抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体fma1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体FMA1及其应用。首次找到一种特异性抗人髓系相关分化标志蛋白(hMYADM)的单克隆抗体。所述的单克隆抗体可良好地识别hMYADM抗原，不与其它蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。CCTCC NO：C2013322013.04.03CCTCC NO：C2013332013.04.03
【专利说明】抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体FMA1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及抗人髓系相关分化标志（hMYADM)蛋白的单克隆 抗体的制备及应用。
【背景技术】
[0002] 造血谱系的发生是一个非常复杂的生物学过程，其特征在于基因表达的特征性改 变，导致的阶段特异性的表型和功能变化。造血干细胞分化异常可能导致白血病和其他血 液系统疾病的发生。在过去的几十年里，对于参与造血发生的细胞因子、生长因子及其受体 和转录因子家族的鉴定已经取得了很大的进展。造血发生的过程可能涉及到的几个关键变 量，包括转录因子作用，染色质可接近性、生长因子受体，以及发生这些遗传改变的细胞整 体环境。然而，对多能祖细胞系的选择的分子机制仍不清楚。对参与造血干细胞谱系发生的 基因进行研究将为造血分化机制提供新的观点，并有助于阐明许多造血障碍的发生原因。 多能造血干细胞具有选择性表达多个淋巴系或髓系细胞分化的谱系特异性程序的能力。目 前认为，特定谱系造血细胞的发生涉及到一些种系特异性基因的改变。而一个或几个调节 性或"关键"基因的活化即可完全启动并调控谱系特异性基因程序。因此研究造血发生中 的特征性分子改变对深入阐明造血细胞的分化发育、体内迁移、生物学作用及其分子机理 具有重大意义，可为认识疾病（如白血病）发生发展的机制提供新的角度，也可能为疾病的 防治提供新的思路和手段。
[0003] 髓系相关分化标记（MYADM)是近年来鉴定得到的一种表达在造血干细胞分化的 特定阶段的标志物蛋白，属于MAL蛋白家族成员。在MYADM蛋白序列中特征性地存在8个 跨膜区，形成2个MARVEL串联排列，其优势分布于细胞膜上。小鼠 MYADM (mMYADM)在原始 造血祖细胞向特定细胞诱导分化时表达上调，在向B细胞祖细胞分化的条件下表达下调。 反义寡核苷酸抑制其表达可导致小鼠骨髓粒细胞集落形成的大幅减少，提示mMYADM在髓 系细胞的分化过程中发挥着重要的生理作用（Pettersson，M?等，J Leukoc Biol. 2000， 67:423-431 ;Dannaeus，K?等，Mol Biol R印? 2005, 32:149-157)。人源 MYADM(hMYADM)选 择性表达在外周血来源的髓系细胞以及髓系白血病细胞，在PMA诱导髓系白血病细胞分化 以及骨髓⑶34+细胞向粒、单核细胞分化中，hMYADM的表达明显上调（Wang，Q.等，Life Sci. 2007, 80:420-429.)。在全反式维甲酸诱导前髓系白血病Nb4细胞分化时表达显著升 高（Cui，W.等，Mol Biol R印.2001,28:123-138)。在人转移性黑色素瘤临床标本中也检测 到 MYADM 表达的改变（de Wit，NJ.等，Br J Cancer. 2005,92:2249-2261)。这些结果较充 分地揭该分子是与髓系分化发育密切相关的细胞表面标志，有可能在白血病的发病机制 以及诱导分化中起着重要作用。
[0004] MYADM 分子可能有望获得新的 CD 统一命名。CD (cluster of differentiation，白 细胞分化抗原）是白细胞在正常或刺激后分化和成熟过程中的某个阶段出现或消失的细 胞表面标志，不同的细胞类群分化的特异性表达标志构成不同的生物学功能和临床意义， 许多CD分子都是有功能的分子，包括受体、酶、粘附分子、信号转导分子、离子通道、调节分 子等，在造血细胞的分化、发育、激活、免疫应答以及疾病的发生中发挥着极其重要的作用， CD分子还用于白血病的免疫学分型，而且可能作为新药设计的靶点。如CD33已经成为诊 断急性髓系白血病（AML)，尤其是未分化型AML的重要标志，同时可用于区分AML与淋巴系 白血病。抗⑶33单抗已应用于治疗AML的临床I期研究，可选择性去除恶性造血，回复正 常造血过程（Caligaris-Cappio, F?等，Lancet. 2001，358:49-55)。每一个新 CD 抗体的出 现，意味着新抗原相应编码基因及功能的阐明。随着对细胞分化抗原分子研究的不断深入， 可阐明一些造血细胞分化发育过程的理论问题，并将对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判 定等方面的研究起到极大的推动作用。
[0005] 制备hMYADM的单克隆抗体，对进一步深入研究其功能具有重要意义，可应用于不 同细胞和组织中该分子的检测，有可能揭示该新分子在临床疾病防治中的可能应用前景， 丰富造血细胞分化发育过程的基础理论研究，并对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等 方面的研究起到启发作用。
