专利名称：视网膜神经细胞层体外分离制备的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法。
技术背景:
世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球约有1.6亿视力障碍者，4000万法定盲人，中国是全世界盲人最多的国家，约有700万盲人，而中国每年约有45万人失明，每分钟新增一例盲人。如果我国盲人快速增加的趋势无法有效地控制，到2020年预期中国的盲人将增加到2000万，因致盲性眼病造成的伤害以及给社会造成的沉重负担将无法估量。视网膜疾病是发达国家致盲的最常见原因(超过50%)，我国每年因此类疾病失明的患者近20万(占45%)，是目前国际上尚无有效治疗手段的严重致盲性眼病。因此，为发病率高、危害重的致盲性视网膜疾病寻找治疗手段，是我国经济、社会和人民健康的重大需求。因此，大力开展视网I吴的基础与临床研究，寻找有效的治疗措施的研究迫在眉睦。实验眼科学领域，关于视网膜基础与临床研究中，对于视网膜发育及其功能、各种视网膜疾病的发病机制的研究，均需要把不同种属动物来源的眼球或人体捐献来源的眼球内的视网膜分离取出后，再进行各类相关性的细胞、分子、基因、核酸或蛋白质等水平的检测。视网膜是眼部结构的重要组成部分，是位于眼球壁内层的一层透明薄膜，由视网膜神经层和视网膜色素上皮层组成，视网膜神经层与色素上皮层之间有一腔隙，为视网膜下腔，视网膜色素上皮层与脉络膜紧密相连。目前，国内外常用的取出视网膜神经细胞层的方法是用酶消化和显微解剖分离来获得，一般需要时间为15-25分钟。酶消化的最大缺点是把视网膜神经细胞层相邻部位的视网膜色素上皮细胞或脉络膜色素细胞消化下来，造成细胞之间的污染，使视网膜神经细胞纯度下降；显微解剖分离的方法耗时较长，视网膜暴露在空气中时间越长，神经细胞的死亡数目越多，而且娴熟的显微操作技巧需要长时间的训练。由于视网膜神经细胞随着离体时间的延长死亡数量增加，一般视网膜神经细胞离体15-25分钟后，视网膜神经细胞死亡率占40-60%，可造成实验结果的严重错误。如何解决视网膜神经细胞层的快速分离，得到具有活性的视网膜神经细胞层，多年来是眼科领域科学家面对的困扰，也是我们急需解决的重点难题。发明内容:
本发明目的是提供一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，能够克服常用的视网膜神经细胞层的分离所用时间长的缺点，实现视网膜神经细胞层的快速分离。本发明提供一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，包括如下步骤:
A.提供实验动物眼球或遗体捐献眼球；
B.清洁步骤A中所述眼球；
C.将步骤B中所述眼球固定在眼球固定器上；
D.提供视网膜取出器，所提供的视网膜取出器，包括手柄，所述手柄一端设有视网膜取出勺，另一端设有刀片，所述视网膜取出勺所在平面与手柄水平轴线呈倾斜夹角，所述刀片的前端设有刀尖；E.在解剖显微镜下，用步骤D中所述视网膜取出器的刀片沿角巩膜缘或平坦部切开眼球全周的眼球壁全层，形成一个眼杯；
F.用步骤D中所述视网膜取出勺进入眼杯，把晶状体和玻璃体取出；
G.沿眼球壁的切口全周分离眼球壁的内层，再用步骤D中所述视网膜取出勺沿眼球壁的弧度进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层。优选方案:还包括将步骤G取出的视网膜神经细胞层放在预冷的离心管中，用于下一步的实验。优选方案:所述步骤B中清洁的方法包括下列步骤，先用预冷的PH7.4的磷酸盐缓冲液充分冲洗眼球，根据眼球来源，评估是否有细菌污染或感染，选择相应浓度的抗生素加入预冷的生理盐水内充分冲洗眼球，一般预防感染，使用庆大霉素则每毫升生理盐水内含有20IU，将冲洗过的眼球放在装有冰块的眼球固定器上，最后去除眼球壁表面的所有血样附属物和其他附属的组织，保留四条直肌。优选方案:所述预冷，是把装有PH7.4的磷酸盐缓冲液和生理盐水的瓶子事先埋在冰里，使PH7.4的磷酸盐缓冲液和生理盐水的温度保持在O度左右，清洁的步骤在温度处于0-4度的环境下进行。优选方案:将所述的四条直肌固定在与眼球大小相应的装有冰块的眼球固定器上。优选方案:所述步骤E中，沿眼角巩膜缘后1-4_切开眼球壁的全层，切开眼球壁的深度为0.6-1.5mm,眼球壁全层切口圆周度数为360度，去除眼前段组织，保留眼杯内的组织结构；
