的方式分别用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v),0.4％(v/v)聚丙烯酸进行银染(见图2(A)-2(E))。图2(A)显示用Bassam等的方法进行银染的硝酸纤维素膜，图2(B)-2(E)示出分别用0.05％(v/v),0.1％(v/v),0.2％(v/v)和0.4％(v/v)聚丙烯酸处理而进行银染的硝酸纤维素膜。在图2(A)-2(E)中，泳道1-9分别含1μg、500ng、250ng、125ng、60ng、40ng、12ng、1ng和100pgλDNA。
如图2(B)-2(E)所示，随着聚丙烯酸浓度的增加，灵敏性也增加，但是当浓度超过0.4％(v/v)时背景信号也增加。因此，确定了银染的最佳聚丙烯酸浓度是约0.2％(v/v)。实施例3 DNA测序凝胶的银染为了研究聚丙烯酸对DNA测序聚丙烯酰胺凝胶的银染的灵敏性的影响，分别用200ng、100ng、40ng、20ng和10ng模板DNA进行DNA测序反应，在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并用硝酸银染色。
如下所述用TopTMDNA测序试剂盒(Bioneer公司，韩国)进行DNA测序反应。首先将模板DNA(497bp PCR产物)与30pmole引物(5’-GTTTTGGCTTCCAGTTCCACC-3’)混合，用蒸馏水调至终体积为40μl。然后将10μl一份的样品加到4个独立的反应管中，每个反应管含TopTMDNA聚合酶、50mM Tris-HCl缓冲液(含2mMMgCl2,pH8.3),和G(20μM ddGTP/6μM dNTP),A(170μM ddATP/6μM dNTP),T(300μM ddTTP/6μM dNTP)和C(200μM ddCTP/6μM dNTP)，如下进行40轮PCR循环94℃5分钟(预变性)，94℃30秒(变性)，55℃30秒(退火)和72℃1分钟(延伸)。在扩增反应结束时，向每个反应管中加入4μl终止溶液，其含有98％甲酰胺，10mM EDTA,0.025％二甲苯青和0.025％溴酚蓝。95℃加热5分钟后，在6％聚丙烯酰胺凝胶上分析每一反应。
图3(A)和3(B)示出了用Bassam等的方法和用0.2％(v/v)聚丙烯酸处理后本发明方法对DNA测序聚丙烯酰胺凝胶进行银染的结果。在图3(A)和3(B)中，泳道1-5分别含有200ng、100ng、40ng、20ng和10ng的模板DNA。
如图3(A)和3(B)所示，与能检测100ng级DNA的传统Bassam等的方法相反，本发明的伴有聚丙烯酸处理的方法甚至在采用10ng模板DNA时亦能检测到DNA。因此，可以清楚地确定本发明的银染方法也能高灵敏性和高重复性地用于DNA测序。
如以上所清楚表明的，本发明提供了具有高灵敏性的用于DNA分子的高灵敏性银染的改进的方法，其甚至能检测纳克级的DNA分子。因此，本发明的银染方法可以用于检测和测序痕量DNA。序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称百奥聂尔公司等(B)街道124,Cheokbuk-Ri,Namee-Myun(C)城市Cheongwon-Kun,Choongcheongbuk-Do(D)州(E)国家韩国(F)邮编363-810(G)电话0431-60-6060(H)传真0431-60-2009(ⅱ)发明名称高灵敏性银染的方法(ⅲ)序列数1(ⅳ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release＃1.0,Version＃1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ⅱ)分子类型cDNA-mRNA(ⅶ)直接来源(B)克隆PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GTTTTGGCTT CCAGTTCCAC C
权利要求
1.一种高灵敏性银染的方法，包括如下步骤通过将含DNA的凝胶浸入含一种聚合物的水溶液中而将DNA与该聚合物连接以形成DNA-聚合物复合物，所述的聚合物与DNA具有高亲和性；以及，将银离子与DNA-聚合物复合物结合。
2.权利要求1的高灵敏性银染方法，其中聚合物是聚丙烯酸或聚乙烯亚胺。
3.权利要求1的高灵敏性银染方法，其中水溶液中采用的溶剂是水。
4.权利要求1的高灵敏性银染方法，其中聚合物在水溶液中的浓度范围是0.2％(v/v)-0.4％(v/v)。
5.权利要求1的高灵敏性银染方法，其中含DNA的凝胶是DNA测序凝胶。
6.权利要求1的高灵敏性银染方法，其中含DNA的凝胶是用于DNA检测。
全文摘要
本发明提供了一种改进的DNA银染方法,该方法包括将DNA与一种聚合物连接,并将许多银离子与DNA－聚合物复合物结合的步骤,所述的聚合物与DNA具有高亲和性。本发明的银染方法能用于检测和测序痕量DNA。
文档编号C12Q1/68GK1208441SQ97191718
公开日1999年2月17日 申请日期1997年12月30日 优先权日1996年12月31日
发明者朴翰浯, 金载钟, 俞在亨 申请人:百奥聂尔公司