一种检测与补骨脂肝毒性有关的代谢产物的方法及其用途
【专利摘要】本发明提供一种检测与补骨脂肝毒性有关的代谢产物的方法。所述代谢产物为补骨脂素和/或异补骨脂素的二氢二醇代谢产物;所述方法包括补骨脂素和/或异补骨脂素的二氢二醇代谢产物的获取，利用串联质谱，以多反应监测法检测所述代谢产物。本发明还提供所述方法在监测补骨脂素、异补骨脂素、含有补骨脂素和/或异补骨脂素的组合物致肝毒性中的应用，为安全用药和药物毒性的早期预警提供依据。
【专利说明】一种检测与补骨脂肝毒性有关的代谢产物的方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物代谢和毒性研究领域，具体涉及补骨脂产生肝毒性的代谢产物的 检测方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 肝脏作为最重要的药物代谢器官，同时也是最主要的药物毒性靶器官。在药物使 用过程中，因药物本身或其代谢产物、或由于特殊体质对药物的超敏感性所导致的肝脏损 伤称为药物性肝损伤（Drug-induced Liver Injury, DILI),据世界卫生组织统计，DILI已 上升为全球死亡原因的第五位。越来越多的报道显示许多常用中药，甚至一些传统补益药 具有肝毒性，如补骨脂、吴茱萸、何首乌等。中药所致肝损伤最初多以临床病例发现为主，其 肝毒性发现晚，一旦发现，通常已经给患者造成不可逆转的损伤。但是，迄今仍然缺乏早期 发现药物的肝毒性的技术及评价指标。
[0003] 研究发现，当药物在肝脏经CYP450酶代谢产生亲电性活性代谢产物（Reactive Metabolites，RMs)后，由于其电子密度低，亲核性强，能与肝细胞内大分子(如CYP450酶)、 细胞器膜(如线粒体膜）等相结合，造成细胞应激、细胞器膜功能损害，最终导致肝毒性发 生。Lammert et al.对207种常用口服药物的统计发现，能生成RMs的药物中约62-69%具 有肝毒性。可见活性代谢产物在DILI发生过程中起着重要作用，监测RMs的产生对药物肝 毒性的早期发现具有重要意义。
[0004] 补骨脂为豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，主要有温肾助阳，纳气，止泻之功效。 补骨脂本身以及含有补骨脂的中成药如壮骨关节丸均有肝毒性报道。谭沛等研究显示 2. lg/kg补骨脂能使得鼠肝重肝系数显著升高，同时大鼠血清中AST、ALT、ALP的值与对照 组比较亦有升高趋势（《补骨脂灌胃30天对大鼠肝毒性的实验研究》;谭沛，赵超，周昆，屈彩 芹，胡利民；《新疆中医药》，2010年第28卷第2期：11-13)。而在国家食品药品监督管理局 公布的第16期药品不良反应信息通报中，也警惕了壮骨关节丸引起的肝损害。
[0005] 在已经分离、鉴定的补骨脂化学成分中，由于补骨脂素和异补骨脂素(结构式分别 如I和II所示）具有呋喃环这一活性官能团，有可能在体内经肝脏代谢后产生活性代谢产 物（RMs)。
[0006]
【权利要求】
1. 一种检测与补骨脂肝毒性有关的代谢产物的方法，其特征在于：所述代谢产物为补 骨脂素和/或异补骨脂素的二氢二醇代谢产物；所述方法包括补骨脂素和/或异补骨脂素 的二氢二醇代谢产物的获取，利用串联质谱检测所述代谢产物；具体包括如下步骤： 1) 血浆样品中加入甲醇和乙腈组成的沉淀剂，所述血浆样品和沉淀剂的体积比为 1:2-4,离心，得到上清液；或 将补骨脂素和/异补骨脂素，肝微粒体，还原型辅酶II混合，得到反应溶液；在所述反 应溶液中，使各物质的浓度满足以下条件： 补骨脂素和/或异补骨脂素为20-50 μ M, 肝微粒体为l-2mg/ml， 补骨脂素和/或异补骨脂素：还原型辅酶11=50:1 ; 37°C孵育60-120min后加入终止液终止反应，涡旋，离心，得到上清液； 2) 取步骤1得到的上清液，氮气吹干，甲醇-水溶液复溶； 3) 步骤2得到复溶溶液离心，取上清液注射入液相色谱/串联质谱仪，以多反应监测法 进行监测，[M+H]+母离子峰m/z221，碎片离子峰出现m/z203和m/zl75的，即是所述的代谢 产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2中，液相色谱条件为： 色谱柱：C18柱，规格2. 1_X 100mm，粒径1. 7 μ m ; 流动相：A液0. 1%CH3C00H和B液100%ACN，梯度洗脱：0-12min，洗脱溶剂中B液的体积 百分比由5%增加到80%，余量为A液；12-15min，洗脱溶剂中B液的体积百分比为5%，余量 为A液。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2中，质谱条件为： 全扫描质谱条件：离子模式：ES+;毛细管电压：3. 20kV;锥孔电压：20.0V;源温度： ll〇°C ;去溶剂温度：350°C ;碰撞能量：2 ;蠕动泵流速：40μ L/min ;碰撞气流速：0. 17mL/ Min; [M+H]+m/z221的子离子扫描质谱条件：离子模式：ES+ ;毛细管电压：3. 20kV ;锥孔电 压：20. 0V ;源温度：11(TC ;去溶剂温度：350°C ;碰撞能量：20 ;蠕动泵流速：40μ L/min ;碰 撞气流速：〇. 17mL/Min; [M+H]+m/z221的多反应监测质谱条件：离子模式：ES+ ;监测离子对：221. 00>174. 90 ; 锥孔电压：30. 0 ;碰撞能量：20. 0。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，所述反应溶 液中，补骨脂素和/或异补骨脂素的浓度为12. 5 μ M。
5. 根据权利要求1至4中任一项2所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，终止液选 自冰甲醇或冰乙腈；终止液的体积为所述反应溶液的两倍。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，所述反应溶 液的涡旋时间为l〇s。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，所述血浆样 品或所述反应溶液的离心条件为14000r/min，10-15min。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3中，复溶用溶液 中甲醇和水体积比为1:1。
9. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3中，离心条件为 14000r/min,5min〇
10. 权利要求1至9中任一项所述的方法在检测药物与肝毒性有关的代谢产物中的应 用，所述药物含有补骨脂、补骨脂素或异补骨脂素中的一种或几种。
【文档编号】G01N30/06GK104251890SQ201310264955
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2013年6月27日
【发明者】何新, 俸珊, 马叶涛, 颜晶晶, 翟毅然 申请人:天津中医药大学