优选方案:切开眼球壁全层之前，预先用标记笔画出所要切开的部位，以免错位。
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优选方案:所述步骤G中的分离，用一把无齿镊轻轻夹住眼球壁呈灰白色的内层边缘，用虹膜分离器的前端沿眼球壁切口的全周给予充分的分离，分离深度在2-5_左右，一般小鼠2-2.5mm,大动物3_4mm,人眼多为5mm左右。有益效果:快速取出视网膜神经细胞层，使实验结果反应出真实性，解决了多年来困扰眼科领域科学家的问题；快速取出视网膜神经细胞层，简便了取出方法，保存了视网膜神经细胞的活性，提高了效率，关键是能正确反应实验结果，为视网膜发病机制、视网膜发育和基因调控机制的研究，创造了坚实有利的基础条件。采用本专利中研制的视网膜取出器，5秒内快速完整的从动物来源的眼球或遗体捐献的眼球中取出视网膜神经细胞层，确保视网膜神经细胞的活性，能准确的检测来源于不同种属的脊椎动物、不同发育阶段动物眼球或遗体捐献眼球的视网膜神经细胞的RNA水平、蛋白表达水平、基因表达水平等，使各种实验结果具备最真实性，为视网膜发育的研究和视网膜早期病变的研究提供了技术支撑。本专利方法与常规的酶消化和解剖分离视网膜的三种方法比较研究:定量分析出生后14天的小鼠，每一对视网膜神经细胞中光感受器细胞内Rho和Mop两种视蛋白，节细胞内Thyl蛋白含量的检测，结果显示:本专利方法获得的视网膜神经细胞中，三种蛋白的表达水平分别为90%、80%、75% ;酶消化法分别为35%、31%、26% ;解剖分离法为36%、30%、25% ；三种蛋白的总体水平比现有的方法提高2倍以上；每一对视网膜神经细胞中Rho、Mop和Thyl三种蛋白水平定性分析，结果显示，本专利方法获得的视网膜神经细胞内三种蛋白的水平明显高于另外两种方法；对每只小鼠一对视网膜的总RNA水平定量显示，本专利方法为98%，酶消化法为40%，显微解剖法为35%。附图及
图1.本专利与常规的酶消化、解剖分离三种方法获得视网膜神经层，三种视网膜神经细胞内蛋白水平定量分析比较 图2.本专利与常规的酶消化、解剖分离三种方法中Rho、Mop和Thyl三种蛋白水平定性分析比较 图3.本专利与常规的酶消化、解剖分离三种方法中视网膜神经细胞总RNA水平定量分析比较图。
具体实施方式
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实施例1:对实验动物小鼠眼球进行的一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，采取的步骤如下:
(I)清洁眼球:首 先用预冷的磷酸盐缓冲液(PH7.4)充分冲洗小鼠来源的眼球，再用每毫升含有20IU的庆大霉素液的预冷生理盐水充分冲洗眼球；眼球放在装有冰块的眼球固定器上，去除眼球表面的所有血样附着物和其他附属组织，保留四条直肌。在该步骤中注意事项如下:因为来自动物(或遗体捐献的眼球)眼球表面有许多血样附着物和其他附属的组织，为了防止组织细胞之间的污染，小心用弯剪刀仔细剪除眼球表面的组织和血样附着物，保留四条直肌。因为眼球壁较薄，小动物眼球壁大约厚度0.6-0.8_，大动物眼球壁厚度大约0.8-1.2mm,人的眼球壁厚度大约1.0-1.5mm,切记不要把眼球壁剪破。该步骤要求动作准确迅速，确保在0°-4°低温条件下操作，以保证视网膜神经层各种细胞的活性。每一个眼球，需要更换一次眼球固定器的一次性保洁膜，以防污染。(2)固定眼球:将清洁处理过的小鼠眼球的四条直肌固定在与眼球大小相应的装有冰块的眼球固定器上。注意事项:为了防止污染，每一只眼球在冲洗后，更换一张眼球固定器的一次性保洁膜。