[0006] 然而，本领域目前还缺乏特异性的、可良好识别hMYADM的单克隆抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽来源于人髓系相关分化标志 蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 在本发明的第一方面，提供所述的多肽的用途，用于作为抗原，制备特异性检测人 髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体。
[0010] 在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO: C201332 (FMAl)的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
[0011] 在一个优选例中，所述单克隆抗体由所述的多肽免疫动物获得。
[0012] 在本发明的第一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人髓 系相关分化标志蛋白的检测试剂盒。
[0013] 在一个优选例中，所述的检测人髓系相关分化标志蛋白包括：（1)定性检测人髓 系相关分化标志蛋白；或（2)定量检测人髓系相关分化标志蛋白；
[0014] 较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定人髓系 相关分化标志蛋白的存在情况；
[0015] 较佳地，所述的定量检测包括：通过流式细胞方法对人髓系相关分化标志蛋白表 达的强度或阳性细胞率进行定量，或通过双抗体夹心ELISA法对人髓系相关分化标志蛋白 表达的强度进行定量。
[0016] 在本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的 保藏号是 CCTCC N0:C201332。
[0017] 在本发明的第一方面，提供一种检测试剂盒，其中包括所述的单克隆抗体或所述 的杂交瘤细胞株。
[0018] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：另一单克隆抗体，该另一单克隆抗体是 特异性抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO:C201333(DS6) 的杂交瘤细胞株产生。
[0019] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：固相载体（如多孔板）；较佳地，保藏号 为CCTCC NO:C201333的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体包被于所述的固相载体；较佳的， 所述的单克隆抗体还连接有标记物。
[0020] 在另一优选例中，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧 化酶、3 -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、荧光素或葡萄糖淀粉酶。
[0021] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
[0022] 与标记物相对应的底物；
[0023] 显色剂；
[0024] 洗涤液；和/或
[0025] 终止液。
[0026] 在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于特异性检测人髓系相关分 化标志蛋白。
[0027] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1A、HL_60细胞（前髓细胞白血病细胞）的hMYADM单克隆抗体（DS6、EF1、PCD1) 免疫荧光实验结果，以同型抗体正常小鼠 IgG(购自BD公司）作为对照。
[0029] 图1B、HL_60细胞（前髓细胞白血病细胞）的hMYADM单克隆抗体（FMA1、LK1、FB6) 免疫荧光实验结果，以同型抗体正常小鼠 IgG(购自BD公司）作为对照。
[0030] 图2A、应用DS6、EF1、P⑶1作为抗体，流式细胞仪定量检测白血病细胞U937表面 hMYADM的表达，以同型抗体正常小鼠 IgG作为对照。
[0031] 图2B、应用FMA1、LK1、FB6作为抗体，流式细胞仪定量检测白血病细胞U937表面 hMYADM的表达，以同型抗体正常小鼠 IgG作为对照。
[0032] 图3、生物素标记的单抗的鉴定。
[0033] 图4、显示可溶性hMYADM分子检测试剂盒标准工作曲线。以DS6作为包被抗体， FMl作为检测抗体，然后加入不同浓度的标准品rhMYAD/Fc重组蛋白作为检测抗原，绘制 标准工作曲线。X轴代表抗体原浓度，Y轴代表光密度0D450值。
【具体实施方式】
[0034] 本发明人经过广泛的研究，首次找到一种特异性抗人髓系相关分化标志蛋白 (hMYADM)的单克隆抗体。所述的单克隆抗体可良好地识别hMYADM抗原，不与其它蛋白发生 交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。
