一种用于检测氧化应激标志物d-ROMs的体外检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过检测血液中总的活性氧代谢物(ROMs)含量从而评价人体内整体氧化应激水平的应用方法，该方法包括：将含有ROMs的血清加入酸缓冲液配制的芳香胺(DMPD)，二价铁及三价铁在酸缓冲液中从血清蛋白中释放；ROMs的主要成分过氧化氢物(ROOH)与二价铁及三价铁反应，生成烷氧自由基(RO*)和过氧化自由基(ROO*)；自由基氧化DMPD，生成粉红色产物；产物用自动生化仪505nm波长读数，读取OD值与ROMs浓度呈比例。本发明检测ROMs的方法为一步法，测定仪器为临床生化诊断最基本的和必备的生化分析仪，具有操作简便、精密度高、重复性好等优点。针对ROMs的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，具有相当重要的临床意义。
【专利说明】一种用于检测氧化应激标志物d-ROMs的体外检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过检测血液中总的活性氧代谢产物(ROMs)含量从而评价人体内整体氧化应激水平。ROMs的主要成分为过氧化氢物(ROOH)，可作为体内氧化应激的标志物。该方法可用于测定氧化应激相关疾病:心血管疾病、神经变性疾病、代谢综合征、肿瘤等；暴露于危险因素的评价:吸烟、酗酒、不适当的运动、饮食不平衡；以及评估增加氧化水平的治疗:口服避孕药、放化疗、血液透析、干预旁路。
【背景技术】
[0002]氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, R0S)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统的动态平衡失衡，从而导致DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，最终引起组织损伤。
[0003]自由基具有不成对电子的原子或基团。自由基非常活泼，很容易与其他物质发生化学反应，生成活性氧代谢物(ROMs)。活性氧代谢物与氧自由基相比在血液中更稳定，因此可以在血液中被检测到，其评价氧化应激水平也更为准确。ROMs的主要成分为过氧化氢物(R00H)，因此，d-R0Ms检测主要是检测血液中的过氧化氢物，而不是直接检测人体的自由基数量。血液中d-R0Ms的正常范围为250-300UNIT CARR(U CARR);数值大于300U CARR表明机体处于氧化应激状态(1U CARR等于0.8mg/L H2O2)。
[0004]与全球体外诊断产品市场相对成熟不同，我国体外诊断市场仍处于发展的初级阶段。我国的诊断试剂市场规模仅为全球市场的1/14，人均消费量约为全球人均消费量的17%左右，即仍处于产品研发与生产的投入初期。因此，我国体外诊断市场的生存、发展和壮大依然是一个漫长的过程。随着生物技术的快速发展，我国体外诊断产业将面临更大的机遇和挑战。并且，我国人口众多，市场庞大，其中蕴含的经济利益和社会效益更是无法估量。研制价廉物美、操作简便的体外诊断方法和诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。
[0005]目前国际上针对ROMs的氧化应激分析评估系统通常包括检测试剂、参考品(校准品、质控品)、分光光度仪整套系统，虽然在检测重复性、准确性上有很大优势，但相对操作过程复杂、经济花费较大。国内对于ROMs的检测，生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，因此市场上缺乏公众认可的检测ROMs的国产产品。本发明所涉及检测ROMs的方法为一步法，测定仪器为临床生化诊断最基本的和必备的检验设备自动生化分析仪，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好等优点。针对ROMs的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，因此具有相当重要的临床意义。
【发明内容】
[0006]针对现有氧化应激分析评估系统存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、成功率高和稳定性好的检测ROMs的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明涉及一种检测ROMs的方法，该方法包括:
[0008]1)全血离心,分离血清和血细胞；
[0009]2)取适量步骤1)中血清，加入Tris酸缓冲液配制的适宜浓度的芳香胺(DMPD，N，
N- 二甲基对苯二胺二盐酸盐)溶液；
[0010]3)血清中二价铁及三价铁在酸缓冲液中从血清蛋白中释放，过氧化氢物(R00H)与二价铁及三价铁反应，生成烷氧自由基(R0*)和过氧化自由基(ROCf)；
[0011]4)步骤3)中生成的烷氧自由基(R(f)和过氧化自由基(ROCf)将芳香胺氧化，生成粉红色产物；
[0012]5)粉红色产物用波长为505nm的自动生化分析仪读数，颜色强度与读取0D值(ROMs浓度)呈比例；
[0013]6)在以上步骤进行的同时，步骤1)中血清以不同浓度的H202代替，余步骤不变，以不同浓度H202反应产物读取的0D值做标准曲线，由此计算出血清中过氧化氢物(R00H)相当于H202的浓度。
[0014]其中，步骤3)和步骤4)中化学反应的原理图如下所示:
[0015]1A) R-00H+Fe2+ — R-0*+Fe3++0F
[0016]IB) R-0*+A-NH2 — R-0> [A_NH2*]+
[0017]2A) R-00H+Fe3+ — R_00*+Fe2++H+
[0018]2B) R-00*+A-NH2 — R-00> [A_NH2*]+
[0019]本发明的有益效果在于:本发明检测ROMs的方法操作非常简单，检测成本低，结果准确可靠，而且具有高重复性，可快速准确检测血液中总的活性氧代谢物(ROMs)含量从而评价人体内整体氧化应激水平。为临床上评估疾病的危险因素，确定疾病的治疗方案和判断疾病的预后提供可靠的理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1血清反应产物0D值读取示意图，单位时间内的0D值变化与浓度呈正比。