在固定眼球时，千万注意不要强行牵拉四条直肌，因为直肌巩膜附着点的巩膜厚度大约为0.2-0.3mm,以免造成眼球破裂。选择大小合适的眼球固定器，以眼球的直径大小为依据来选择。如果眼球固定器大小不适宜，切开眼球壁的时候，严重者可造成眼内容物的脱出，也可带来操作的不便。(3)切开眼球壁:在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的刀片在小鼠眼球上，沿角巩膜缘后Imm切开全层的眼球壁360度。注意事项:刀片必须确保其刀刃的锋利，以确保手术时避免对眼球施加不必要的压力，避免重复使用，以防止污染；根据不同眼球壁的厚度，掌握好切开球壁的深度，一般成年小动物眼球壁厚度大约为0.6-0.8_。该步骤必须在显微镜下仔细操作，不要切开的过浅或过深，二者均可造成眼球组织细胞的损伤。小动物眼球壁切开是沿着角膜缘外Imm切开，预先用标记笔画出所要切开的部位，以免错位。(4)清除眼内容物:去除眼前段，用视网膜取出器一端的视网膜取出勺，沿着眼球壁的切口进入眼内，把晶状体和玻璃体轻轻托出。注意事项:操作时不要对眼杯施加任何压力，小动物用视网膜取出勺从眼球壁的切口沿球壁的弧形进入，轻轻将晶状体和玻璃体一起托出；视网膜取出勺进入眼内操作时，动作一定要轻柔，切记不可使用其搅动眼内物，以免牵拉视网膜，造成人为的视网膜脱离。(5)取出视网膜神经层:用一把无齿镊轻轻夹住眼球壁呈灰白色的内层边缘，用虹膜分离器的前端沿眼球壁切口的全周给予充分的分离，分离深度在2-2.5mm左右，更换取出勺沿着球壁已分离的内层组织下进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层。注意事项:由于眼球离体后，离体时间越长，视网膜神经层越容易与视网膜色素上皮层脱离，该步骤操作时动作一定要轻柔，沿着视网膜下腔的自然弧度进入，将全层视网膜神经层取出。根据眼球的大小，选择相适应直径的视网膜取出勺。调整视网膜取出勺一定恰当的角度后进入视网膜下腔，切记操作动作不要粗暴，这一步最容易造成视网膜取出不完全，或视网膜呈碎片状。(6)取出视网膜神经层后的处理:取出视网膜神经层后，立即放在预冷的离心管中，进行下一步的实验。为了证实本专利方法的优越性和可靠性，利用本专利方法视网膜神经细胞层分离制备与常规的酶消化和解剖分离方法，获取出生后14天小鼠的视网膜神经细胞层，对其中视网膜神经细胞所含的Rho、Mop和Thyl三种蛋白水平进行定量和定性分析；并对三种方法获得的视网膜进行RNA提取后，进行视网膜神经细胞总RNA水平定量检测。图1.采用本专利方法提取视网膜神经细胞层与常规的酶消化和解剖分离的方法进行比较研究:取出生后14天同窝小鼠的视网膜神经细胞,进行Rho、Mop和Thyl三种蛋白水平定量分析，该方法获取的视网膜神经细胞中三种蛋白的含量明显高于其它两种方法的2倍。图2.采用本方法提取视网膜神经细胞层与常规的酶消化和解剖分离的方法进行比较研究:取出生后14天同窝小鼠的视网膜神经细胞，进行Rho、Mop和Thyl三种视网膜神经层光感受器细胞和节细胞内主要蛋白水平定性分析，该方法获取的视网膜神经细胞中三种蛋白的含量明显高于其它两种方法；β-Actin在视网膜内普遍存在的蛋白作为阳性对照组，三种视网膜神经层取出方法对比该蛋白无明显差异。该实验直观的显示，快速取出视网膜神经层细胞，可正确的反应视网膜神经层内各种相关蛋白的含量。图3.视网膜神经细胞总RNA水平定量检测:每只小鼠一对视网膜的总RNA水平定量显示，本专利方法为98% ，酶消化法为40%，显微解剖法为35%。实施例2:是对人遗体捐献眼球进行的一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，与实施例1相同的步骤不再重述，不同之处在于:切开眼球壁步骤中，在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的刀片在人体捐献眼球上沿角巩膜缘后4mm切开全层的眼球壁360度。清除眼内容物步骤中，先用视网膜取出勺沿眼球壁切口水平进入将晶状体托出，然后沿球壁的弧形进入将玻璃体轻轻托出。用虹膜恢复器分离眼球切口全周的内层时，一般分离深度为5mm左右。