[0035] 本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位（抗原决定簇），因此， 针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性（如特异性等）均可 能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才 能找到适合于特异性结合的单抗。本发明中，由于hMYADM氨基酸序列长，抗原决定簇很多 被包在蛋白结构的内部，因此难以找到一种特异性高的单克隆抗体。一些抗hMYADM单克隆 抗体当用于实际检测时，遭遇到与天然hMYADM蛋白结合特性差的问题，这可能是由于待测 样品中hMYADM蛋白的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。
[0036] 针对上述技术难题，本发明人选取了多种hMYADM蛋白的片段来免疫动物，获取动 物的脾细胞用于制备杂交瘤细胞株，从而找到合适的用于免疫的片段。
[0037] 作为本发明的优选方式，所述的hMYADM蛋白片段是来自于hMYADM氨基酸序列第 187-204位上的一段18肽氨基酸序列IFAFISDPNLYQHQPALE (SEQ ID NO: 2)，具有良好的免 疫原性，进一步经过单克隆筛选和验证，从而获得本发明的FMl单克隆抗体。
[0038] 作为本发明的另一优选方式，所述的hMYADM蛋白片段是来自于hMYADM氨基酸序 列第127-144位上的一段18肽氨基酸序列FLSHGRSRDHAIAATFFS(SEQ ID N0:1)，具有良好 的免疫原性，进一步经过单克隆筛选和验证，从而获得本发明的DS6单克隆抗体。
[0039] 所述单克隆抗体对于hMYADM蛋白具有很高的特异性，不结合于hMYADM以外的其 它蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可获得精确的检测结果。 并且，以所述的单克隆抗体为基础，可制备准确地检测hMYADM的试剂盒。
[0040] 本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术来制备（见Kohler等，Nature256 ;495， 1975 ;Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6:511,1976 ;Kohler 等，Eur. J. Immunol. 6:292,1976; Hammerling 等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., 1981)。本发明的单克隆抗体的一种杂交瘤的制备方法是：
[0041] ⑴小鼠免疫：选择适龄的小鼠，以抗原肽对小鼠进行免疫；
[0042] (2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长 状态用于细胞融合；
[0043] (3)细胞融合：以BALB/C小鼠脾细胞作为饲养细胞。将⑴中备好的小鼠处死， 制备免疫脾细胞悬液。收集（2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以 聚乙二醇（PEG)介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至培养板，适当条件培养；
[0044] (4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在选择性培养基中培养。在细胞集落长到 大小合适时，吸取培养液上清做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
[0045] (5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的 细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫吸 附实验（ELISA)，鉴定阳性克隆。可以重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到 100%。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定；
[0046] (6)小鼠腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前10天，给BALB/C小鼠腹腔注射液体石 蜡0. 5ml/只，然后接种阳性杂交瘤细胞I. OX IO6/只，10天后收集腹水后离心，测定抗体效 价，并纯化单克隆抗体；
[0047] (7)单克隆抗体的纯化：经 Affi-Gel protein A-agarose 亲和柱（Bio-Rad)纯化 腹水上清中的单克隆抗体。
[0048] 在获得了所述杂交瘤的情况下，可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增 所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。作为一种实施方式，所述的单克隆抗 体可以由下列制备方法制备：（1)提供佐剂预处理的小鼠；（2)在小鼠腹腔内接种所述的杂 交瘤细胞并分泌单克隆抗体；（3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式， 从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G 预装层析柱纯化，获得高纯度的抗hMYADM单克隆抗体。
