骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明所述的骨髓间充质干细胞来源的神经细胞（mesenchymalstemcells-derivedneuroncells，mNCs）的具体应用，解决了传统上没有针对正己烷致周围性神经病进行有效治疗的药物的问题，为治疗该种神经病提出了新的思路和具体应用，它以患有正己烷致周围性神经病的大鼠作为实验对象，以步态评分，神经电生理（神经传导潜伏期、神经传导速度），脊髓和坐骨神经的砂罗铬花青染色、扫描电镜、髓鞘碱性蛋白和低分子量神经丝为检测指标，结果显示，mNCs作为治疗正己烷致周围性神经病的药物，对患病大鼠有显著的修复作用，它将在职业中毒致周围性神经病的治疗中发挥重要作用。
【专利说明】骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种神经细胞的具体应用，特别是一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用。
【背景技术】
[0002]慢性正己烷中毒患者的神经系统损伤(正己烷致周围性神经病)，是由正己烷的最终代谢产物和终毒物2，5-己二酮(HD)所引起。其病理特点为轴索的神经丝积聚和节段性肿胀，并继发节段性脱髓鞘改变，以长、粗纤维最为明显。许多学者从轴索骨架蛋白、能量代谢障碍以及NGF信号转导通路等方面，对正己烷中毒性周围神经病的发病机制进行了研究，但迄今尚未十分明了。目前慢性正己烧中毒患者的治疗，包括脱离接触、保证患者有足够营养、给予B族维生素、能量合剂、活血化瘀、通络补肾的中药、及辅以针灸、理疗、和四肢运动功能锻炼，尚无特效药物治疗。因此现在需要找到或开发出一种能够治疗正己烷致周围性神经病的药物。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够治疗正己烷致周围性神经病药物的相关应用，特别是骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用。
[0005]本发明同现有技术相比，具有如下优点:
本发明所述的骨髓间充质干细胞来源的神经细胞(mesenchymal stem cells-derivedneuron cells,mNCs)的具体应用，解决了传统上没有针对正己烷致周围性神经病进行有效治疗的药物的问题，为治疗该种神经病提出了新的思路和具体应用，它以患有正己烷致周围性神经病的大鼠作为实验对象，以步态评分，神经电生理(神经传导潜伏期、神经传导速度)，脊髓和坐骨神经的砂罗铬花青染色、扫描电镜、髓鞘碱性蛋白(MBP)和低分子量神经丝(低分子量神经丝)为检测指标，结果显示，mNCs作为治疗正己烷致周围性神经病的药物，对患病大鼠有显著的修复作用，它将在职业中毒致周围性神经病的治疗中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1骨髓间充质干细胞的生物学特性。
[0007]图2细胞免疫化学检测神经诱导细胞的NSE表达(X 100)。
[0008]图3 mNCs移植对大鼠行为能力的影响。
[0009]图4 mNCs移植对大鼠神经电生理的影响。
[0010]图5脊髓的砂罗铬花青染色(X200)。
[0011]图6坐骨神经的砂罗铬花青染色(X 200)。
[0012]图7脊髓横切面的扫描电镜检测。
[0013]图8坐骨神经横切面的扫描电镜检测。
[0014]图9 mNCs移植对髓鞘碱性蛋白mRNA表达的影响。
[0015]图10 mNCs移植对髓鞘碱性蛋白表达的影响。
[0016]图11 mNCs移植对低分子量神经丝mRNA表达的影响。
[0017]图12 mNCs移植对低分子量神经丝蛋白表达的影响。
【具体实施方式】
[0018]骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养:
大鼠脱白处死，75%乙醇浸没消毒，无菌剥离股骨及胫骨，去掉干骺端，使骨髓腔暴露，PBS反复冲洗，收集细胞过筛网并离心，用含10%血清的DMEM培养液重悬细胞并接种于培养皿中，在37 °C、CO2饱和湿度培养箱中培养，24h后换液。以后3d换液I次，待细胞达到809Γ90%融合时传代，利用差速贴壁法逐步纯化MSCs。取第3代生长状态良好的细胞，利用单克隆抗体⑶90、⑶45进行流式检测，以对MSCs进行鉴定。
[0019]骨髓间充质干细胞来源的神经细胞(mNCs)制备及鉴定:
MSCs生长密度达到60%时，换成诱导培养基(DMEM + 10% FBS + I μ mol/ L ATRA +20 ng/mL bFGF + 20 ng/mL EGF)，于37 °C、C02，饱和湿度静置培养，在诱导分化48 h、72h分别进行烯醇化酶(NSE)细胞免疫化学染色鉴定，NSE为神经元特异性标志物。
[0020]建立正己烷致周围神经病的大鼠模型:
轻度疾病模型-200 mg/kg 2，5-己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次,连续6周
重度疾病模型——400 mg/kg 2，5-己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次，连续6周建立正己烷致周围神经病模型的检测平台:
一般情况观察，包括发育情况、行动、皮毛、饮食、体重等。
[0021]神经电生理检测:大鼠乙醚麻醉，俯卧位放置于大鼠固定器内，暴露尾部。在尾部距离尾部起始点的3cm、10cm、15cm处分别标记为A、B、C点，A点放置刺激电极,B点及C点放置记录电极，记录AB间、AC间的神经传导潜伏期,按照公式MCV=Length BC/Latency BC(Length BC为BC两点间距离，Latency BC为BC两点间潜伏时间)计算神经传导速度。
[0022]脊髓和坐骨神经的砂罗铬花青染色:石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明，滴加砂罗铬花青染色20min，流水洗2min，滴加硫酸铁铵，至胶原纤维呈淡灰色，髓鞘呈清晰蓝色，流水冲洗5min，滴加荧光桃红复染数秒，稍水洗，常规脱水透明，中性树胶封片。
[0023]脊髓和坐骨神经的扫面电镜检测:大鼠麻醉、固定，固定液为2.5%多聚甲醛+2.0%戊二醛0.lmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.4)，固定完成后取脊髓和坐骨神经。迅速将脊髓和坐骨神经，置于上述灌注液中继续固定24h，1g /L锇酸固定lh，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在SOkV电压下用H-600型透射电镜观察并摄片。
[0024]脊髓和坐骨神经的髓鞘碱性蛋白检测:分别用real time PCR和Western blot检测髓鞘碱性蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表达。
[0025]脊髓和坐骨神经的低分子量神经丝检测:分别用real time PCR和Western blot检测低分子量神经丝的mRNA水平和蛋白水平的表达。
[0026]MSCs移植正己烷致周围神经病大鼠:
每只模型大鼠尾静脉移植IXlO6 MSCs0按建立正己烷致周围神经病模型检测平台的操作步骤进行检测。
[0027]结果
大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定:
原代细胞接种72h后，大部分细胞贴壁，1(Γ15天后细胞达到80°/Γ90%融合，进行传代。培养3代以后，细胞形态趋向均一，类似成纤维细胞样，呈束状或漩涡状有序排列(图W。取第3代细胞进行流式检测，表面分子⑶90和⑶45的阳性表达率分别为96.61%和0.40%(图1B、1C)。培养所得细胞为移植可用的MSCs。
[0028]图1A，第三代骨髓间充质干细胞，细胞形态均一，类似成纤维细胞样，呈束状或漩涡状有序排列；图1B，流式检测显示96.61%的细胞表达⑶90 ;图1C，流式检测显示0.40%的细胞表达⑶45。
[0029]mNCs制备及鉴定
细胞诱导2h即可见体积变小，形成双极或多极的细胞体，细胞质以细胞核为中心收缩，周围的胞质收缩形成细胞的突起，诱导48h时，染色可见(33.95±3.12)%细胞NSE阳性表达，诱导72h时，NSE阳性表达细胞增至(51.86±2.89)%，NSE阳性细胞间存在突触联系；未诱导对照组细胞保持长梭形和多角形，未见NSE阳性细胞出现(图2)。
[0030]图2A，未诱导细胞48h NSE染色阴性；图2B，细胞诱导48h NSE染色阳性；图2C，未诱导细胞72h NSE染色阴性；图2D，细胞诱导72h NSE染色阳性。
[0031]正己烷致周围神经病模型的建立:
对照组动物发育正常、行动迅速、毛色有光泽，实验过程中无步态异常。中毒大鼠模型摄食减少、毛色晦暗、行动迟缓甚至瘫痪、体重增长缓慢甚至下降。至染毒第5周，轻度中毒大鼠出现明显的以膝关节下降和拖尾为特征的运动异常，重度中毒大鼠后肢拖拉、完全无法站立、后掌上翻，步态评分均随染毒时间的延长而逐渐增高。对照组大鼠步态始终正常。
[0032]mNCs移植对正己烷致周围神经病的影响
行为能力观察mNCs移植后，轻度及重度模型大鼠的行为能力都得到明显改善(图3)。
[0033]图3A和图3D为正常对照大鼠，活动自如；图3B为轻度中毒大鼠，出现明显的以膝关节下降和拖A尾为特征的运动异常；图3C为轻度中毒大鼠移植mNCs后，行为能力明显改善，仅出现脚尖着地和后肢内收；图3E为重度中毒大鼠，出现后肢拖拉和完全无法站立，后掌上翻；图3F为重度中毒大鼠移植mNCs后，后掌上翻消失，后肢有外展，但可以撑地。
[0034]神经电生理检测:MSCs移植后，轻度、重度模型大鼠的神经传导潜伏期逐渐缩短，神经传导速度逐渐变快(图4A、4B)。mNCs移植能明显改善正己烷致周围神经病大鼠的神经电生理。