[0021]图2为配制的DMPD试剂的稳定性观察。在DMPD试剂配制完成的4天时间内，每天重复检测同一份血清样本，0D值读值稳定。
[0022]图3为本发明检测ROMs的方法与国际上认可度较高的日本WISMERLL公司产品的准确性比较。结果显示两组测定结果具有良好的两两相关性，相关系数大于0.99。
【具体实施方式】
[0023]下面参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明测定结果的计算方法，本测定系统的稳定性以及与国际上认可度较高的日本WISMERLL公司产品的准确性比较。充分说明了本发明操作简单，检测成本低，结果准确可靠，并且具有高重复性的特点。
[0024]本发明的原理主要在于:将含有ROMs的血清加入酸缓冲液配制的芳香胺(DMPD，N，N-二甲基对苯二胺二盐酸盐)；二价铁及三价铁在酸缓冲液中从血清蛋白中释放；ROMs的主要成分过氧化氢物(R00H)与二价铁及三价铁反应，生成烷氧自由基(R(f)和过氧化自由基(R0(f)；自由基氧化芳香胺，生成粉红色产物；产物用自动生化仪505nm波长读数，读取OD值与ROMs浓度呈比例。
[0025]该方法具体为:
[0026]1.全血1500g离心15min，吸取25 μ L上层血清。
[0027]2.以浓度为10mM的Tris-Cl (PH值为2)溶解DMPD粉末，配制成浓度为5mM的溶液。
[0028]3.取100 μ L步骤2)中DMPD溶液，与步骤I)中血清混合；同时分别配制浓度为0.625mM、l.25mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、40mM 的 H2O2 溶液，各取 25 μ L 与步骤 2)中 DMPD 溶液混合。
[0029]4.步骤3)中混合产物立即用奥林巴斯AU5400生化仪的505nm波长读数，颜色强度与OD值(ROMs浓度)呈比例。
[0030]在图1中，示混合产物加入自动生化仪后，10分钟时间内读取34次OD值，血清组的第33次OD值与第17次OD值之差为Λ OD0,各H2O2组的第33次OD值与第17次OD值之差分别为 AOD^ AOD2, A0D3、AOD4, AOD5, AOD6, AOD7,以 H2O2 溶液浓度为横坐标，AOD1,Δ OD2, Δ OD3> Δ OD4, Δ OD5, Δ OD6, Δ OD7为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线和Λ OD0值即求出血清中活性氧代谢产物等价于H2O2的浓度。
[0031]在图2中，示本测定系统的稳定性观察。在DMI3D试剂配制完成的4天时间内，每天重复3次检测同一份血清样本，四组OD值读数没有显著性差异(P > 0.05)。说明本测定系统稳定性良好。
[0032]在图3中，对本发明检测ROMs的方法与国际上认可度较高的日本WISMERLL公司测定方法进行准确性评估。分别以两种方法对含不同浓度ROMs的血清测定后，做相关分析发现，两种测定体系间具良好的两两相关性，相关系数大于0.99。说明本检测系统准确性良好。
[0033]上述作为氧化应激标志物的d-ROMs的体外检测法，可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。
[0034]除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关【技术领域】中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。
[0035]除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本【技术领域】通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。
【权利要求】
1.一种操作简单、成本低廉、成功率高的检测ROMs的方法，其特征在于，该方法包括: 1)全血离心，分离血清和血细胞； 2)取适量步骤I)中血清，加入Tris酸缓冲液配制的适宜浓度的芳香胺(DMPD，N，N-二甲基对苯二胺二盐酸盐)溶液； 3)血清中二价铁及三价铁在酸缓冲液中从血清蛋白中释放，过氧化氢物(ROOH)与二价铁及三价铁反应，生成烷氧自由基(R0*)和过氧化自由基(ROCf)； 4)步骤3)中生成的烷氧自由基(RCf)和过氧化自由基(ROCf)将芳香胺氧化，生成粉红色产物； 5)粉红色产物用波长为505nm的自动生化分析仪读数，颜色强度与读取OD值(ROMs浓度)呈比例。 6)在以上步骤进行的同时，步骤I)中血清以不同浓度的H2O2代替，余步骤不变，以不同浓度H2O2反应产物读取的OD值做标准曲线，由此计算出血清中过氧化氢物(ROOH)相当于H2O2的浓度。
2.如权利要求1所述检测ROMs的方法，其特征在于，步骤2)中所述酸缓冲液为:浓度为 10mM 的 Tris-Cl (PH 值为 2)。
3.如权利要求1所述检测ROMs的方法，其特征在于，步骤2)中所述芳香胺为:100mM的Tris-Cl酸缓冲液配制的浓度为5mM的DMPD。
4.如权利要求1所述检测ROMs的方法，其特征在于，步骤6)中所用已知浓度的H2O2代替血清，测定的OD值可做标准曲线，用以计算血清中过氧化氢物(R00H)相当于H2O2的浓度。
5.一种如权利要求1所述通过检测血液中总的活性氧代谢物(ROMs)含量从而评价人体内整体氧化应激水平的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，针对ROMs的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，具有相当重要的临床意义。
【文档编号】G01N21/78GK104251858SQ201310264756
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】王辰, 郭健, 杨汀, 王萌, 肖飞, 邹丽辉, 钟琳晔 申请人:王辰