[0049] 本发明的单克隆抗体还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人 员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克 隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。
[0050] 检测试剂盒
[0051] 在获得了本发明的抗hMYADM单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏 地检测样品中hMYADM蛋白及其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。包括定 性检测和定量检测方法。较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方 法鉴定人髓系相关分化标志蛋白的存在情况；较佳地，所述的定量检测包括：通过流式细 胞方法对人髓系相关分化标志蛋白表达的强度或阳性细胞率进行定量，或通过双抗体夹心 ELISA法对人髓系相关分化标志蛋白表达的强度进行定量。
[0052] 本发明提供了一种用于检测样品中是否存在hMYADM的检测试剂盒，该试剂盒中 含有一种或多种本发明的抗hMYADM单克隆抗体。
[0053] 所述试剂盒中除了含有本发明的抗hMYADM单克隆抗体以外，还可以包含其它检 测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形 式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗hMYADM单克隆抗体 作为与hMYADM特异性结合的试剂。
[0054] 本领域技术人员公知，ELISA对目标抗原检测的灵敏度、特异性主要取决于其中所 应用的抗体的性质和质量。而本发明人意外地发现，本发明的基于hMYADM氨基酸序列第 127-144位免疫动物而制备的DS6抗体与基于hMYADM氨基酸序列第187-204位制备的FMl 抗体可以构成抗体组合，良好地应用于双夹心ELISA法检测hMYADM。双抗夹心法常规的做 法是将包被抗体固定于载体，然后包被抗体与抗原反应，洗涤后再与带标记的检测抗体反 应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或 两个以上表位的抗原的检测。相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为 优良，因而测定时只需很少的样品量。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确 度、特异性及稳定性上更具有优势。
[0055] 作为本发明的更优选方式，以DS6抗体作为包被抗体，以FMl作为检测抗体，其检 测灵敏度更为理想。
[0056] 所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限 制，只要其能够与包被抗体相偶联（连接）即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板 (如96孔板）、或微球等。
[0057] 如本文所用，所述的"标记物"是指用于确定待检测样品中hMYADM的存在与否以 及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可 以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记 物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示 待检测样品中hMYADM蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可 直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体 上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记 物可以选自：辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化酶、P -D-半乳糖苷 酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0058] 当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从 而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的"与标记 物相对应的底物"是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与hMYADM发生结合的识 别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺（OPD)、四甲基联苯胺（TMB)、 ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP);等等。本 领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。