权利要求
1.一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，包括如下步骤: A.提供实验动物眼球或遗体捐献眼球； B.清洁步骤A中所述眼球； C.将步骤B中所述眼球固定在眼球固定器上； D.提供视网膜取出器，所提供的视网膜取出器，包括手柄，所述手柄一端设有视网膜取出勺，另一端设有刀片，所述视网膜取出勺所在平面与手柄水平轴线呈倾斜夹角，所述刀片的前端设有刀尖； E.在解剖显微镜下，用步骤D中所述视网膜取出器的刀片沿角巩膜缘或平坦部切开眼球全周的眼球壁全层，形成一个眼杯； F.用步骤D中所述视网膜取出勺进入眼杯，把晶状体和玻璃体取出； G.沿眼球壁的切口全周分离眼球壁的内层，再用步骤D中所述视网膜取出勺沿眼球壁的弧度进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层。
2.根据权利要求1所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:还包括将步骤G取出的视网膜神经细胞层放在预冷的离心管中。
3.根据权利要求1所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:所述步骤B中离体眼球清洁包括下列步骤，先用预冷的PH7.4的磷酸盐缓冲液充分冲洗眼球，再根据眼球来源，评估是否有细菌污染或感染，选择相应浓度的抗生素加入预冷的生理盐水内冲洗眼球，将冲洗过的眼球放在装有冰块的眼球固定器上，最后去除眼球表面的所有血样附着物和其他附属的组织，保留四条直肌。
4.根据权利要求3所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:所述预冷，是把装有PH7.4的磷酸盐缓冲液和生理盐水的瓶子事先埋在冰里，使PH7.4的磷酸盐缓冲液和生理盐水的温度保持在O度左右，清洁的步骤在温度处于0-4度的环境下进行。
5.根据权利要求3所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:将所述的四条直肌固定在与眼球大小相应的装有冰块的眼球固定器上。
6.根据权利要求1所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:所述步骤E中，沿眼角巩膜缘后1-4_切开眼球壁全层，切开眼球壁的深度为0.6-1.5mm,眼球壁全层切口圆周度数为360度。
7.根据权利要求6所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:切开眼球壁全层之前，预先用标记笔画出所要切开的部位，以免错位。
8.根据权利要求1所述的视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，其特征在于:所述步骤G中的分离，用一把无齿镊夹住眼球壁呈灰白色的内层边缘，用虹膜恢复器的前端沿眼球壁切口的全周给予分离，分离深度为2-5mm。
全文摘要
本发明提供一种视网膜神经细胞层体外分离制备的方法，包括如下步骤提供实验动物眼球或遗体捐献眼球；清洁眼球；固定眼球；提供视网膜取出器；用视网膜取出器的刀片沿角巩膜缘或平坦部切开眼球全周的眼球壁全层，形成一个眼杯；视网膜取出勺进入眼杯，把晶状体和玻璃体取出；沿眼球壁的切口全周分离眼球壁的内层边缘，再用视网膜取出勺沿眼球壁的弧度进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层。本发明能够实现快速取出视网膜神经细胞层，保存了视网膜神经细胞的活性，提高了效率，能正确反应实验结果。
文档编号G01N1/04GK103234774SQ201310162180
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者彭广华 申请人:郑州大学第一附属医院