[0035]图4A，mNCs移植后，中毒大鼠的神经传导速度逐渐加快，恢复正常；图4B，mNCs移植后，中毒大鼠的神经传导潜伏期逐渐缩短，接近正常。
[0036]脊髓和坐骨神经的砂罗铬花青染色:中毒大鼠的脊髓和坐骨神经均出现明显的脱髓鞘和神经纤维排列紊乱，mNCs移植后脱髓鞘和神经纤维排列紊乱现象均得到明显改善(图5，图6)。
[0037]图5A，正常大鼠神经纤维排列规则切紧密；图5B，轻度中毒大鼠，神经纤维排列紊乱呈网状，部分区域出现脱髓鞘；图5C，轻度中毒大鼠移植mNCs，网状排列的神经纤维基本消失，呈有序排列；图邪，重度中毒大鼠，严重脱髓鞘，有空泡结构形成；图5E，重度中毒大鼠移植mNCs，脱髓鞘现象改善，空泡结构基本消失。
[0038]图6A，正常大鼠，轴索排列紧密；图6B，轻度中毒大鼠，轴索稀疏，轴索间缝隙变大；图6C，轻度中毒大鼠移植mNCs，轴索间隙缩小；图6D，重度中毒大鼠，轴索稀疏排列，轴索间有明显缝隙存在；图6E，重度中毒大鼠移植mNCs，轴索间隙明显缩小。
[0039]脊髓和坐骨神经的扫描电镜检测:mNCs移植后，中毒大鼠的脊髓脱髓鞘和脊髓分层增多现象明显改善，坐骨神经的髓鞘凹陷和神经丝密度不均匀现象基本消失(图7，图8)。
[0040]图7A，正常大鼠，髓鞘结构完整；图7B，轻度中毒大鼠，部分髓鞘向轴突凹陷，出现轻度脱髓鞘；图7C，轻度中毒大鼠移植mNCs，髓鞘凹陷部分恢复，脱髓鞘现象基本消失；图7D，重度中毒大鼠，严重脱髓鞘，髓鞘分层明显增多；图7E，重度中毒大鼠移植mNCs，脱髓鞘现象部分恢复，髓鞘分层减少。
[0041]图8A，正常大鼠，髓鞘结构完整；图8B，轻度中毒大鼠，部分髓鞘向轴突凹陷，轴突轻度萎缩；图8(:，轻度中毒大鼠移植mNCs，髓鞘凹陷基本恢复，轴突基本恢复正常；图80，重度中毒大鼠，髓鞘凹陷，轴突明显萎缩；图8E，重度中毒大鼠移植mNCs，髓鞘凹陷部分恢复，轴突基本恢复正常。
[0042]脊髓和坐骨神经的髓鞘碱性蛋白检测=Ptl是周围神经髓鞘上的一种主要结构蛋白，占组织蛋白总量的50%以上，在周围神经髓鞘组织中发挥了粘附、信号转导等重要作用。real time PCR和WB检测均显示，mNCs移植后中毒大鼠脊髓和坐骨神经中髓鞘碱性蛋白的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著恢复(图9，图10)。
[0043]图9A、图9B，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠脊髓髓鞘碱性蛋白mRNA表达的影响；图9C、图9D，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠坐骨神经髓鞘碱性蛋白mRNA表达的影响。
[0044]图9A、图9B，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠脊髓髓鞘碱性蛋白表达的影响；图9C、图9D，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠坐骨神经髓鞘碱性蛋白表达的影响。
[0045]脊髓和坐骨神经的低分子量神经丝检测:NF在维持神经细胞的形态和运动功能、维持轴突的空间构型及其正常的神经信号传导速度中发挥重要的作用。2，5-HD染毒干扰了NF正常的组装和去组装之间的平衡，干扰了动态池中的NF单体和静态池中的NF网状骨架之间的动态交换，故引起神经丝结构紊乱。mNCs移植后，低分子量神经丝水平得到明显恢复(图 11，图 12)。
[0046]图11A、图llB，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠脊髓低分子量神经丝mRNA表达的影响；图11C、图11D，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠坐骨神经低分子量神经丝mRNA表达的影响。
[0047]图12A、图12B，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠脊髓低分子量神经丝蛋白表达的影响；图12C、图12D，mNCs移植对轻度、重度中毒大鼠坐骨神经低分子量神经丝蛋白表达的影响。
[0048]综上所述，mNCs移植到正己烷致周围性神经病大鼠体内，能显著修复其受损神经组织的组织结构，改善神经电生理功能，并使其神经行为趋向正常。mNCs可作为治疗正己烷致周围性神经病的一种新方法。
【权利要求】
1.一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗正己烷致周围性神经病的药物的应用。
【文档编号】A61K35/28GK104161771SQ201410139690
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】朴丰源, 李双月, 王哲敏, 董伟, 陈若霖, 戚媛, 刘爽 申请人:大连医科大学