[0059] 为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个hMYADM蛋白的标 准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。
[0060] 此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方 法。
[0061] 本发明的优点在于提供了一种抗hMYADM的单克隆抗体，尚未见文献报道。制备方 法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对细胞和组织中 hMYADM分子表达情况的定性和定量等，可应用于检测该新基因在不同组织和细胞，以及在 骨髓干细胞向髓系分化不同阶段的表达特征，更方便地应用于该新基因的生物学和免疫学 功能研究。
[0062] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0063] 实施例1、抗hMYADM的单克隆抗体的制备方法
[0064] (I) hMYADM 表位选择
[0065] 针对hMYADM全长氨基酸序列（GenBank登录号AY037147)，将序列分为不同的短肽 片段，片段长度10_30aa，用于免疫小鼠，筛选免疫原性良好、免疫后可获得对hMYADM抗原 具有良好特异性和敏感性的短肽。
[0066] (2)小鼠的免疫及骨髓瘤细胞的培养
[0067] BALB/C小鼠购自上海必凯公司。首次免疫：将交联BSA的hMYADM短肽片段（上海 吉尔生化公司合成）以弗氏完全佐剂（购自Sigma公司）乳化，第2、3次以弗氏不完全佐 剂（购自Sigma公司）乳化，每鼠0. 2ml (含100 ii g多肽），背部皮内多点注射，每周一次。 初次免疫3周后加强免疫2次,每次间隔2周。末次免疫3天后,取脾细胞。
[0068] 把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以DMEM培养基培养传代，在含5%C02饱 和湿度的37°C孵箱中培养。融合前1天传代以保证融合时进入对数生长期。
[0069] (3)细胞融合
[0070] 将hMYADM肽段免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0做细胞融合。取对 数生长的骨髓瘤细胞SP2/0, IOOOrpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计 数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养 液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按I : 10或1 : 5的比例混合在一起，在50ml塑料 离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影 响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合：30秒内加入预 热的lml45%PEG (购自默克公司，分子量4000)含5%DMS0,边加边搅拌；作用90秒钟，若冬 天室温较低时可延长至120秒钟；加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别 加入lml，2ml，3ml，4ml，5ml和IOml ;离心，800rpm，6分钟；弃上清,先用6ml左右20%小牛 血清RPMI1640轻轻混悬。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，IOml -块96孔 板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100 ill /孔，然后将培养板置于37°C、 5%C02的孵箱内培养。
[0071] (4)杂交瘤细胞的筛选
[0072] 应用HAT选择培养液筛选融合细胞，每隔3天换1/2培养液一次，12天后改用HT 培养液，约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时，吸取培养液上清，做ELISA，筛选 阳性克隆。采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤。主要步骤：①0. OlM pH9. 6碳酸盐缓冲 液稀释hMYADM重组蛋白（全长322氨基酸），liig/ml，0. Iml/孔包板，4°C过夜；②0. OlM pH7. 4PBS-Tween20洗板三次；③10%FCS0. OlM pH7. 2的PBS封闭30s ;④同上洗板；⑤加入 杂交瘤培养上清，〇. Iml/孔，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，37°C Xlhr ;⑥洗板； ⑦加羊抗小鼠 IgG/HRP，0. Iml/孔，37°C Xlhr ;⑧洗板；⑨加入底物（TMB)37°C X30s ;⑩2M H2SCM终止反应；490nm测定其OD值，以P/N > 2. 1为阳性。
[0073] (5)杂交瘤细胞的克隆化
[0074] 杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体阳性的杂交瘤孔细胞作适 当增殖后，准确计数细胞。用完全1640培养基稀释成10个/ml的细胞悬液接种到已有饲 养细胞的96孔培养液中，每孔0. lml，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体， 选择抗体滴度较高，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养，直至单克隆孔抗体 检测阳性率为100%。
[0075] (6)诱生腹水
[0076] 在接种杂交瘤细胞前10天，给BALB/C小鼠腹腔注射液体石蜡每只0. 5ml，然后每 只接种I. ox IO6阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。
[0077] (7)单克隆抗体的纯化和类别鉴定
[0078] 经 Affi-Gel protein A-agarose 亲和柱（Bio-Rad Laboratories)纯化得到单克 隆抗体。用标准抗Ig类与亚类血清系统作夹心ELISA来分析所得到单克隆抗体的表型。
[0079] (8) hMYADM肽段筛选结果
[0080] hMYADM上不同位置的短肽免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，最终获得许多株单抗。进一 步验证结果发现，应用来自于hMYADM氨基酸序列第127-144位上的一段18肽氨基酸序列 FLSHGRSRDHAIAATFFS (SEQ ID NO: 1)，具有良好的免疫原性，可获得高效价的单抗。
[0081] 本发明人还筛选到来自于hMYADM氨基酸序列第187-204位上的一段18肽氨基酸 序列正4?130?1￥〇即?41^(3￡〇10勵:2)，具有良好的免疫原性，可获得高效价的单抗。
[0082] 而根据hMYADM其它位置设计的肽段，存在免疫原性不理想的问题，或存在后续得 不得高特异性和高敏感性抗体的问题。
[0083] 实施例2、用该单克隆抗体进行hMYADM分子的鉴定
[0084] 应用抗hMYADM单克隆抗体鉴定细胞表面表达的hMYADM分子（定性检测），鉴定方 法：
[0085] 1、间接免疫荧光
[0086] 主要步骤：
[0087] ① HL-60细胞（购自ATCC)以RPMI1640培养基悬浮于96孔板，IOOul/孔，37°C， 4h ;②0. OlM PH7. 2PBS洗板三次；③培养上清IOOul/孔，37°C X I. 5h，同时设阴性对照 (isotype control);④同上洗板；⑤加入单克隆抗体100 ii I (I :100)，37°C，Ih (孵育1小 时）；⑥洗板三次；⑦IOOul PBS悬浮，加入Alexa Fluo594(绿色突光)或0regon_green488 (红色突光）标记的羊抗鼠二抗（购自Invitrogen公司）3 ii 1，纯小牛血清100 ii 1，室温避 光孵育1小时；⑧同上洗三次，400 ill PBS悬浮；⑨荧光镜检。
[0088] HL-60细胞为hMYADM表达阳性细胞，如上间接免疫处理后，根据在荧光显微镜下 见到的细胞表面的荧光情况，可选择到敏感性和特异性好的单克隆抗体。应用18肽氨基酸 序列FLSHGRSRDHAIAATFFS免疫获得的部分单抗间接免疫细胞后的镜检结果参见图1A，应 用单克隆抗体DS6免疫的细胞表面上荧光显著，而其它单抗如EFl、PCDl等则效果则不理 想。因此，单克隆抗体DS6对于hMYADM抗原具有良好的敏感性和特异性，经鉴定其表型为 IgGl，kappa。
[0089] 应用18肽氨基酸序列IFAFISDPNLYQHQPALE免疫获得的部分单抗间接免疫细胞 后的镜检结果参见图1B，应用单克隆抗体FMl免疫的细胞表面上荧光显著，而其它单抗如 LK1、FB6等则效果则不理想。因此，FMAl对于hMYADM抗原具有良好的敏感性和特异性，经 鉴定其表型为IgGl, kappa。
[0090] 2>Western Blotting
[0091] HL-60细胞的裂解物用该单克隆抗体DS6进行Western Blotting检测，在相应位 置呈现目的条带，表明检测到hMYADM分子的表达。
[0092] 具体步骤：
[0093] (I) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0094] 方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》（科学出版社1998)。采用10% 分离胶和5%浓缩胶，电泳条件为电压100V，电泳完毕后进行考马斯亮兰染色。
[0095] (2)电转移
[0096] 方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》（科学出版社1998)。用电转 移方式将其转移至PVDF膜上。
[0097] (3)免疫印迹
[0098] 5%脱脂奶粉4°C封闭过夜后，用本发明制备的单抗作为一抗，室温下孵育2小时或 4°C反应过夜，用TST (TBS加入0. 5%tween)洗涤3次，每次10min，再用TBS洗涤3次，每次 10min。以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG作为二抗，室温反应2h，用上述方法洗涤后用 ECL作用Imin后，利用化学发光成像仪成像。
[0099] 实施例3、用该单克隆抗体进行细胞表面hMYADM分子的定量
[0100] 用流式细胞仪（FACS)方法检测U937细胞（购自ATCC)表面表达hMYADM分子的强 度：收集培养的细胞用预冷的PBS (含2%FCS)洗涤3次（1000g/5min/4°C )，弃上清，细胞打 匀后每管加入2-5X IO5个细胞，加入本发明制备的部分单克隆抗体（FLSHGRSRDHAIAATFFS 免疫获得）作为一抗，同型Ig为阴性对照抗体。试管置冰上，暗处反应30min，用PBS洗 涤细胞3遍，离心弃上清，打匀后用FITC标记的羊抗鼠 IgG孵育30min，将细胞沉淀重悬于 250 ill的PBS中，在流式细胞仪（FACS cal ibur，BD公司）上检测，Cel IQuest软件分析，可 得到细胞表面表达hMYADM分子的荧光强度和阳性细胞率，结果见图2A，图中的荧光强度表 示hMYADM的表达量。由结果可见，单克隆抗体DS6可良好地实现hMYADM抗体定量，定量结 果与公知的U937细胞表面hMYADM分子的表达强度相符，而其它单克隆抗体如EFl和PCDl 则检测效果不理想，存在假阴性。
[0101] 同上述步骤，应用本发明制备的部分单克隆抗体（IFAFISDPNLYQHQPALE免疫获 得）作为一抗，同型Ig为阴性对照抗体进行hMYADM抗体定量，结果见图2B。由结果可见， 单克隆抗体FMl可良好地实现hMYADM抗体定量，定量结果与公知的U937细胞表面hMYADM 分子的表达强度相符，而其它单克隆抗体如LKl和FB6则检测效果不理想，存在假阴性。
[0102] 实施例4、可溶性hMYADM分子检测试剂盒的制备
[0103] 本实施例中，联合应用DS6单抗和FMl单抗检测体液中可溶性或游离状态的 hMYADM分子的存在及其相对水平。
[0104] (1)单克隆抗体的生物素（Biotin)标记
[0105] 用碳酸盐缓冲液（0. 01MCBS，pH9. 3)将纯化的单抗（FMAl和DS6)的浓度调整为 200ug/ml，4°C透析过夜。然后，移入Eppendof管，并加入浓度为lmg/ml的生物素40ul，避 光震荡4小时，再置于0.01M PBS(pH7. 2)中4°C透析72h后，分装并于-20°C保存备用。
[0106] (2)生物素标记的单抗的鉴定
[0107] 将HL60细胞用PBS洗涤后，分装于小试管中（5X105/管）。分别加入2株生物 素标记的单抗FMl和DS6,4°C反应45min。充分洗涤后加入荧光素标记的链酶亲和素 (streptavidin-PE)，再于4°C反应45分钟得到生物素标记的单克隆抗体FMAl和DS6,流式 检测结果表明，单抗FMAl和DS6均能良好地标记生物素，如图3。
[0108] (3)包被抗体的选择检测方法的建立
[0109] 用碳酸盐缓冲液将本发明的两株单抗的浓度调整为2ug/ml，分别作为包被抗体 用于包被0.01%多聚赖氨酸预处理（总剂量：l〇KGy、剂量率为lGy/min)的酶标检测板 (IOOul/孔），4°C保温过夜。用4%BSA4°C封闭过夜并洗涤后，分别加入商品化的rhHMYADM/ Fc 重组蛋白（购自 Abcam 公司）（lng/ml、500ng/ml 和 lug/ml，IOOul/ 孔），37°C 反应 2h。 洗涤后，分别加入对应的生物素标记的单抗（lOOul/孔），其中，当DS6作为包被抗体时， 以FMl作为检测抗体；反之，当FMl作为包被抗体时，以DS6作为检测抗体，37°C反应 lh。充分洗漆后，再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（streptavidin-HRP) (I :1000 ; IOOul/孔），37°C反应30min。洗涤后，加入临时配制的底物四甲基联苯胺（TMB，100ul)， 37°C反应15min后，用20mol/L H2S04(50ul/孔）终止酶促反应，于酶标仪上测定OD45tl值。
[0110] 结果表明，FMl和DS6无论作为包被体还是作为检测抗体，均适用于制备本发明 的试剂盒，但使用DS6作为包被抗体并使用FMl作为检测的标记抗体，将会进一步提高检 测的灵敏度。
[0111] 因此，上述的DS6抗体和FMAl抗体可以良好地实现hMYADM抗原的夹心ELISA检 测。
[0112] (4)可溶性hMYADM(sHMYADM)线性工作曲线的绘制
[0113] 用单克隆抗体DS6包被酶联免疫吸附检测版，4 °C保存过夜。PBS (含 0. 01%Tween-20)洗涤后，用4%BSA封闭过夜。洗涤后加入标准品rhHMYADM/Fc重组蛋白的梯 度稀释液（1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、66. 67ng/ml、22. 22ng/ml、7. 41ng/ml、2. 47ng/ ml、0. 82ng/ml和0. 27ng/ml，lOOul/孔）。分析并记录结果后，以shMYADM/Fc的浓度为横 坐标，OD15tl值为纵坐标，绘制shMYADM的线性工作曲线。
[0114] 结果显示，在0. 82-600ng/ml抗原浓度区间内，抗原浓度与吸光度OD45tl之间具有 良好的线性关系，如图4。
[0115] (5)检测方法的稳定性分析
[0116] 用单克隆抗体DS6包被多孔板，并于4°C下保存0、7、14、21天。重复上述夹心 ELISA法检测，分析工作曲线中的部分测定点（663. 7ng/ml、22. 2ng/ml、7. 4ng/ml、2. 5ng/ ml)数值的变异。
[0117] 结果表明，用上述方法建立的可溶性HMYADM分子检测试剂盒具有较好的灵敏性 和稳定性，完全适合于广泛推广使用。
[0118] 实施例5、可溶性hMYADM分子检测试剂盒的应用
[0119] 携带人hMYADM基因的人U937细胞膜裂解液中可溶性hMYADM分子的检测。
[0120] (a)细胞裂解液的制备
[0121] 取I X IO7的U937细胞，PBS洗涤三次后弃尽上清，重悬于0. 5ml预冷的 RIPA (I X PBS，1%NP_40，0. 5%脱氧胆酸钠，0. 1%SDS)膜裂解液，向其中加入蛋白抑制剂 IOOul PMSF(10mg/ml，30ug/ml Aprotinin, 10Ommol/Na3VO4)并混勻。4°C条件下，用 Iml 针 筒轻轻吸放10次后，4°C冰箱静置30分钟。然后移入Eppendoff管中，再加入PMSF20ul，混 匀后于12000rpm离心10分钟。然后收集上清，于-80°C下保存备用。
[0122] (b)细胞裂解液中可溶性hMYADM含量的测定
[0123] 将上述方法制备的细胞膜裂解液倍比稀释后，用前述建立的双抗体夹心法（使用 DS6作为包被抗体，并使用FMl作为检测的标记抗体）分析裂解液中可溶性hMYADM分子的 含量。
[0124] 结果显示，U937细胞裂解液中shMYADM含量为5ng/ml。并且细胞膜裂解液中可溶 性hMYADM的浓度，随着膜裂解液稀释倍数的增加而降低。
[0125] 生物材料保藏
[0126] 本申请中，杂交瘤细胞株DS6已经保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉）， 保藏号为：CCTCC NO:C201333,保藏日为：2013年4月3日。
[0127] 本申请中，杂交瘤细胞株FMl已经保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武 汉），保藏号为：CCTCC NO:C201332,保藏日为：2013年4月3日。
[0128] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种分离的多肽，其特征在于，该多肽来源于人髓系相关分化标志蛋白，其氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示。
2. 权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于作为抗原，制备特异性检测人髓系 相关分化标志蛋白的单克隆抗体。
3. -种单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC N0:C201332的杂交瘤细胞株分泌的单克 隆抗体。
4. 权利要求3所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人髓系相关分化标志蛋 白的检测试剂盒。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的检测人髓系相关分化标志蛋白包括： (1)定性检测人髓系相关分化标志蛋白；或（2)定量检测人髓系相关分化标志蛋白； 较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定人髓系相关 分化标志蛋白的存在情况； 较佳地，所述的定量检测包括：通过流式细胞方法对人髓系相关分化标志蛋白表达的 强度或阳性细胞率进行定量，或通过双抗体夹心ELISA法对人髓系相关分化标志蛋白表达 的强度进行定量。
6. -种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC N0:C201332。
7. -种检测试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求3所述的单克隆抗体或权利要求6 所述的杂交瘤细胞株。
8. 如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：另一单克隆 抗体，该另一单克隆抗体是特异性抗人髓系相关分化标志蛋白的单克隆抗体，其由保藏号 为CCTCC N0:C201333的杂交瘤细胞株产生。
9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：固相载体；较佳 地，保藏号为CCTCC N0:C201333的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体包被于所述的固相载 体；较佳的，权利要求3所述的单克隆抗体还连接有标记物。
10. 如权利要求7-9任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括： 与标记物相对应的底物； 显色剂； 洗涤液；和/或 终止液。
【文档编号】G01N33/577GK104277095SQ201310288835
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】李楠, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学